針對組織因子途徑抑制劑(tfpi)的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的分離的單克隆抗體和編碼其的分離的核酸分子。還提供了包含所述抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和通過施用所述抗體來治療凝結(jié)缺乏或缺陷的方法。還提供了生成所述抗體的方法。
【專利說明】針對組織因子途徑抑制劑(TFPI)的單克隆抗體
[00011本申請是基于申請日為2009年8月4日,優(yōu)先權(quán)日為2008年8月4日,申請?zhí)枮?200980134625.4,發(fā)明名稱為:"針對組織因子途徑抑制劑(TFPI)的單克隆抗體"的專利申 請的分案申請。
[0002] 序列表提交
[0003] 與本申請有關(guān)的序列表經(jīng)由EFS網(wǎng)以電子形式提交,并且在此通過提及而將其完 整收入說明書中。含有序列表的文本文件的名稱是MSB7329PCT_Sequence_Listing_ST25。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的分離的單克隆抗體及其片段和相關(guān) 發(fā)明。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 血液凝結(jié)(bIood coagulation)是血液形成穩(wěn)定的凝塊以使流血停止的過程。該 過程牽涉血液中循環(huán)的許多酶原和輔因子原(或"凝結(jié)因子")。那些酶原和輔因子原經(jīng)由序 貫地或同時將它們轉(zhuǎn)化成活化形式的數(shù)種途徑而相互作用。最后,所述過程導致在存在因 子Va、離子鈣、和血小板的情況中由激活的因子X(FXa)將凝血酶原激活為凝血酶。激活的凝 血酶繼而誘導血小板聚集,而且將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血纖蛋白,其然后被激活的因子XIII (FXII Ia)交聯(lián)以形成凝塊。
[0007] 可以通過兩種獨特的途徑來實施導致因子X激活的過程:接觸激活途徑(以前稱為 內(nèi)源性途徑)和組織因子途徑(以前稱為外源性途徑)。先前認為,凝結(jié)級聯(lián)由連接至共同途 徑的同等重要的兩種途徑組成?,F(xiàn)在知道用于啟動血液凝結(jié)的主要途徑是組織因子途徑。
[0008] 因子X可以被與激活的因子VII(FVIIa)聯(lián)合的組織因子(TF)激活。因子Vila和其 必需的輔因子TF的復合物是凝固(clotting)級聯(lián)的一種有力的引發(fā)劑。
[0009] 凝結(jié)的組織因子途徑受組織因子途徑抑制劑("TFPI")負控制。TFPI是FVIIa/TF復 合物的一種天然的、F X a依賴性反饋抑制劑。它是多價K u n i t z型絲氨酸蛋白酶抑制劑的成 員。在生理學上,TFPI結(jié)合激活的因子X(FXa)以形成異二聚體復合物,其隨后與FVIIa/TF復 合物相互作用以抑制其活性,如此關(guān)閉凝結(jié)的組織因子途徑。原則上,阻斷TFPI活性可以恢 復FXa和FVIIa/TF活性,如此延長組織因子途徑作用的持續(xù)時間,而且放大FXa的生成,所述 FXa是血友病A和B的共同缺陷。
[0010] 實際上,一些初步實驗證據(jù)已經(jīng)指明,通過針對TFPI的抗體來阻斷TFPI活性使延 長的凝結(jié)時間正?;蛘呖s短流血時間。例如,Nordfang等顯示了血友病血漿的延長的稀 釋凝血酶原時間(dilute prothrombin time)在用針對TFPI的抗體處理血衆(zhòng)后正常化 (Thromb. Haemost,1991,66(4): 464-467)。類似地,Erhardtsen等顯不了通過抗TFPI抗體顯 著縮短血友病A兔模型中的流血時間(Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995,6: 388-394)。這些研究提示了抗TFPI抗體對TFPI的抑制對于治療血友病A或B可以是有用的。 在這些研究中僅使用多克隆抗TFPI抗體。
[0011]使用雜交瘤技術(shù),制備并鑒定針對重組人TFPI(rhTFPI)的單克隆抗體。參見Yang 等,Chin.Med. J.,1998,111(8): 718-721。測試了單克隆抗體對稀釋凝血酶原時間(PT)和激 活部分促凝血酶原激酶時間(APTT)的影響。實驗顯示了抗TFPI單克隆抗體縮短因子IX缺乏 型血漿的稀釋促凝血酶原激酶凝結(jié)時間。提示了組織因子途徑不僅在生理學凝結(jié)而且在血 友病出血中發(fā)揮重要作用(Yang等,Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997,22(4) :297-300)。 [0012] Kjalke等的美國專利號7,015,194披露了包含F(xiàn)VIIa和TFPI抑制劑(包括多克隆或 單克隆抗體或其片段)的組合物,用于治療或預防流血事件或凝結(jié)處理。還披露了此類組合 物在正常哺乳動物血漿中減少凝結(jié)時間的用途。進一步提示了,所披露的FVIIa和TFPI抑制 劑的組合物中可以包含因子VIII或其變體。沒有提示FVIII或因子IX與TFPI單克隆抗體的 組合。
[0013]在治療血友病外,還已經(jīng)提示了可以使用TFPI抑制劑(包括多克隆或多克隆抗體) 來進行癌癥治療(參見Hung的美國專利號5,902,582)。
[0014]因而,需要對TFPI特異性的抗體來治療血液學疾病和癌癥。
[0015] -般而言,已經(jīng)使用遺傳工程來創(chuàng)建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗體以生 成用于人疾病的治療性抗體。顯示了鼠單克隆抗體作為治療劑具有有限的用途,這是由于 短的血清半衰期、不能觸發(fā)人效應器功能、和人抗小鼠抗體的生成。Brekke和Sandl ie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2,53,52-62 (2003年I月)。已經(jīng)顯示了嵌合抗體引起人抗嵌合抗體應答。 人源化抗體進一步使抗體的小鼠構(gòu)件最小化。然而,完全人抗體完全避免與鼠元件有關(guān)的 免疫原性。如此,需要開發(fā)完全人抗體以避免與其它形式的遺傳工程化單克隆抗體有關(guān)的 免疫原性。特別地,若使用具有鼠構(gòu)件或鼠起源的抗體,則諸如用抗TFPI單克隆抗體的血友 病治療會需要的長期(chronic)預防處理具有形成對該治療的免疫應答的高風險,這是由 于需要的頻繁劑量給藥和長的療法持續(xù)時間。例如,血友病A的抗體療法可以每周需要劑量 給藥,持續(xù)患者一生。這對免疫系統(tǒng)會是連續(xù)的考驗。如此,需要用于血友病和相關(guān)的遺傳 性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的抗體療法的完全人抗體。
[0016] 已經(jīng)經(jīng)由由Koehler和Milstein在"Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity/'Nature 256,495-497(1975)中所描 述的雜交瘤技術(shù)來生成治療性抗體。也可以在原核生物和真核生物中重組生成完全人抗 體。治療性抗體優(yōu)選抗體在宿主細胞中的重組生成而不是雜交瘤生成。重組生成具有如下 的優(yōu)點,即較大的產(chǎn)物一致性、可能地較高的生產(chǎn)水平、和受控制的制備,其使動物衍生的 蛋白質(zhì)的存在最小化或消除動物衍生的蛋白質(zhì)的存在。出于這些原因,想要具有重組生成 的單克隆抗TFPI抗體。
[0017] 發(fā)明概述
[0018]提供了針對人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的單克隆抗體。進一步提供了編碼其的 分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和治療遺傳性和獲得性凝 結(jié)缺乏或缺陷諸如血友病A和B的方法。還提供了通過對有所需要的患者施用抗TFPI單克隆 抗體來縮短流血時間的方法。還提供了用于生成依照本發(fā)明的結(jié)合人TFPI的單克隆抗體的 方法。
[0019] 具體的,本發(fā)明涉及以下項:
[0020] 1. -種分離的單克隆抗體,其結(jié)合人組織因子途徑抑制劑,其中所述抗體包含 CDR3,所述CDR3包含選自SEQ ID NO :388-430的氨基酸序列。
[0021] 2.項1的分離的抗體,其中所述抗體進一步包含(a)CDRl,其包含選自SEQ ID NO: 302-344的氨基酸序列,(b)CDR2,其包含選自SEQ ID N0:345-387的氨基酸序列,或(c)包含 選自SEQ ID NO :302-344的氨基酸序列的CDRl和包含選自SEQ ID NO :345-387的氨基酸序 列的⑶R2兩者。
[0022] 3. -種分離的單克隆抗體,其結(jié)合人組織因子途徑抑制劑,其中所述抗體包含 CDR3,所述CDR3包含選自SEQ ID NO :259-301的氨基酸序列。
[0023] 4.項3的分離的抗體,其中所述抗體進一步包含(a)CDRl,其包含選自SEQ ID NO: 173-215的氨基酸序列,(b)CDR2,其包含選自SEQ ID N0:216-258的氨基酸序列,或(c)包含 選自SEQ ID NO :173-215的氨基酸序列的CDRl和包含選自SEQ ID NO :216-258的氨基酸序 列的⑶R2兩者。
[0024] 5.項1的抗體,其中所述抗體進一步包含⑶R3,所述⑶R3包含選自SEQID NO:259- 301的氨基酸序列。
[0025] 6.項5的抗體,其中所述抗體進一步包含(a)CDRl,其包含選自SEQ IDN0:302-344 的氨基酸序列,(b)CDR2,其包含選自SEQ ID N0:345-387的氨基酸序列,(c)CDRl,其包含選 自SEQIDN0:173-215的氨基酸序列,和(d)CDR2,其包含選自SEQIDN0:216-258的氨基酸 序列。
[0026] 7.項1的抗體,其中所述抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū),其包含:
[0027] (a)包含含有SEQ ID NO: 173、216和259的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:302、345和388的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0028] (b)包含含有SEQ ID NO: 174、217和260的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:303、346和389的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0029] (c)包含含有SEQ ID NO: 175、218和261的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:304、347和390的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0030] (d)包含含有SEQ ID NO: 176、219和262的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:305、348和391的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0031] (e)包含含有SEQ ID NO: 177、220和263的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:306、349和392的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0032] (f)包含含有SEQ ID NO: 178、221和264的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:307、350和393的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0033] (g)包含含有SEQ ID NO: 179、222和265的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:308、351和394的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0034] (h)包含含有SEQ ID NO: 180、223和266的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:309、352和395的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0035] (i)包含含有SEQ ID NO: 181、224和267的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:310、353和396的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0036] (j)包含含有SEQ ID NO: 182、225和268的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:311、354和397的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0037] (k)包含含有SEQ ID NO: 183、226和269的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:312、355和398的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0038] (1)包含含有SEQ ID NO: 184、227和270的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:313、356和399的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0039] (m)包含含有SEQ ID NO: 185、228和271的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:314、357和400的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0040] (η)包含含有SEQ ID NO: 186、229和272的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:315、358和401的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0041 ] (〇)包含含有SEQ ID NO: 187、230和273的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:316、359和402的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0042] (p)包含含有SEQ ID NO: 188、231和274的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:317、360和403的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0043] (q)包含含有SEQ ID NO: 189、232和275的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:318、361和404的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0044] (r)包含含有SEQ ID NO: 190、233和276的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:319、362和405的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0045] (s)包含含有SEQ ID NO: 191、234和277的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:320、363和406的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0046] (t)包含含有SEQ ID NO: 192、235和278的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:321、364和407的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0047] (u)包含含有SEQ ID NO: 193、236和279的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:322、365和408的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0048] (V)包含含有SEQ ID NO: 194、237和280的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:323、366和409的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0049] (w)包含含有SEQ ID NO: 195、238和281的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:324、367和410的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0050] (X)包含含有SEQ ID NO: 196、239和282的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:325、368和411的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[00511 (y)包含含有SEQ ID NO: 197、240和283的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:326、369和412的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0052] (z)包含含有SEQ ID NO: 198、241和284的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:327、370和413的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0053] (aa)包含含有SEQ ID NO: 199、242和285的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:328、371和414的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0054] (bb)包含含有SEQ ID NO: 200、243和286的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:329、372和415的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0055] (cc)包含含有SEQ ID NO: 201、244和287的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:330、373和416的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0056] (dd)包含含有SEQ ID NO: 202、245和288的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:331、374和417的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0057] (ee)包含含有SEQ ID NO: 203、246和289的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:332、375和418的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0058] (ff)包含含有SEQ ID NO: 204、247和290的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:333、376和419的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0059] (gg)包含含有SEQ ID NO: 205、248和291的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:334、377和420的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0060] (hh)包含含有SEQ ID NO: 206、249和292的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0061 ] (ii)包含含有SEQ ID N0:207、250和293的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:336、379和422的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0062] (jj)包含含有SEQ ID NO: 208、251和294的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:337、380和423的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0063] (kk)包含含有SEQ ID NO: 209、252和295的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:338、381和424的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0064] (11)包含含有SEQ ID N0:210、253和296的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:339、382和425的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0065] (mm)包含含有SEQ ID NO: 211、254和297的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:340、383和426的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0066] (nn)包含含有SEQ ID NO: 212、255和298的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:341、384和427的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0067] (〇〇)包含含有SEQ ID NO: 213、256和299的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:342、385和428的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0068] (pp)包含含有SEQ ID NO: 214、257和300的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:343、386和429的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0069] (qq)包含含有SEQ ID NO: 215、258和301的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:344、387和430的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0070] 或
[0071] (rr)包含含有SEQ ID NO: 194、237和280的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
[0072] 8.項1的單克隆抗體,其包含:
[0073] (a)具有多肽序列SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:4的重鏈 可變區(qū);
[0074] (b)具有多肽序列SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:8的重鏈 可變區(qū);
[0075] (c)具有多肽序列SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 12的重 鏈可變區(qū);
[0076] (d)具有多肽序列SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 16的重 鏈可變區(qū);
[0077] (e)具有多肽序列SEQ ID NO: 18的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:20的重 鏈可變區(qū);
[0078] (f)具有多肽序列SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:24的重 鏈可變區(qū);
[0079] (g)具有多肽序列SEQ ID NO:26的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:28的重 鏈可變區(qū);
[0080] (h)具有多肽序列SEQ ID NO:30的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:32的重 鏈可變區(qū);
[0081 ] (i)具有多肽序列SEQ ID NO:34的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:36的重 鏈可變區(qū);
[0082] (j)具有多肽序列SEQ ID NO:38的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:40的重 鏈可變區(qū);
[0083] (k)具有多肽序列SEQ ID NO:42的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:44的重 鏈可變區(qū);
[0084] (1)具有多肽序列SEQ ID NO:46的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:48的重 鏈可變區(qū);
[0085] (m)具有多肽序列SEQ ID NO:50的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:52的重 鏈可變區(qū);
[0086] (η)具有多肽序列SEQ ID NO:54的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:56的重 鏈可變區(qū);
[0087] (〇)具有多肽序列SEQ ID N0:58的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID N0:60的重 鏈可變區(qū);
[0088] (p)具有多肽序列SEQ ID N0:62的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID N0:64的重 鏈可變區(qū);
[0089] (q)具有多肽序列SEQ ID NO:66的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:68的重 鏈可變區(qū);
[0090] (r)具有多肽序列SEQ ID NO:70的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:72的重 鏈可變區(qū);
[0091] (S)具有多肽序列SEQ ID NO:74的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:76的重 鏈可變區(qū);
[0092] (t)具有多肽序列SEQ ID N0:78的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID N0:80的重 鏈可變區(qū);
[0093] (u)具有多肽序列SEQ ID NO:82的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:84的重 鏈可變區(qū);
[0094] (V)具有多肽序列SEQ ID NO:86的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:88的重 鏈可變區(qū);
[0095] (w)具有多肽序列SEQ ID NO:90的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:92的重 鏈可變區(qū);
[0096] (X)具有多肽序列SEQ ID NO:94的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:96的重 鏈可變區(qū);
[0097] (y)具有多肽序列SEQ ID N0:98的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 100的 重鏈可變區(qū);
[0098] (z)具有多肽序列SEQ ID NO: 102的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 104的 重鏈可變區(qū);
[0099] (aa)具有多肽序列SEQ ID NO: 106的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 108 的重鏈可變區(qū);
[0100] (bb)具有多肽序列SEQ ID NO: 110的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 112 的重鏈可變區(qū);
[0101] (CC)具有多肽序列SEQ ID NO: 114的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 116 的重鏈可變區(qū);
[0102] (dd)具有多肽序列SEQ ID NO: 118的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 120 的重鏈可變區(qū);
[0103] (ee)具有多肽序列SEQ ID NO: 122的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 124 的重鏈可變區(qū);
[0104] (ff)具有多肽序列SEQ ID NO: 126的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 128 的重鏈可變區(qū);
[0105] (gg)具有多肽序列SEQ ID NO: 130的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 132 的重鏈可變區(qū);
[0106] (hh)具有多肽序列SEQ ID NO: 134的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 136 的重鏈可變區(qū);
[0107] (ii)具有多肽序列SEQ ID NO: 138的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 140 的重鏈可變區(qū);
[0108] (jj)具有多肽序列SEQ ID NO: 142的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 144 的重鏈可變區(qū);
[0109] (kk)具有多肽序列SEQ ID NO: 146的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 148 的重鏈可變區(qū);
[0110] (11)具有多肽序列SEQ ID NO: 150的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 152 的重鏈可變區(qū);
[0111] (mm)具有多肽序列SEQ ID NO: 154的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 156 的重鏈可變區(qū);
[0112] (nn)具有多肽序列SEQ ID NO: 158的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 160 的重鏈可變區(qū);
[0113] (〇〇)具有多肽序列SEQ ID NO: 162的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 164 的重鏈可變區(qū);
[0114] (pp)具有多肽序列SEQ ID NO: 166的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 168 的重鏈可變區(qū);
[0115] (qq)具有多肽序列SEQ ID NO: 170的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 172 的重鏈可變區(qū);或
[0116] (rr)具有多肽序列SEQ ID N0:86的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 136的 重鏈可變區(qū)。
[0117] 9. -種分離的單克隆抗體,其結(jié)合人組織因子途徑抑制劑,其中所述抗體包含人 重鏈可變區(qū),其包含與選自下組的氨基酸序列具有至少96%同一性的氨基酸序列:SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:76、SEQ ID N0:80、SEQ ID N0:84、SEQ ID N0:88、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:104、SEQ ID N0:108、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:120、 SEQ ID N0:124、SEQ ID N0:128、SEQ ID N0:132、SEQ ID N0:136、SEQ ID N0:140、SEQ ID N0:144、SEQ ID N0:148、SEQ ID N0:152、SEQ ID N0:156、SEQ ID N0:160、SEQ ID N0:164、 SEQ ID NO: 168、和SEQ ID NO: 172中所列出的氨基酸序列。
[0118] 10. -種分離的單克隆抗體,其結(jié)合人組織因子途徑抑制劑,其中所述抗體包含人 輕鏈可變區(qū),其包含與選自下組的氨基酸序列具有至少97%同一性的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:74、SEQ ID N0:78、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:86、SEQ ID N0:90、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:98、SEQ ID N0:102、SEQ ID N0:106、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:114、SEQ ID N0:118、 SEQ ID N0:122、SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:130、SEQ ID N0:134、SEQ ID N0:138、SEQ ID N0:142、SEQ ID N0:146、SEQ ID N0:150、SEQ ID N0:154、SEQ ID N0:158、SEQ ID N0:162、 SEQ ID NO: 166、和SEQ ID NO: 170中所列出的氨基酸序列。
[0119] 11.項1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10的抗體,其中所述抗體選自下組:1 861、1862、 IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、分泌性 IgA、IgD、和 IgE 抗體。
[0120] 12.項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的抗體,其中在存在所述抗體的情況中的血液 凝固時間是縮短的,如通過稀釋凝血酶原時間所測量的。
[0121] 13.項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的抗體,其是抗體片段或單鏈抗體。
[0122] 14.藥物組合物,其包含治療有效量的項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的單 克隆抗體和藥學可接受載體。
[0123] 15.-種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法,包括對患者施用治療 有效量的項14的藥物組合物。
[0124] 16.項15的方法,其中所述方法治療血友病A或B。
[0125] 17. -種用于縮短流血時間的方法,包括對患者施用治療有效量的項14的藥物組 合物。
[0126] 18.-種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏的方法,包括施用(a)第一量的結(jié)合人 組織因子途徑抑制劑的單克隆抗體和(b)第二量的因子VIII或因子IX,其中所述第一和第 二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的,且進一步其中因子VII不是共施用的。
[0127] 19.藥物組合物,其包含治療有效量的(a)項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的 單克隆抗體和(b)因子VIII或因子IX的組合;其中所述組合物不含因子VII。
[0128] 20.-種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法,包括對有所需要的患 者施用治療有效量的項19的藥物組合物。
[0129] 21. -種用于縮短流血時間的方法,包括對患者施用治療有效量的項19的藥物組 合物。
[0130] 22.-種針對人組織因子途徑抑制劑的分離的完全人單克隆抗體。
[0131 ] 23.藥物組合物,其包含治療有效量的項22的單克隆抗體和藥學可接受載體。
[0132] 24.-種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法,包括對患者施用治療 有效量的項23的藥物組合物。
[0133] 25.項24的方法,進一步包括施用因子VIII或因子IX。
[0134] 26.-種分離的核酸分子,其編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體,其中所述抗 體包含CDR3,所述CDR3包含選自SEQ ID NO :388-430的氨基酸序列。
[0135] 27.-種分離的核酸分子,其編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體,其中所述抗 體包含CDR3,所述CDR3包含選自SEQ ID NO :259-301的氨基酸序列。
[0136] 28.-種用于生成結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的完全人單克隆抗體的方法,包括:
[0137] (i)將編碼所述完全人單克隆抗體的核苷酸序列轉(zhuǎn)染入宿主細胞中,并
[0138] (ii)培養(yǎng)所述宿主細胞以表達所述單克隆抗體。
[0139] 29.項28的方法,其中所述單克隆抗體包含⑶R3,所述⑶R3包含選自SEQ ID NO: 388-430的氨基酸序列。
[0140] 30.-種用于生成結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的單克隆抗體的方法,包括:
[0141] (i)將編碼所述單克隆抗體的核苷酸序列轉(zhuǎn)染入宿主細胞中,并
[0142] (ii)培養(yǎng)所述宿主細胞以表達所述單克隆抗體,
[0143] 其中所述單克隆抗體包含CDR3,所述CDR3包含選自SEQ ID NO :259-301的氨基酸 序列。
[0144] 31.項29的方法,其中所述單克隆抗體包含含有選自SEQ ID N0:388-430的氨基酸 序列的重鏈CDR3和含有選自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列的輕鏈CDR3。
[0145] 32.-種針對人組織因子途徑抑制劑的Kunitz域2的分離的完全人單克隆抗體。
[0146] 33.藥物組合物,其包含治療有效量的項32的單克隆抗體和藥學可接受載體。
[0147] 34.-種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法,包括對患者施用治療 有效量的項33的藥物組合物。
[0148] 35.項34的方法,進一步包括施用因子VII、因子VIII或因子IX。
[0149] 附圖簡述
[0150] 圖1:通過淘選和篩選選擇的Fab的代表性例子對人TFPI( "h-TFPI")和小鼠 TFPI ("m-TFPI")的結(jié)合活性。測試針對雌二醇-BSA( "EsB")的對照Fab和通過淘選TFPI選擇的12 種Fab( 1-4和6-13) 3軸表示ELISA結(jié)果的熒光單位。
[0151] 圖2:通過淘選和篩選人抗體文庫獲得的4種代表性抗TFPI抗體(4B7: TP-4B7、2A8: TP-2A8、2G6: TP-2G6、2G7: TP-2G7)的劑量依賴性體外功能活性,如通過其縮短的dPT所顯示 的。實驗包括摻入TFPI消減的血漿中的0.5ug/mL mTFPI。
[0152] 圖3:抗TFPI Fab,即Fab-2A8(來自TP-2A8)的體外功能活性,如ROTEM測定法中所 測試的。
[0153] 圖4:克隆TP-2G6("2G6")轉(zhuǎn)化為IgG后對人TFPI和小鼠 TFPI的結(jié)合活性。Δ :IgG- 2G6結(jié)合小鼠 TFPI; □ : IgG-2G6結(jié)合人TFPI; ▲:對照IgG結(jié)合小鼠 TFPI; :對照IgG結(jié)合人 IgG0
[0154] 圖5:抗TFPI抗體TP-2A8( "2A8")、TP-3G1( "3G1")、和TP-3C2( "3C2")縮短血友病A 小鼠中的全血凝固時間,如ROTEM測定法中所測試的。每個點代表一個單獨的血友病A小鼠。
[0155] 圖6:抗TFPI單克隆抗體TP-2A10(SEQ ID N0:18)、TP-2B1(SEQ ID N0:22)、TP-2A2 (SEQ ID N0:2)、TP-2G2(SEQ ID N0:66)、TP-2A5.1(SEQ ID N0:6)、TP-3A3(SEQ ID NO: 98)、TP-2A8(SEQ ID N0:14)、TP-2B8(SEQ ID N0:34)、TP-2G7(SEQ ID N0:82)、TP-4H8(SEQ ID N0:170)、TP-2G4(SEQ ID N0:70)、TP-3F2(SEQ ID N0:134)、TP-2A6(SEQ ID N0:10)、 TP-3A2(SEQ ID N0:94)、TP-2C1(SEQ ID N0:42)、TP-3E1(SEQ ID N0:126)、TP-3F1(SEQ ID N0:130)、TP-3D3(SEQIDN0:122)、TP-4A7(SEQIDN0:150)、TP-4G8(SEQIDN0:166)、TP-2B3(SEQ ID N0:26)、TP-2F9(SEQ ID N0:62)、TP-2G5(SEQ ID N0:74)、TP-2G6(SEQ ID NO: 78)、TP-2H10(SEQ ID N0:90)、TP-2B9(SEQ ID N0:38)、TP-2C7(SEQ ID N0:46)、TP-3G3 (SEQ ID N0:142)、TP-3C2(SEQ ID N0:114)、TP-3B4(SEQ ID N0:110)、TP-2E5(SEQ ID NO: 58)、TP-3C3(SEQ ID N0:118)、TP-3G1(SEQ ID N0:138)、TP-2D7(SEQ ID N0:50)、TP-4B7 (SEQ ID N0:158)、TP-2E3(SEQ ID N0:54)、TP-2G9(SEQ ID N0:86)、TP-3C1(SEQ ID NO: 86)、TP-3A4(SEQ ID N0:102)、TP-2B4(SEQ ID N0:30)、TP-3H2(SEQ ID N0:146)、TP-4A9 (SEQIDN0:154)、TP-4E8(SEQIDN0:162)、和TP-3B3(SEQIDN0:106)的可變輕鏈之間的 氨基酸序列比對。
[0156] 圖 7:抗 TFPI 單克隆抗體TP-2A10(SEQIDN0:20)、TP-3B3(SEQIDN0:108)、TP-2G4(SEQ ID N0:72)、TP-2A5.1(SEQ ID N0:8)、TP-4A9(SEQ ID N0:156)、TP-2A8(SEQ ID N0:16)、TP-2B3(SEQ ID N0:28)、TP-2B9(SEQID N0:40)、TP-2H10(SEQ ID N0:92)、TP-3B4 (SEQ ID N0:112)、TP-2C7(SEQ ID N0:48)、TP-2E3(SEQ ID N0:56)、TP-3C3(SEQ ID NO: 120)、TP-2G5(SEQ ID N0:76)、TP-4B7(SEQ ID N0:160)、TP-2G6(SEQ ID N0:80)、TP-3C2 (SEQ ID N0:116)、TP-2D7(SEQ ID N0:52)、TP-3G1(SEQ ID N0:140)、TP-2E5(SEQ ID NO: 60)、TP-2B8(SEQ ID N0:36)、TP-3F1(SEQ ID N0:132)、TP-3A3(SEQ ID N0:100)、TP-4E8 (SEQ ID N0:164)、TP-4A7(SEQ ID N0:152)、TP-4H8(SEQ ID N0:172)、TP-2A6(SEQ ID NO: 12)、TP-2C1(SEQ ID N0:44)、TP-3G3(SEQ ID N0:144)、TP-2B1(SEQ ID N0:24)、TP-2G7 (SEQ ID N0:84)、TP-3H2(SEQ ID N0:148)、TP-2A2(SEQ ID N0:4)、TP-3E1(SEQ ID NO: 128)、TP-2G2(SEQ ID N0:68)、TP-3D3(SEQ ID N0:124)、TP-2G9(SEQ ID N0:88)、TP-2B4 (SEQ ID N0:32)、TP-3A2(SEQ ID N0:96)、TP-2F9(SEQ ID N0:64)、TP-3A4(SEQ ID NO: 104)、TP-3C1(SEQIDN0:136)、TP-3F2(SEQIDN0:136)、和TP-4G8(SEQIDN0:168)的可 變重鏈之間的氨基酸序列比對。
[0157] 圖8:顯示對用(1)抗TFPI抗體TP-2A8( "2A8")、(2)2A8和重組因子VIII、(3)小鼠 IgG、和(4)重組因子VIII處理的小鼠進行尾靜脈橫斷后24小時里的存活率的圖。
[0158] 圖9:顯示用抗TFPI抗體TP-2A8( "2A8")、因子Vila、和2A8和因子Vila的組合處理 的小鼠的凝固時間和凝塊形成時間測定法的圖。
[0159] 圖10:顯示與單獨的FVI11抑制劑相比用FVI11抑制劑及抗TFPI抗體TP-2A8 ("2A8")和抗TFPI抗體TP-4B7( "4B7")處理的正常人血液的凝固時間的圖。
[0160]發(fā)明詳述
[0161] 定義
[0162] 如本文中所使用的,術(shù)語"組織因子途徑抑制劑"或"TFPI"指由細胞天然表達的人 TFPI的任何變體、同等型和物種同系物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的抗體 對TFPI的結(jié)合減少血液凝固時間。
[0163] 如本文中所使用的,"抗體"指整個抗體及其任何抗原結(jié)合片段(8卩"抗原結(jié)合部 分")或單鏈。該術(shù)語包括天然存在的或由正常的免疫球蛋白基因片段重組過程形成的全長 免疫球蛋白分子(例如IgG抗體),或免疫球蛋白分子中保留特異性結(jié)合活性的免疫學活性 部分諸如抗體片段。不管結(jié)構(gòu),抗體片段與由全長抗體識別的相同抗原結(jié)合。例如,抗TFPI 單克隆抗體片段結(jié)合TFPI的表位??贵w的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段執(zhí)行??贵w 的術(shù)語"抗原結(jié)合部分"內(nèi)涵蓋的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段,即一種由V l、Vh、Cl和Ch1 域構(gòu)成的單價片段;(ii)F(ab')2片段,即一種包含由鉸鏈區(qū)處的二硫化物橋連接的兩個 Fab片段的二價片段;(iii)Fd片段,其由Vh和(^域構(gòu)成;(iv)Fv片段,其由抗體的單條臂的 Vl和Vh域構(gòu)成,(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546),其由Vh域構(gòu)成;和(vi)分 離的互補決定區(qū)(CDR)。此外,雖然Fv片段的兩個域,即Vl和Vh是由不同基因編碼的,但是可 以使用重組方法通過合成的接頭來連接它們,所述合成的接頭使它們能夠作為單條蛋白質(zhì) 鏈生成,其中Vl和Vh區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(ScFv);參見例如Bird等(1988) Science 242:423-426;及Huston等(1988)Proc · Natl .Acad · Sci · USA 85:5879-5883)。此類 單鏈抗體也意圖涵蓋在抗體的術(shù)語"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常 規(guī)技術(shù)來獲得這些抗體片段,并以與完整的抗體相同的方式來對片段篩選功效。
[0164] 如本文中所使用的,術(shù)語"抑制結(jié)合"和"阻斷結(jié)合"(例如,指抑制/阻斷TFPI配體 對TFPI的結(jié)合)可互換使用,涵蓋部分和完全抑制或阻斷兩者。抑制和阻斷還意圖包括與不 與抗TFPI抗體接觸的TFPI相比在與抗TFPI抗體接觸時TFPI對生理學底物的結(jié)合親和力的 任何可測量降低,例如阻斷TFPI與因子Xa的相互作用或者阻斷TFPI-因子Xa復合物與組織 因子、因子Vila或組織因子/因子Vila的復合物的相互作用達至少約10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%。
[0165] 如本文中所使用的,術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"指單一分子組成的 抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因而, 術(shù)語"人單克隆抗體"指具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)的展示單一 結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘 基(例如通過體外隨機或定點誘變或者通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。
[0166] 如本文中所使用的,"分離的抗體"意圖指基本上沒有具有不同抗原性特異性的其 它抗體的抗體(例如結(jié)合TFPI的分離的抗體基本上沒有結(jié)合與TFPI不同的抗原的抗體)。然 而,結(jié)合人TFPI的表位、同等型或變體的分離的抗體可以具有與其它相關(guān)抗原(例如來自其 它物種的(例如TFPI物種同系物))的交叉反應性。此外,分離的抗體可以基本上沒有其它細 胞材料和/或化學物。
[0167] 如本文中所使用的,"特異性結(jié)合"指抗體對預定抗原的結(jié)合。典型地,抗體以至少 約IO5M-1的親和力結(jié)合,而且以比其結(jié)合與預定抗原或緊密相關(guān)抗原不同的無關(guān)抗原(例如 BSA、酪蛋白)的親和力高(例如大至少兩倍)的親和力結(jié)合預定抗原。短語"識別抗原的抗 體"和"對抗原特異性的抗體"在本文中與術(shù)語"特異性結(jié)合抗原的抗體"可互換使用。
[0168] 如本文中所使用的,關(guān)于IgG抗體的術(shù)語"高親和力"指至少約ΙΟ7]^1、在一些實施 方案中至少約IO 8M'在一些實施方案中至少約IO9M'IO1t3M'IO11IT i或更大,例如多至 IO13M-1或更大的結(jié)合親和力。然而,對于其它抗體同種型,"高親和力"結(jié)合可以有所變化。 例如,IgM同種型的"高親和力"結(jié)合指至少約1.0 x IO7IT1的結(jié)合親和力。如本文中所使用 的,"同種型"指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM或IgGl)。
[0169] "互補決定區(qū)"或"CDR"指抗體分子的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)內(nèi)形成與結(jié)合的抗 原的三維結(jié)構(gòu)互補的N端抗原結(jié)合表面的三個高變區(qū)之一。從重鏈或輕鏈的N端出發(fā),這些 互補決定區(qū)分別表示為"CDR1"、"⑶R2"和"⑶R3"。⑶R牽涉抗原-抗體結(jié)合,而且⑶R3包含對 于抗原-抗體結(jié)合特異性的獨特區(qū)域。因此,抗原結(jié)合位點可以包括6個CDR,其包含來自各 個重鏈和輕鏈V區(qū)的⑶R區(qū)。
[0170] 如本文中所使用的,"保守取代"指牽涉用一種或多種氨基酸取代具有相似生物化 學特性的氨基酸且不導致多肽的生物學或生物化學功能損失的多肽修飾。"保守氨基酸取 代"指用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基的。本領(lǐng)域中已經(jīng)限定了具有相似側(cè) 鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性 偵_(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲 氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯 氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta_分支的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、和 芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。涵蓋的是,本發(fā)明的抗體可 以具有保守的氨基酸取代,而且仍保留活性。
[0171 ] 對于核酸和多肽,術(shù)語"實質(zhì)的同源性"(substantial homology)指明在最佳比對 和比較時兩個核酸或兩個多肽或其指定序列在至少約80%的核苷酸或氨基酸,通常至少約 85%,優(yōu)選地約90%、91%、92%、93%、94%、或95%,更優(yōu)選地至少約96%、97%、98%、 99 %、99.1 %、99.2 %、99.3 %、99.4 %、或99.5 %的核苷酸或氨基酸中是相同的,具有適當 的核苷酸或氨基酸插入或缺失?;蛘撸瑓^(qū)段會在選擇性雜交條件下與該鏈的互補物雜交時 存在核酸的實質(zhì)同源性。本發(fā)明包括與本文中所列舉的特定核酸序列和氨基酸序列具有實 質(zhì)同源性的核酸序列和多肽序列。
[0172] 兩個序列間的百分比同一性是序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(8卩,%同源性 =相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)X 1〇〇),其考慮缺口的數(shù)目和每個缺口的長度,它們需要被引 入以進行兩個序列的最佳比對??梢允褂脭?shù)學算法(諸如不限于VectorNTI?( Invitrogen Corp. ,Carlsbad,CA)的AlignX?模塊)來實現(xiàn)兩個序列間的序列比較和百分比同一"性測定。 對于Al ignX?,多重比對的缺省參數(shù)是:缺口開放罰分:10;缺口延伸罰分:0.05;缺口分開罰 分范圍:8;比對延遲的%同一性:40。(進一步的詳情參見http : //www. invitrogen · com/ site/us/en/home/LINNEA-OnIine-Guides/LINNEA-C ommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-s oftware-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html)。
[0173] 可以使用CLUSTALW計算機程序(Thompson等,Nucleic Acids Research, 1994,2 (22) :4673-4680)來測定用于測定詢問序列(本發(fā)明的序列)與主題序列之間的最好總體匹 配的另一種方法(也稱為全局序列比對),所述CLUSTALW計算機程序基于Higgins等 (Computer Applications in the Biosciences(CABIOS),1992,8(2) :189-191)的算法。在 序列比對中,詢問和主題序列都是DNA序列。所述全局序列比對的結(jié)果按百分比同一性計。 DNA序列的CLUSTALW比對中經(jīng)由成對比對來計算百分比同一性所使用的優(yōu)選參數(shù)是:矩陣 = IUB,k-元組=1,頂部對角線的數(shù)目=5,缺口罰分=3,缺口開放罰分=10,缺口延伸罰分 =0.1。對于多重比對,優(yōu)選下列CLUSTALW參數(shù):缺口開放罰分=10,缺口延伸參數(shù)=0.0 5; 缺口分開罰分范圍=8;比對延遲的%同一"性=40。
[0174] 核酸可以存在于全部細胞中、細胞溶胞物中,或者以部分純化的或基本上純的形 式存在。核酸在純化得離開與其在天然環(huán)境中正常相關(guān)的其它細胞成分時是"分離的"或 "給予基本上純的"。為了分離核酸,可以使用標準的技術(shù)諸如下列各項:堿/SDS處理、CsCl 顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域中公知的其它技術(shù)。
[0175] 單克隆抗體
[0176] 通過針對人TFPI淘選并篩選人抗體文庫鑒定出44種TFPI結(jié)合抗體。對每種單克隆 抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)測序,并鑒定它們的CDR區(qū)。表1中匯總了與每種單克隆抗 體的這些區(qū)域?qū)男蛄袠俗R符數(shù)字("SEQ ID N0")。
[0177] 表1。每種TFPI結(jié)合單克隆抗體的重鏈可變區(qū)("VH")和輕鏈可變區(qū)("VL")的序列 標識符數(shù)字("SEQ ID N0")的匯總。還提供了每種重鏈和輕鏈的⑶R區(qū)("⑶R1"、"⑶R2"、和 "001?3")的序列標識符數(shù)字(^.4. :核酸序列4.4.:氨基酸序列。
[0181] 在一個實施方案中,提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗 體,其中所述抗體包含⑶R3,所述⑶R3包含選自SEQ ID N0:388-430的氨基酸序列。這些 CDR3是從淘選和篩選過程中鑒定的抗體的重鏈鑒定的。在又一個實施方案中,此抗體進一 步包含(a)CDRl,其包含選自SEQ ID N0:302-344的氨基酸序列,(b)CDR2,其包含選自SEQ ID N0:345-387的氨基酸序列,或(c)包含選自SEQ ID N0:302-344的氨基酸序列的CDRl和 包含選自SEQ ID NO :345-387的氨基酸序列的CDR2兩者。
[0182] 在另一個實施方案中,提供了共享來自淘選和篩選過程中鑒定的抗體的輕鏈之一 的CDR3的抗體。如此,本發(fā)明涉及一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體,其 中所述抗體包含⑶R3,所述⑶R3包含選自SEQ ID N0:259-301的氨基酸序列。在別的實施方 案中,所述抗體進一步包含(a)CDRl,其包含選自SEQ ID NO: 173-215的氨基酸序列,(b) CDR2,其包含選自SEQIDN0:216-258的氨基酸序列,或(c)包含選自SEQIDN0:173-215的 氨基酸序列的CDRl和包含選自SEQ ID NO:216-258的氨基酸序列的CDR2兩者。
[0183] 在另一個實施方案中,抗體包含來自通過篩選和淘選鑒定的抗體的重鏈的⑶R3和 來自輕鏈的CDR3。如此,提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體,其中所述抗體包含 含有選自SEQ ID NO :388-430的氨基酸序列的CDR3和含有選自SEQ ID NO :259-301的氨基 酸序列的⑶R3。在又一個實施方案中,所述抗體進一步包含(a)CDRl,其包含選自SEQ ID N0:302-344的氨基酸序列,(b)CDR2,其包含選自SEQ ID N0:345-387的氨基酸序列,(c) CDRl,其包含選自SEQ ID NO: 173-215的氨基酸序列,和/或(d)CDR2,其包含選自SEQ ID NO: 216-258的氨基酸序列。
[0184] 在其它具體的實施方案中,所述抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū),其包含:
[0185] (a)包含含有SEQ ID NO: 173、216和259的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:302、345和388的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0186] (b)包含含有SEQ ID NO: 174、217和260的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:303、346和389的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0187] (c)包含含有SEQ ID NO: 175、218和261的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:304、347和390的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0188] (d)包含含有SEQ ID NO: 176、219和262的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:305、348和391的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0189] (e)包含含有SEQ ID NO: 177、220和263的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:306、349和392的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0190] (f)包含含有SEQ ID NO: 178、221和264的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:307、350和393的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0191] (g)包含含有SEQ ID NO: 179、222和265的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:308、351和394的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0192] (h)包含含有SEQ ID NO: 180、223和266的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:309、352和395的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0193] (i)包含含有SEQ ID NO: 181、224和267的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:310、353和396的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0194] (j)包含含有SEQ ID NO: 182、225和268的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:311、354和397的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0195] (k)包含含有SEQ ID NO: 183、226和269的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:312、355和398的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0196] (1)包含含有SEQ ID NO: 184、227和270的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:313、356和399的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0197] (m)包含含有SEQ ID NO: 185、228和271的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:314、357和400的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0198] (η)包含含有SEQ ID NO: 186、229和272的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:315、358和401的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0199] (〇)包含含有SEQ ID NO: 187、230和273的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:316、359和402的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0200] (P)包含含有SEQ ID NO: 188、231和274的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:317、360和403的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0201] (q)包含含有SEQ ID NO: 189、232和275的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:318、361和404的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0202] (r)包含含有SEQ ID NO: 190、233和276的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:319、362和405的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0203] (s)包含含有SEQ ID NO: 191、234和277的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:320、363和406的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0204] (t)包含含有SEQ ID NO: 192、235和278的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:321、364和407的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0205] (u)包含含有SEQ ID NO: 193、236和279的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:322、365和408的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0206] (V)包含含有SEQ ID NO: 194、237和280的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:323、366和409的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0207] (w)包含含有SEQ ID NO: 195、238和281的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:324、367和410的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0208] (X)包含含有SEQ ID NO: 196、239和282的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:325、368和411的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0209] (y)包含含有SEQ ID NO: 197、240和283的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:326、369和412的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0210] (z)包含含有SEQ ID NO: 198、241和284的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:327、370和413的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0211] (aa)包含含有SEQ ID NO: 199、242和285的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:328、371和414的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0212] (bb)包含含有SEQ ID NO: 200、243和286的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:329、372和415的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0213] (cc)包含含有SEQ ID NO: 201、244和287的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:330、373和416的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0214] (dd)包含含有SEQ ID NO: 202、245和288的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:331、374和417的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0215] (ee)包含含有SEQ ID NO: 203、246和289的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:332、375和418的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0216] (ff)包含含有SEQ ID NO: 204、247和290的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:333、376和419的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0217] (gg)包含含有SEQ ID NO: 205、248和291的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:334、377和420的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0218] (hh)包含含有SEQ ID NO: 206、249和292的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0219] (ii)包含含有SEQ ID N0:207、250和293的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:336、379和422的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0220] (jj)包含含有SEQ ID NO: 208、251和294的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:337、380和423的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0221] (kk)包含含有SEQ ID NO: 209、252和295的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:338、381和424的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0222] (11)包含含有SEQ ID N0:210、253和296的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:339、382和425的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0223] (mm)包含含有SEQ ID NO: 211、254和297的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:340、383和426的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0224] (nn)包含含有SEQ ID NO: 212、255和298的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:341、384和427的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0225] (〇〇)包含含有SEQ ID NO: 213、256和299的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:342、385和428的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0226] (pp)包含含有SEQ ID NO: 214、257和300的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:343、386和429的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);
[0227] (qq)包含含有SEQ ID NO: 215、258和301的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:344、387和430的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);或
[0228] (rr)包含含有SEQ ID NO: 194、237和280的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含含有 SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
[0229] 在另一個實施方案中,本發(fā)明涉及抗體,其包含:
[0230] (a)具有多肽序列SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:4的重鏈 可變區(qū);
[0231] (b)具有多肽序列SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:8的重鏈 可變區(qū);
[0232] (c)具有多肽序列SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 12的重 鏈可變區(qū);
[0233] (d)具有多肽序列SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 16的重 鏈可變區(qū);
[0234] (e)具有多肽序列SEQ ID NO: 18的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:20的重 鏈可變區(qū);
[0235] (f)具有多肽序列SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:24的重 鏈可變區(qū);
[0236] (g)具有多肽序列SEQ ID NO:26的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:28的重 鏈可變區(qū);
[0237] (h)具有多肽序列SEQ ID NO:30的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:32的重 鏈可變區(qū);
[0238] (i)具有多肽序列SEQ ID NO:34的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:36的重 鏈可變區(qū);
[0239] (j)具有多肽序列SEQ ID NO:38的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:40的重 鏈可變區(qū);
[0240] (k)具有多肽序列SEQ ID NO:42的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:44的重 鏈可變區(qū);
[0241] (1)具有多肽序列SEQ ID NO:46的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:48的重 鏈可變區(qū);
[0242] (m)具有多肽序列SEQ ID NO:50的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:52的重 鏈可變區(qū);
[0243] (η)具有多肽序列SEQ ID NO:54的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:56的重 鏈可變區(qū);
[0244] (〇)具有多肽序列SEQ ID N0:58的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID N0:60的重 鏈可變區(qū);
[0245] (p)具有多肽序列SEQ ID N0:62的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID N0:64的重 鏈可變區(qū);
[0246] (q)具有多肽序列SEQ ID NO:66的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:68的重 鏈可變區(qū);
[0247] (r)具有多肽序列SEQ ID NO:70的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:72的重 鏈可變區(qū);
[0248] (s)具有多肽序列SEQ ID NO:74的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:76的重 鏈可變區(qū);
[0249] (t)具有多肽序列SEQ ID N0:78的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID N0:80的重 鏈可變區(qū);
[0250] (u)具有多肽序列SEQ ID NO:82的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:84的重 鏈可變區(qū);
[0251] (V)具有多肽序列SEQ ID NO:86的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:88的重 鏈可變區(qū);
[0252] (w)具有多肽序列SEQ ID NO:90的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:92的重 鏈可變區(qū);
[0253] (X)具有多肽序列SEQ ID NO:94的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO:96的重 鏈可變區(qū);
[0254] (y)具有多肽序列SEQ ID N0:98的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 100的 重鏈可變區(qū);
[0255] (z)具有多肽序列SEQ ID NO: 102的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 104的 重鏈可變區(qū);(aa)具有多肽序列SEQ ID NO: 106的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 108的重鏈可變區(qū);
[0256] (bb)具有多肽序列SEQ ID NO: 110的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 112 的重鏈可變區(qū);
[0257] (cc)具有多肽序列SEQ ID NO: 114的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 116 的重鏈可變區(qū);
[0258] (dd)具有多肽序列SEQ ID NO: 118的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 120 的重鏈可變區(qū);
[0259] (ee)具有多肽序列SEQ ID NO: 122的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 124 的重鏈可變區(qū);
[0260] (ff)具有多肽序列SEQ ID NO: 126的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 128 的重鏈可變區(qū);
[0261] (gg)具有多肽序列SEQ ID NO: 130的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 132 的重鏈可變區(qū);
[0262] (hh)具有多肽序列SEQ ID NO: 134的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 136 的重鏈可變區(qū);
[0263] (ii)具有多肽序列SEQ ID NO: 138的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 140 的重鏈可變區(qū);
[0264] (jj)具有多肽序列SEQ ID NO: 142的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 144 的重鏈可變區(qū);
[0265] (kk)具有多肽序列SEQ ID NO: 146的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 148 的重鏈可變區(qū);
[0266] (11)具有多肽序列SEQ ID NO: 150的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 152 的重鏈可變區(qū);
[0267] (mm)具有多肽序列SEQ ID NO: 154的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 156 的重鏈可變區(qū);
[0268] (nn)具有多肽序列SEQ ID NO: 158的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 160 的重鏈可變區(qū);
[0269] (〇〇)具有多肽序列SEQ ID NO: 162的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 164 的重鏈可變區(qū);
[0270] (pp)具有多肽序列SEQ ID NO: 166的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 168 的重鏈可變區(qū);
[0271] (qq)具有多肽序列SEQ ID NO: 170的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 172 的重鏈可變區(qū);或
[0272] (rr)具有多肽序列SEQ ID N0:86的輕鏈可變區(qū)和具有多肽序列SEQ ID NO: 136的 重鏈可變區(qū)。
[0273] 還提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體,其中所述抗體包 含人重鏈可變區(qū),其包含與選自下組的氨基酸序列具有至少89%、90%、91 %、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99·5%同一性的氨基酸序列:SEQIDN0:4、SEQID N0:8、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:76、SEQ ID N0:80、SEQ ID N0:84、SEQ ID N0:88、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:104、SEQ ID N0:108、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:120、SEQ ID NO: 124、SEQ ID N0:128、SEQ ID N0:132、SEQ ID N0:136、SEQ ID N0:140、SEQ ID N0:144、SEQ ID N0:148、SEQ ID N0:152、SEQ ID N0:156、SEQ ID N0:160、SEQ ID N0:164、SEQ ID NO: 168、和SEQ ID NO: 172中所列出的氨基酸序列。
[0274] 還提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體,其中所述抗體包 含人輕鏈可變區(qū),其包含與選自下組的氨基酸序列具有至少93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、或99·5%同一性的氨基酸序列 :SEQIDN0:2、SEQIDN0:6、SEQIDN0:10、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:74、SEQ ID N0:78、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:86、SEQ ID N0:90、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:98、SEQ ID N0:102、SEQ ID N0:106、 SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:114、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:122、SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:130、SEQ ID N0:134、SEQ ID N0:138、SEQ ID N0:142、SEQ ID N0:146、SEQ ID N0:150、 SEQIDN0:154、SEQIDN0:158、SEQIDN0:162、SEQIDN0:166、和SEQIDN0:170中所列 出的氨基酸序列。
[0275] 在依賴使用上文所討論的序列標識符的抗體描述外,也可以通過參照本文中所描 述的實驗中分離的Fab克隆來描述一些實施方案。在一些實施方案中,重組抗體包含下列克 隆的重鏈和 / 或輕鏈〇^3 4?-2厶2、了?-2厶5.1、了?-2厶6、了?-2厶8、了?-2厶10、了?-281、了卩-283、???-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、 TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、 TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8。在一些實施方案中,所述抗體可以進一步包含這些抗體 的⑶R2,而且仍進一步包含這些抗體的⑶Rl。在其它實施方案中,所述抗體可以進一步包含 ⑶R的任何組合。
[0276] 因而,在另一個實施方案中,提供了抗TFPI抗體,其包含:(1)人重鏈框架區(qū)、人重 鏈CDRl區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)、和人重鏈CDR3區(qū),其中所述人重鏈CDR3區(qū)是TP-2A2、TP-2A5.1、 TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2BI、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、 TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、 TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或 TP-4H8 的重鏈 CDR3;和(2)人輕鏈框架區(qū)、人輕鏈CDRl區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)、和人輕鏈CDR3區(qū),其中所述人輕 鏈CDR3 區(qū)是TP-2A2、TP-2A5 · I、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2BI、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、 TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、 TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的輕鏈CDR3,其中所述抗體結(jié)合TFPI??贵w可以進一步包含TP-2A2、 TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3EI、 TP-3FI、TP-3F2、TP-3GI、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。抗體可以進一步包含ΤΡ-2Α2、ΤΡ-2Α5·1、ΤΡ-2Α6、ΤΡ-2Α8、 TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、 TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、 TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或 TP-4H8 的重鏈 CDRl 和 / 或輕鏈 CDRl0
[0277] 上文所描述的經(jīng)工程化改造的抗體的⑶Rl、2、和/或3區(qū)可以包含精確的氨基酸序 列,如本文中所公開的了?-2厶2、了?-2厶5.1、了?-2厶6、了?-2厶8、了?-2厶10、了?-281、了卩-283、丁?-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、 TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、 TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或 TP-4H8 的那些。
[0278] 然而,普通熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會,了?-242、了?-245.1、了?-246、了?-248、了?-2六10、丁?-2BI、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、 TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、 TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的精確CDR序列的一些偏差可以是有可 能的,只要仍保留抗體有效結(jié)合TFPI的能力。因而,在另一個實施方案中,經(jīng)工程化改造的 抗體可以由一個或多個CDR構(gòu)成,所述CDR例如與了?-2六2、了?-2六5.1、了?-2六6、了?-2六8、丁卩-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、 TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或 TP-4H8 的一個或多個 CDR 是至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%相同的。
[0279] 抗體可以是多種種類的抗體之任一種的,諸如但不限于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 I gM、I gA I、I gA2、分泌性 I gA、I gD、和 I gE 抗體。
[0280] 在一個實施方案中,提供了一種針對人組織因子途徑抑制劑的分離的完全人單克 隆抗體。
[0281] 在另一個實施方案中,提供了針對人組織因子途徑抑制劑的Kunitz域2的分離的 完全人單克隆抗體。
[0282] 核酸
[0283] 還提供了編碼上文所描述的任何單克隆抗體的分離的核酸分子。
[0284] 制備針對TFPI的抗體的方法
[0285] 可以通過在宿主細胞中表達編碼依照本發(fā)明的實施方案的單克隆抗體的可變區(qū) 的核苷酸序列來重組生成單克隆抗體。借助于表達載體,可以將含有所述核苷酸序列的核 酸在適合于生成的宿主細胞中轉(zhuǎn)染并表達。因而,還提供了一種用于生成與人TFPI結(jié)合的 單克隆抗體的方法,包括:
[0286] (a)將編碼本發(fā)明的單克隆抗體的核酸分子轉(zhuǎn)染入宿主細胞中,
[0287] (b)培養(yǎng)所述宿主細胞以便在宿主細胞中表達所述單克隆抗體,和任選地
[0288] (c)分離并純化所生成的單克隆抗體,其中所述核酸分子包含編碼本發(fā)明的單克 隆抗體的核苷酸序列。
[0289] 在一個例子中,為了表達抗體或其抗體片段,將通過標準的分子生物學技術(shù)獲得 的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達載體中以使基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操 作連接。在此背景中,術(shù)語"可操作連接"意圖指將抗體基因連接入載體中以使載體內(nèi)的轉(zhuǎn) 錄和翻譯控制序列服務其預期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。表達載體和表達控制序 列選擇為與所使用的表達宿主細胞相容??梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入分開的 載體中,或者更典型地,將這兩種基因都插入同一表達載體中。通過標準的方法來將抗體基 因插入表達載體中(例如,連接抗體基因片段和載體上的互補的限制性位點,或者若沒有限 制性位點存在,則為平端連接)??梢允褂帽疚闹兴枋龅目贵w的輕鏈和重鏈可變區(qū)來創(chuàng)建 任何抗體同種型的全長抗體基因,其通過將它們插入已經(jīng)編碼想要的同種型的重鏈恒定區(qū) 和輕鏈恒定區(qū)的表達載體中以使Vh區(qū)段與載體內(nèi)的Ch區(qū)段可操作連接并使I區(qū)段與載體內(nèi) 的α區(qū)段可操作連接來實現(xiàn)。另外/或者,重組表達載體可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞分 泌的信號肽??梢詫⒖贵w鏈基因克隆入載體中以使信號肽以符合讀碼框方式與抗體鏈基因 的氨基末端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋 白質(zhì)的信號肽)。
[0290] 在抗體鏈編碼基因外,本發(fā)明的重組表達載體攜帶調(diào)節(jié)序列,其在宿主細胞中控 制抗體鏈基因的表達。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意圖包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如 多聚腺苷酸化信號),其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此類調(diào)節(jié)序列記載于例如Goeddel; Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif. (1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會的是,表達載體的設計(包括調(diào)節(jié)序列的選 擇)可以取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、想要的蛋白質(zhì)表達水平等因素。供哺乳動物 宿主細胞表達用的調(diào)節(jié)序列的例子包括指導哺乳動物細胞中高水平的蛋白質(zhì)表達的病毒 兀件,諸如自巨細胞病毒(CMV)、猿病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子 (AdMLP))和多瘤衍生的啟動子和/增強子。或者,可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列,諸如泛素啟動 子或β-珠蛋白啟動子。
[0291] 在抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外,重組表達載體可以攜帶別的序列,諸如調(diào)節(jié)載體在 宿主細胞中復制的序列(例如復制起點)和選擇標志基因。選擇標志基因促進已經(jīng)導入載體 的宿主細胞的選擇(參見例如均為Axel等的美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179, 017)。例如,典型地,選擇標志基因?qū)σ呀?jīng)導入載體的宿主細胞賦予對藥物諸如G418、潮霉 素或甲氨蝶呤的抗性。選擇標志基因的例子包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于通過甲 氨蝶呤選擇/擴增在dhfr-宿主細胞中使用)和neo基因(用于G418選擇)。
[0292] 對于輕鏈和重鏈的表達,通過標準的技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)染入宿 主細胞中。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式意圖涵蓋極其多種通常用于將外源DNA導入原核或真核 宿主細胞中的技術(shù),例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖苷轉(zhuǎn)染等。雖然理論上有可能在 原核或真核宿主細胞中表達本發(fā)明的抗體,但是抗體在真核細胞,且最優(yōu)選地哺乳動物宿 主細胞中的表達是最優(yōu)選的,這是因為此類真核細胞,且特別地哺乳動物細胞比原核細胞 更有可能裝配并分泌正確折疊且有免疫學活性的抗體。
[0293] 用于表達重組抗體的哺乳動物宿主細胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CH0細胞)(包 括與DHFR選擇標志(例如如記載于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol .Biol .159:601-621 的)一起使用的dhfr-CHO細胞,其記載于Urlaub和Chasin,( 1980)Proc · Natl · Acad · Sci · USA 77:4216-4220)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、HKBll細胞和SP2細胞。在將編碼抗體基因的重組 表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時,通過培養(yǎng)宿主細胞達足以容許抗體在宿主細胞中表 達或?qū)⒖贵w分泌入培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中的一段時間來生成抗體??梢允褂脴藴实牡鞍?質(zhì)純化方法諸如超濾、大小排阻層析、離子交換層析和離心來從培養(yǎng)基回收抗體。
[0294] 部分抗體序列表達完整抗體的用途
[0295] 抗體主要經(jīng)由位于6個重鏈和輕鏈⑶R的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。出于此原 因,CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外部的序列在各抗體間更加多種多樣。參見例如圖6和圖7,其 中分別鑒定出依照本發(fā)明的單克隆抗體的輕和重可變鏈中的⑶R區(qū)。因為⑶R序列負責大多 數(shù)抗體-抗原相互作用,所以有可能表達模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體,其通過 構(gòu)建包含嫁接到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列的來自特定天然存在抗體的CDR 序列的表達載體來實現(xiàn)(參見例如Riechmann,L.等,1998,他1:1^6332:323-327;]〇1168,?· 等,1986 ,Nature 321:522-525;及 Queen,C ·等,1989 ,Proc · Natl .Acad · Sci · U · S .A · 86 : 10029-10033)。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫獲得。這些種 系序列會與成熟的抗體基因序列不同,因為它們不會包括完全裝配的可變基因,其在B細胞 成熟過程中通過V(D)J連接而形成。獲得特定抗體的整個DNA序列以再創(chuàng)建具有與初始抗體 的那些結(jié)合特性相似的結(jié)合特性的完整重組抗體是不必要的(參見W099/45962)??缭舰荝 區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于此目的通常是足夠的。使用部分序列來確定哪些種系可變和 連接基因區(qū)段促成重組的抗體可變基因。然后,使用種系序列來填充可變區(qū)的缺少部分。重 鏈和輕鏈前導序列在蛋白質(zhì)成熟過程中被切割,而且不促成最終抗體的特性。出于此原因, 對表達構(gòu)建體使用相應的種系前導序列是必要的。為了添加缺少的序列,可以通過連接或 PCR擴增來組合克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸?;蛘撸麄€可變區(qū)可以合成為一套短 的、重疊的寡核苷酸,并通過PCR擴增來組合以創(chuàng)建完全合成的可變區(qū)克隆。此方法具有某 些優(yōu)點,諸如消除或包含特定的限制性位點,或優(yōu)化特定的密碼子。
[0296] 使用重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列來設計重疊的一組合成的寡核苷酸,以創(chuàng)建 與天然序列具有相同的氨基酸編碼能力的合成的V序列。合成的重鏈和kappa鏈序列可以以 三種方式與天然序列不同:中斷重復核苷酸堿基串以便于寡核苷酸合成和PCR擴增;依照 Kozak的規(guī)則(Kozak, 1991,J.Biol .Chem. 266:19867-19870)來摻入最佳的翻譯起始位點; 及在翻譯起始位點上游工程化改造 HindII I位點。
[0297] 對于重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者,近似地在相應的非編碼寡核苷酸的中點將經(jīng)優(yōu)化的 編碼和相應的非編碼鏈序列分解為30-50個核苷酸的部分。如此,對于每條鏈,可以將寡核 苷酸裝配成跨越150-400個核苷酸的區(qū)段的重疊雙鏈組。然后,使用集合作為模板來生成 150-400個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。典型地,會將單一可變區(qū)寡核苷酸組分解為兩個集合,對 它們進行分開擴增以生成兩種重疊的PCR產(chǎn)物。然后,通過PCR擴增來組合這些重疊的產(chǎn)物 以形成完整的可變區(qū)??赡苓€想要包括PCR擴增中的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段以生成 可以容易地克隆入表達載體構(gòu)建體中的片段。
[0298] 然后,將再構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、翻譯啟動、恒定區(qū)、3'非翻 譯的多聚腺苷酸化、和轉(zhuǎn)錄終止序列組合以形成表達載體構(gòu)建體??梢詫⒅劓満洼p鏈表達 構(gòu)建體組合入單一載體中,共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染、或分開轉(zhuǎn)染入宿主細胞中,然后將所述宿主 細胞融合以形成表達這兩條鏈的宿主細胞。
[0299] 如此,在另一個方面,使用人抗TFPI抗體(例如TP2A8、TP2G6、TP2G7、TP4B7等)的結(jié) 構(gòu)特征來創(chuàng)建保留結(jié)合TFPI的功能的結(jié)構(gòu)相關(guān)人抗TFPI抗體。更具體地,可以將本發(fā)明的 單克隆抗體的明確鑒定的重鏈和輕鏈區(qū)的一個或多個CDR與已知的人框架區(qū)和CDR重組組 合以創(chuàng)建本發(fā)明的別的、經(jīng)重組工程化改造的人抗TFPI抗體。
[0300]因而,在另一個實施方案中,提供了一種用于制備抗TFPI抗體的方法,包括:制備 如下的抗體,其包含(1)人重鏈框架區(qū)和人重鏈CDR,其中所述人重鏈CDR3包含選自SEQ ID NO: 388-430的氨基酸序列的氨基酸序列和/或(2)人輕鏈框架區(qū)和人輕鏈CDR,其中所述輕 鏈⑶R3包含選自SEQ ID N0:259-301的氨基酸序列的氨基酸序列;其中所述抗體保留結(jié)合 TFPI的能力。在其它實施方案中,使用本發(fā)明的其它CDR來實施所述方法。
[0301] 藥物組合物
[0302] 還提供了藥物組合物,其包含治療有效量的抗TFPI單克隆抗體和藥學可接受載 體。"藥學可接受載體"是可以添加至活性成分以幫助配制或穩(wěn)定制劑而不對患者引起顯著 不利的毒物學效果的物質(zhì)。此類載體的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,包括水、糖諸如麥芽 糖或鹿糖、清蛋白、鹽諸如氯化鈉等。其它載體記載于例如E .W. Mar tin的Remington's Pharmaceutical Sciences。此類組合物會含有治療有效量的至少一種抗TFPI單克隆抗體。
[0303] 藥學可接受載體包括無菌水溶液或分散體和和供即時制備無菌可注射溶液或分 散體用的無菌粉劑。對藥學活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域中已知的。優(yōu)選地,組合 物配制用于胃腸外注射。組合物可以配制為溶液、微乳、脂質(zhì)體、或其它適合于高藥物濃度 的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì),其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、 及液態(tài)聚乙二醇等)、及其合適的混合物。在一些情況中,它在組合物中會包含等張劑,例如 糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。
[0304]可以如下制備無菌可注射溶液,即根據(jù)需要在具有上文所列舉的一種成分或成分 組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物,接著過濾滅菌。一般而言,通過將活性化合物 摻入無菌媒介中來制備分散體,所述無菌媒介含有基礎分散介質(zhì)及來自那些上文所列舉的 成分的其它所需成分。在供制備無菌可注射溶液用的無菌粉劑的情況中,一些制備方法是 自其先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷凍干 燥(凍干)。
[0305] 藥學用途
[0306] 可以為治療目的使用單克隆抗體來制備遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷。例如, 可以使用上文所描述的實施方案中的單克隆抗體來阻斷TFPI與FXa的相互作用,或者以阻 止對TF/FVIIa活性的TFPI依賴性抑制。另外,還可以使用單克隆抗體來恢復TF/FVIIa驅(qū)動 的FXa生成以回避FVIII或FIX依賴性FXa擴增的不足。
[0307] 單克隆抗體在止血病癥諸如血小板減少(thrombocytopenia)、血小板病癥和流血 病癥(例如血友病A和血友病B)的治療中具有治療用途??梢酝ㄟ^對所有需要的患者施用治 療有效量的抗TFPI單克隆抗體來治療此類病癥。單克隆抗體在治療諸如外傷和出血性中風 (hemorrhagi c stroke)等的適應癥中不受控制的流血中也具有治療用途。如此,還提供了 一種用于縮短流血時間的方法,包括對所有需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗TFPI 單克隆抗體。
[0308] 抗體可以作為單一療法或者與其它療法聯(lián)合使用以解決止血病癥。例如,認為本 發(fā)明的一種或多種抗體與凝固因子諸如因子Vila、因子VIII或因子IX的共施用對于治療血 友病是有用的。在一個實施方案中,提供了一種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷 的方法,包括施用(a)第一量的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的單克隆抗體和(b)第二量的因 子VIII或因子IX,其中所述第一和第二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的。在另 一個實施方案中,提供了一種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法,包括施用 (a)第一量的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的單克隆抗體和(b)第二量的因子VIII或因子IX, 其中所述第一和第二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的,且進一步其中因子VII 不是共施用的。本發(fā)明還包括藥物組合物,其包含治療有效量的本發(fā)明的單克隆抗體和因 子VIII或因子IX的組合,其中所述組合物不含因子VII。"因子VII"包括因子VII和因子 Vila。這些聯(lián)合療法有可能降低凝固因子的必要輸注頻率。共施用或聯(lián)合療法意指各自分 開配制或在一種組合物中共同配制且當分開配制時在近似相同時間或在不同時間,但在相 同治療期里施用的兩種治療藥物的施用。
[0309] 可以以如下劑量和頻率對患有血友病A或B的受試者胃腸外施用藥物組合物,所述 劑量和頻率可以隨流血事件的嚴重程度而變化,或者在預防療法的情況中,可以隨患者的 凝固缺乏的嚴重程度而變化。
[0310] 可以以推注(bo Ius)或者通過連續(xù)輸注來對有所需要的患者施用組合物。例如,作 為Fab片段存在的發(fā)明性抗體的推注施用可以在0.0025至100mg/kg體重、0.025至0.25mg/ kg、0·010至0· IOmg/kg或0· 1 〇-〇·50mg/kg的量中。對于連續(xù)輸注,可以以0.001 至100mg/kg 體重/分鐘、0 · 0125 至1 · 25mg/kg/分鐘、0 · 010 至0 · 75mg/kg/分鐘、0 · 010 至1 · 0mg/kg/分鐘或 0.10-0.50mg/kg/分鐘施用作為Fab片段存在的發(fā)明性抗體,持續(xù)一段1-24小時、1-12小時、 2-12小時、6-12小時、2-8小時、或1-2小時的時間。對于施用作為全長抗體(具有完整的恒定 區(qū))存在的發(fā)明性抗體,劑量量可以是約l-l〇mg/kg體重、2-8mg/kg、或5-6mg/kg。此類全長 抗體通常會通過延續(xù)一段30分鐘至3小時的時間的輸注來施用。施用頻率會取決于狀況的 嚴重程度。頻率范圍可以為每周三次至每兩或三周一次。
[0311] 另外,可以經(jīng)由皮下注射來對患者施用組合物。例如,可以經(jīng)由皮下注射每周、每 兩周或每月對患者施用10至IOOmg抗TFPI抗體的劑量。
[0312] 如本文中所使用的,"治療有效量"指有效增加體內(nèi)的凝固時間或者在其它情況中 對有所需要的患者引起可測量的體內(nèi)益處所需要的抗TFPI單克隆抗體或所述抗體與因子 VIII或因子IX的組合的量。精確量會取決于許多因素,包括但不限于治療性組合物的成分 和物理特征、預期的患者群體、個體患者考慮等,而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。 實施例
[0313] 通用材料和方法
[0314] 實施例1:針對人TFPI淘選并篩選人抗體文庫
[0315] 針對TFPI淘選人抗體文庫
[0316] 通過針對人TFPI (American Diagnostica)淘選菌體展示組合人抗體文庫HuCal GolcKRothe等,J .Mol .Biol. ,2008,376 :1182-1200)來選擇抗TFPI抗體。簡言之,將200μ1 TFPI(5μg/ml)于4°C在96孔Maxisorp板上包被過夜,然后用含有5%乳的I3BS緩沖液封閉平 板。用含有〇 .01 %TWeen-20的PBS(PBST)清洗平板后,將組合人抗體文庫的等分試樣添加至 經(jīng)TFPI包被的孔,并溫育2小時。用PBST洗去未結(jié)合的噬菌體,并用二硫蘇糖醇稀釋抗原結(jié) 合的噬菌體,感染,并在大腸桿菌(E. coli)菌株TGl中擴增。通過輔助噬菌體來挽救噬菌體 以進行下一輪淘選。進行總共三輪淘選,并在ELISA測定法中針對人TFPI篩選來自前兩輪的 克隆。
[0317]在ELISA中通過抗原結(jié)合來篩選抗體克隆
[0318] 為了選擇結(jié)合人TFPI的抗體克隆,將來自第二和第三輪淘選的噬菌體克隆的Fab 基因亞克隆入細菌表達載體中,并在大腸桿菌菌株TGl中表達。將細菌溶胞物添加至經(jīng)人 TFPI包被的Maxisorp板的孔。清洗后,使用偶聯(lián)有HRP的山羊抗人Fab作為檢測抗體,并通過 添加具有過氧化氫的AmplexRed (Invitrogen)來使平板顯影。認為比背景高至少5倍的信號 為陽性。通過相似的小鼠 TFPI結(jié)合ELISA來測定抗人TFPI抗體對小鼠 TFPI的交叉反應性。用 小鼠 TFPI (R&D System)、BSA和溶菌酶包被平板。使用后兩種抗原作為陰性對照。圖1中顯示 了代表性的數(shù)據(jù)組。
[0319] 抗TFPI人抗體的序列
[0320] 針對TFPI淘選并篩選HuCal Gold人抗體文庫后,對陽性抗體克隆實施DNA測序,產(chǎn) 生44種獨特的抗體序列(表2)。這些抗體序列中,29種是lambda輕鏈,而15種是kappa輕鏈。 我們對重鏈可變區(qū)的分析揭示了 VH3為28種、VH6為14種、VHl為1種及VH5為1種。
[0321] 表2:44種抗TFPI抗體的可變區(qū)的肽序列
[0325] 與小鼠 TFPI的交叉反應性
[0326] 還在ELISA中對上述44種人TFPI結(jié)合克隆測試對小鼠 TFPI的結(jié)合。找到與小鼠 TFPI交叉反應性的19種抗體。為了便于使用小鼠血友病模型進行的研究,我們進一步表征 了這19種抗體及對人TFPI特異性的5種抗體。圖1中顯示了代表性的數(shù)據(jù)組。這些抗體在 ELISA中無一結(jié)合BSA或溶菌酶。
[0327] 實施例2:抗TFPI抗體的表達和純化
[0328] 將抗TFPI抗體(作為Fab片段)表達,并自細菌菌株TGl純化。簡言之,將含有抗體表 達質(zhì)粒的細菌菌株TGl的單克隆挑出,并在存在34μg/ml氯霉素和1 %葡萄糖的情況中在8ml 2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將7ml體積的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有34μg/ml氯霉素和1%葡萄糖的 250ml新鮮的2xYT培養(yǎng)基。溫育3小時后,添加0.5mM IPTG以誘導Fab表達。于25°C繼續(xù)培養(yǎng) 過夜。離心培養(yǎng)物以沉淀細菌細胞。然后將沉淀物在Bug Buster裂解緩沖液(Novagen)中重 懸。離心后,過濾細菌裂解的上清液。依照制造商的指令通過Ni -NTA柱(Qiagen)對Fab片段 進行親和純化。
[0329] 實施例3:抗TFPI抗體的EC5q和結(jié)合親和力的測定
[0330]使用純化的Fab抗體來測定抗TFPI抗體對人或小鼠 TFPI的EC5Q。與上文所描述的類 似地,在ELISA中評估EC5Q。使用SoftMax來分析結(jié)果。在Biacore測定法中測定抗TFPI抗體的 結(jié)合親和力。簡言之,使用胺偶聯(lián)試劑盒(GHfealthCare)依照制造商的指令將抗原(或是人 或是小鼠 TFPI)在CM5芯片上固定化。相對于抗原質(zhì)量來調(diào)節(jié)固定化的TFPI的量以給出約 300個RU。在流動相中分析抗體Fab,并在Biacore測定法中使用至少五種不同濃度(0.1、 0.4、1.6、6.4和25nM)的純化的抗體。使用Biacore TlOO評估軟件來計算動力學和結(jié)合親和 力。
[0331] 如表3中所顯示的,24種抗TFPI Fab顯示了對人TFPI(0.09至792nM)和小鼠 TFPI (0.06至1035nM)的多種EC5q,因而通過Biacore測定的親和力對人TFPI是不同的(1.25至 1140nM)。在Fab對小鼠 TFPI的Biacore研究中,親和力的變化更小(3.08至51.8nM)。
[0332] 表3:24種抗體針對人或小鼠 TFPI的結(jié)合活性,如通過ELISA和Biacore所測定的 (hTFPI:人TFPI ;mTFPI :小鼠 TFPI ;Neg:信號比背景的兩倍小;ND,未完成)。
[0335] 實施例4:抗TFPI Fab向IgG的轉(zhuǎn)化
[0336]所有鑒定的抗TFPI抗體都是完全人Fab,其可以可行地轉(zhuǎn)化為人IgG作為治療劑。 然而,在此實施例中,將選定的Fab轉(zhuǎn)化為含有小鼠 IgG恒定區(qū)的嵌合抗體,因此它們更適合 于在小鼠模型中測試。將選定抗體的可變區(qū)嫁接入含有小鼠恒定區(qū)的哺乳動物表達載體 中。然后,將完全裝配的IgG分子在HKBll細胞中轉(zhuǎn)染并表達(Mei等,Mol. Biotechnol., 2006,34:165-178)。將培養(yǎng)物上清液收集并濃縮。遵循制造商的指令通過Hitrap蛋白G柱 (GEHealthcare)來對抗TFPI IgG分子進行親和純化。
[0337] 實施例5:抗TFPI中和性抗體的選擇
[0338] 基于其在三種實驗條件下對TFPI活性的抑制來選擇抗TFPI中和性抗體。使用 ACTICHR01ViE.?TFPI活性測定法(American Diagnostica Inc. ,Stamford,CT)(即一種 用于測量TFPI抑制TF/FVIIa復合物將因子X激活為因子Xa的催化活性的能力的三階段生色 測定法)來測量TFPI活性??筎FPI抗體的中和活性與恢復的FXa生成量成比例。在第一種背 景中,將純化的抗TFPI抗體與指定濃度的人或小鼠重組TFPI(R&D System) -起溫育。溫育 后,將樣品與TF/FVIIa和FX混合,然后使用SPECTROZYME?FXa(即一種高度特異性的 fXa生色底物)來測量TF/FVIIa復合物的殘余活性。此底物僅被測定法中生成的FXa切割,釋 放對硝基苯胺(PNA)生色團,其在405nm處測量。自使用已知TFPI活性水平構(gòu)建的標準曲線 插入樣品中存在的TFPI活性。以終點模式實施測定法。在兩種其它背景中,將抗TFPI抗體摻 入正常人血漿或血友病A血漿中,并測量恢復的FXa生成。
[0339] 實施例6:抗TFPI抗體在稀釋凝血酶原時間(dPT)測定法中縮短凝固時間
[0340] 實施dPT測定法,基本上如Welsch等,Thrombosis Res. ,1991,64(2):213-222中所 描述的。簡言之,通過混合血漿與0.1個體積的對照緩沖液或抗TFPI抗體來制備人正常血漿 (FACT,George King Biomedical)、人TFPI消減的血楽XAmerican Diagnostica)或血友病A 血衆(zhòng)(George King Biomedical)。于25°C溫育30分鐘后,將血衆(zhòng)樣品(100μΙ)與作為促凝血 酶原激酶源的200μ1適當稀釋的(1:500稀釋)Simplast in (Biometieux)組合,并使用纖維測 定儀STA4 (Stago)來測量凝固時間。用I3BS或含有0.1 M氯化鈉、0.1 %牛血清清蛋白和20μΜ氯 化鈣的0.05Μ基于Tris的緩沖液(pH 7.5)稀釋促凝血酶原激酶。
[0341] 實施例7:單獨的或與重組因子VIII或因子IX聯(lián)合的抗TFPI抗體在ROTEM測定法中 縮短血液凝固時間
[0342] ROTEM系統(tǒng)(Pentapharm GmbH)包括四通道儀器、計算機、血衆(zhòng)標準品、激活劑和一 次性杯和針。ROTEM止血系統(tǒng)的血栓彈力圖(thrombeIastographic)參數(shù)包括:凝固時間 (CT),其反映到啟動血液凝固的反應時間(啟動數(shù)據(jù)收集后獲得2_振幅所需要的時間);用 于反映凝固擴展(clotting propagation)的凝固形成時間(CFT)和alpha角、和用于反映凝 塊堅固性的最大限度振幅和最大限度彈性模數(shù)(e I a s t i c modu I us)。在ROTEM測定法中,評 估300μ1新鮮的檸檬酸化的全血或血漿。依照制造商的指令重建并混合所有組分,數(shù)據(jù)收集 持續(xù)每個系統(tǒng)需要的時間期限。簡言之,通過用自動化移液器將300μ1血液或血漿取出/分 配入ROTEM杯中來混合樣品,其中添加20μI CaCl2(200mmo 1 ),接著立即混合樣品并啟動樣 品收集。使用計算機控制的(軟件第2.96版)ROTEM系統(tǒng)來收集數(shù)據(jù)達2小時。
[0343] 圖3和圖5中顯示了ROTEM測定法在檢測抗TFPI抗體在縮短血液凝固時間方面的效 果中的例示性結(jié)果。圖3顯示了在用NATEM啟動ROTEM系統(tǒng)時,TP-2A8-Fab單獨地或與重組 FVIII聯(lián)合地縮短人血友病A血漿或小鼠血友病A全血中的凝固時間。圖5顯示了與陰性對照 小鼠 IgG抗體相比,IgG型式的抗TFPI抗體(TP-2A8、TP-3G1、和TP-3C2)縮短凝固時間?;?這些結(jié)果和本領(lǐng)域的了解,技術(shù)人員會預期與單獨的這些抗體相比,這些抗TFPI抗體與重 組FIX聯(lián)合也縮短凝固時間。
[0344] 實施例8:抗TFPI抗體的體外功能活性
[0345] 為了在阻斷TFPI功能上調(diào)查TFPI抗體,使用生色測定法ACTICHR0ME和稀釋凝血酶 原時間(dPT)兩者來測試通過淘選和篩選獲得的抗體的功能活性。在這兩種測定法中,使用 單克隆大鼠抗TFPI抗體(R&D System)作為陽性對照,并使用人多克隆Fab作為陰性對照。在 生色測定法中,與大鼠單克隆抗體相比,8種抗體抑制超過50 %的TFPI活性(表4)。在dPT測 定法中,所有這8種抗TFPI Fab顯示高度抑制效果,這使凝固時間縮短在80秒下,而8種Fab 之4種使dPT縮短在70秒下。圖2中顯示了4種代表性克隆在縮短dPT上的劑量依賴性。然而, 具有低的TFPI抑制活性或沒有TFPI抑制活性的其它人抗TFPIFab在dPT中也縮短凝固時間。 例如,雖然顯示小于25 %的抑制活性,但是TP-3B4和TP-2C7仍將dPT縮短至小于70秒。對抑 制活性和dPT的簡單線性回歸分析提示顯著的相關(guān)性(p = 0.0095)但大的方差(R平方= 0.258)〇
[0346] 表4:抗TFPI抗體的體外功能活性,如通過其在人TFPI測定法和dPT測定法中的抑 制活性所測定的。
[0349] 還在ROTEM測定法中測試抗TFPI Fab之一,即Fab_2A8,其中使用具有低水平因子 VIII的人血友病A血漿或小鼠血友病A全血。如圖3中所顯示的,比較多克隆兔抗TFPI抗體, Fab-2A8在人血友病A血漿中顯示相似的活性,將凝固時間(CT)從2200秒降低至約1700秒。 在使用小鼠血友病A全血時,對照抗體兔抗TFPI將CT從2700秒縮短至1000秒,而Fab-2A8將 CT從2650秒縮短至1700秒。這些結(jié)果指明Fab-2A8可以在人血漿和小鼠血液兩者中顯著縮 短凝固時間(P = 〇.03)。
[0350]實施例9:抗TFPI抗體轉(zhuǎn)化為嵌合I gG后的功能
[0351]因子Xa生成和稀釋凝血酶原時間的體外測定法指明,24種抗TFPI Fab中至少六 種,即了?-248、了?-283、了?-266、了?-302、了?-361和了?-487能阻斷了??1功能。為了便于使用血 友病A小鼠進行的體內(nèi)研究,我們使用鼠 IgGl同種型將這六種抗TFPI人Fab轉(zhuǎn)化成嵌合IgG。 將IgG表達載體轉(zhuǎn)染入HKBl 1細胞中,并在培養(yǎng)物上清液中收集表達的抗體,并在蛋白G柱上 純化。在將代表性克隆2G6-Fab轉(zhuǎn)化為IgG時,2G6-IgG顯示人TFPI的EC 5q結(jié)合升高2倍(從 0 · 48nM至0 · 22nM)和對小鼠 TFPI的升高10倍(從5 · 18nM至0 · 51nM)。圖4中顯示了 IgG-2G6結(jié) 合人和小鼠 TFPI的結(jié)果。
[0352] 實施例10:在血友病A(HemA)小鼠尾靜脈橫斷模型中對存活率的影響
[0353] 已經(jīng)為藥理學評估建立了小鼠尾靜脈橫斷模型。此模型模擬正常個體與嚴重血友 病患者之間觀察到的一大批流血表型。對于這些研究,使用雄性血友病A小鼠(8周齡和20至 26克)。損傷前通過單獨地或與凝固因子諸如FVIIKO. IIU/小鼠)一起用抗TFPI單克隆抗體 (40yg/小鼠)進行尾靜脈輸注來對小鼠給藥。劑量給藥后24小時時,將離尖端2.7mm(以直徑 計)處的尾的左靜脈橫斷。在橫斷后24小時里觀察存活。表明在與重組FVIII-起給予時存 活率是劑量依賴的(數(shù)據(jù)未顯示)。圖8中顯示的數(shù)據(jù)來自兩項分開的研究(分別地,n=15和 η= 10)。此結(jié)果顯示了與對照小鼠 IgG相比,TP-2A8-IgG顯著延長血友病A小鼠的存活;而且 與重組FVIII聯(lián)合的展示比單獨的任一試劑更好的存活率。
[0354] 實施例11:抗TFPI抗體與重組因子Vila的聯(lián)合進一步縮短凝固時間和凝塊形成時 間
[0355] 使用EXTEM(1:1000稀釋)和小鼠血友病A全血在ROTEM系統(tǒng)中評估抗TFPI抗體和重 組FVIIa(Novo Nordisk)的聯(lián)合效應。將指定量的抗TFPI抗體TP-2A8-IgG( "2A8")和重組 FVIIa( "FVIIa")添加入300μ1檸檬酸化的小鼠血友病A全血中,并使用EXTEM系統(tǒng)來啟動血 液凝固。圖9顯示了將TP-2A8-IgG或重組FVIIa添加入小鼠血友病A全血中分別縮短凝固時 間和凝塊形成時間。TP-2A8-IgG和重組FVIIa( "2A8+FVIIa")的聯(lián)合進一步縮短凝固時間和 凝塊形成時間,指明抗TFPI抗體與重組FVIIa的聯(lián)合在用或不用抑制劑治療血友病患者中 是有用的。
[0356] 實施例12:抗TFPI抗體在FVIII抑制劑誘導的人血友病血液中縮短凝固時間
[0357] 還在ROTEM測定法中測試選定的抗TFPI抗體2A8和4B7,其使用中和性FVIII抗體來 誘導自非血友病患者吸取的全血中的血友病來進行。圖10顯示了正常的人血液具有約1000 秒的凝固時間。在存在FVIII中和性抗體(PAH,100微克/mL)的情況中,將凝固時間延長至約 5200秒。通過添加抗TFPI抗體2A8或4B7來顯著縮短延長的凝固時間,指明抗TFPI抗體在用 抑制劑治療血友病患者中是有用的。
[0358] 實施例13:抑制性抗TFPI抗體結(jié)合人TFPI的Kunitz域
[0359] 使用Western印跡和ELISA來測定抑制性抗體結(jié)合TFPI的那個/些域。使用重組全 長人TFPI或TFPI域來進行這些研究。ELISA與實施例3相似。在Western印跡中,將人TFPI或 域在 4-12 % Bi s-Tr is SDS PAGE 運行緩沖液 MES (Invitrogen ,Car lsbad ,CA)上運行,然后轉(zhuǎn) 移至纖維素膜。與抑制劑性抗體一起溫育10分鐘后,使用SNAPid系統(tǒng)(Mi Ilipore, Billerica,MA)清洗該膜三次。將1至10,000稀釋的偶聯(lián)有HRP的驢抗小鼠抗體(Pierce, Rockford, IL)與膜一起溫育10分鐘。相似的清洗步驟后,使用SuperSignal底物(Pierce, Rockford,IL)來使膜顯現(xiàn)。雖然對照抗Kunitz域1抗體結(jié)合全長TFPI、截短的TFPI和域,抑 制性抗TFPI抗體僅結(jié)合含有Kunitz域2的TFPI。這指明對Kunitz域2的結(jié)合對于抗體的抑制 功能是必需的。
[0360] 表5:如通過We s tern印跡和ELISA測定的抗體結(jié)合的域
[0362] 雖然本發(fā)明已經(jīng)參照具體的實施方案和實施例進行了描述,但是應當理解可以進 行各種修飾和變化,而且可以在不背離本發(fā)明的真實精神和范圍的前提下替換等同方案。 因而,說明書和實施例要以例示性而非限制性意義看待。此外,通過提及而將本文中所提及 的所有文章、書籍、專利申請和專利完整收入本文。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的治療組合物,其包含人單克隆IgG抗體,其特異性結(jié)合包含人組織因子途 徑抑制劑(TFPI)的Kunitz-2域的區(qū)域,其中所述抗體的重鏈包含與SEQ ID NO: 16具有至少 90%同一性的氨基酸序列,和所述抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO: 14具有至少85%同一性的 氨基酸序列,且其中所述抗體的重鏈具有包含與SEQ ID N0:305具有至少80%同一性的氨 基酸序列的⑶R-I區(qū)域,包含與SEQ ID N0:348具有至少80%同一性的氨基酸序列的⑶R-2 區(qū)域,和包含與SEQ ID NO:391具有至少80%同一性的氨基酸序列的⑶R-3區(qū)域。2. 權(quán)利要求1的組合物,進一步包含因子VIII或因子IX,基本上沒有因子VII。3. 權(quán)利要求1的組合物,其中所述抗體具有與人TFPI通過Biacore測定法大約1.25至 IHOnM的親和力。4. 權(quán)利要求1的組合物,其中所述重鏈⑶R-2區(qū)域具有與SEQ ID NO.348至少85%的同 一性。5. 權(quán)利要求1的組合物,其中所述重鏈⑶R-3區(qū)域具有與SEQ ID NO.391至少85%的同 一性。6. 權(quán)利要求1的組合物,其中所述抗體的重鏈具有包含如SEQ ID NO.305中所示的氨基 酸序列的⑶R-I區(qū)域,包含如SEQ ID NO.348中所示的氨基酸序列的⑶R-2區(qū)域,和包含如 SEQ ID NO.391中所示的氨基酸序列的CDR-3區(qū)域。7. 權(quán)利要求1的組合物,其中所述抗體的輕鏈具有包含如SEQ ID NO. 176中所示的氨基 酸序列的⑶R-I區(qū)域,包含如SEQ ID NO. 219中所示的氨基酸序列的⑶R-2區(qū)域,和包含如 SEQ ID NO.262中所示的氨基酸序列的CDR-3區(qū)域。8. 權(quán)利要求1的組合物,其中所述抗體的重鏈包含如SEQ ID NO. 16中所示的氨基酸序 列。9. 權(quán)利要求8的組合物,其中所述抗體的輕鏈包含如SEQ ID NO. 14中所示的氨基酸序 列。10. 權(quán)利要求1的組合物,其中將所述抗體以10至IOOmg的劑量在用于注射的藥學可接 受的載體中配制。
【文檔編號】A61K39/395GK105944100SQ201610471094
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2009年8月4日
【發(fā)明人】王卓智, 約翰.E.默菲, 潘峻亮, 蔣海燕, 劉冰
【申請人】拜耳醫(yī)藥保健有限公司