文蛤巨噬細(xì)胞遷移抑制因子基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體的說是一種文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因及其編 碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨噬細(xì)胞迀移抑制因子是一種多功能的生物細(xì)胞因子，是機(jī)體先天免疫應(yīng)答反應(yīng) 的重要調(diào)節(jié)因子。已有的研究表明，巨噬細(xì)胞迀移抑制因子在機(jī)體的所有組織中廣泛表達(dá)。 其重組蛋白能夠提高機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的抵抗能力。巨噬細(xì)胞迀移抑制因子同時(shí)具有氧化還 原酶活性和互變異構(gòu)酶活性。其氧化還原酶活性能夠介導(dǎo)激活機(jī)體的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞 發(fā)揮免疫功能，同時(shí)消除機(jī)體免疫應(yīng)答過程產(chǎn)生的活性氧；其異構(gòu)酶活性位點(diǎn)對(duì)該蛋白的 細(xì)胞因子活性至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞迀移抑制因子參與了動(dòng)物的免疫應(yīng)答反應(yīng)，尤其對(duì)于缺 乏獲得性免疫的軟體動(dòng)物而言，其作用尤為重要。目前的試驗(yàn)已證明，巨噬細(xì)胞迀移抑制因 子參與了光滑雙臍螺、中華絨螯蟹以及九孔鮑的免疫應(yīng)答過程。
[0003] 隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境污染、病害頻發(fā)等問題讓海水養(yǎng)殖業(yè)損失 慘重。傳統(tǒng)的利用抗生素的方法控制不僅損害人類的用藥資源，同時(shí)也不適用于開放的海 水養(yǎng)殖環(huán)境，因此開發(fā)新的有效的免疫增強(qiáng)劑將成為解決養(yǎng)殖病害問題的途徑之一。本發(fā) 明源于文蛤本身巨噬細(xì)胞迀移抑制因子，是一種天然蛋白，可以作為備選的新型免疫增強(qiáng) 劑。另外，在小鼠中的研究表明重組表達(dá)的巨噬細(xì)胞迀移抑制因子蛋白能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)于 細(xì)菌感染的抵抗能力。
[0004] 文蛤一種重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類，主要分布在我國(guó)的東南沿海海域。目前，還沒有從 文蛤中獲得巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因及其編碼蛋白和應(yīng) 用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因，文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因的cDNA 序列為SEQ ID NO. 1中核苷酸所示。
[0008] 所述文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因的cDNA所編碼的蛋白為SEQ ID NO. 2中氨 基酸所示。
[0009] -種文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因的應(yīng)用，所述SEQ ID NO. 1所示文蛤巨噬細(xì) 胞迀移抑制因子基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為氧化還原酶或互變異構(gòu)酶。
[0010] 本發(fā)明所具有優(yōu)點(diǎn)：
[0011]本發(fā)明從文蛤EST文庫(kù)中篩選獲得了與巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因家族同源的 序列，以此為基礎(chǔ)，采用RACE技術(shù)以及體外重組表達(dá)技術(shù)，克隆到文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制 因子基因的cDNA全長(zhǎng)序列。通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增編碼文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子的開放閱 讀框序列并將其克隆到pET30a表達(dá)載體中，在大腸桿菌中重組表達(dá)了該蛋白。重組表達(dá)產(chǎn) 物經(jīng)過HistrapHP親和柱純化后，獲得了文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子重組蛋白，經(jīng)檢測(cè)此 重組蛋白具有氧化還原酶活性和互變異構(gòu)酶活性，免疫防御方面發(fā)揮著重要作用，可以作 為貝類生長(zhǎng)的免疫增強(qiáng)劑及飼料、食品的添加劑等。該蛋白為可溶性表達(dá)，具有大規(guī)模生產(chǎn) 的可能，可以彌補(bǔ)天然蛋白量低以致難以滿足需要的局限。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例純化的文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子重組蛋白，其中M:蛋白 marker;1 :0h對(duì)照；2:IPTG誘導(dǎo)后 4h;3:IPTG誘導(dǎo)后 12h;4 :純化所得蛋白；5=Western blot檢測(cè)蛋白。
[0013] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例獲得文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子重組蛋白的氧化還原酶活 性。其中MmMIF為巨噬細(xì)胞迀移抑制因子重組蛋白，牛血清蛋白（BSA)為對(duì)照蛋白。
[0014] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例獲得文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子重組蛋白的互變異構(gòu)酶活 性。其中MmMIF為巨噬細(xì)胞迀移抑制因子重組蛋白，牛血清蛋白（BSA)為對(duì)照蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 本發(fā)明中的文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子的cDNA序列克隆包括下列步驟：
[0018] 1)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；
[0019] 2)從文蛤EST文庫(kù)中篩選獲得巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因的同源序列；
[0020] 3)RACE擴(kuò)增獲得文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子的全序列以及全序列的驗(yàn)證。
[0021] 具體操作如下：
[0022] 1.文蛤總RNA的提?。豪肐nvitrogen公司的Trizol試劑從文蛤幼蟲中提取總 RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA純化試劑盒純化mRNA。
[0023] 2.文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因cDNA全長(zhǎng)序列的克?。簭奈母駿ST文 庫(kù)中選擇與巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因同源的文蛤EST序列設(shè)計(jì)5'race引物 (MmMIF5,GSP&MmMIF5'NGS)和 3'race引物（MmMIF3,GSP&MmMIF3'NGSP)，根據(jù)race試劑盒 的說明書進(jìn)行3'和5'末端的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用膠回收 試劑盒（大連寶生物）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化和回收，再與pMD-19-T載體（大連寶生物公司） 鏈接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，挑選陽(yáng)性克隆用載體引物Ml3-47和Ml3-48進(jìn) 行測(cè)序，所得結(jié)果經(jīng)過BioEdit軟件拼接，得到文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子全長(zhǎng)序列見SEQ IDNO. 1。所使用的引物序列如下：

[0043] ?長(zhǎng)度：114aa
[0044] ?類型：氨基酸序列
[0045] 魯鏈型：?jiǎn)捂?br>[0046] 魯拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0047] (b)分子類型：重組蛋白
[0048] (c)假設(shè)：否
[0049] (d)反義：否
[0050] (e)最初來源：NCBI (GenBank:AKN56918. 1)
[0051] (f)特異性名稱：文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子蛋白
[0052]SEQID NO. 1所示文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因，其是從文蛤中克隆得到的巨 噬細(xì)胞迀移抑制因子的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)804bp，其中完整閱讀框345bp，5'非編碼區(qū) 69bp, 3'非編碼區(qū)390bp，有多聚賴氨酸價(jià)位信號(hào)（AATAA)和多聚賴氨酸尾巴。該基因在文 蛤先天免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，該基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQID NO. 1所示，其 編碼的蛋白具有SEQID NO. 2所不的氣基酸序列，完整編碼白含有114個(gè)氣基酸，包括巨口策 細(xì)胞迀移抑制因子蛋白家族保守的功能結(jié)構(gòu)域。
[0053] 3.文蛤巨噬細(xì)胞迀移抑制因子基因cDNA全長(zhǎng)的驗(yàn)證：在測(cè)序拼接的巨噬細(xì)胞迀 移抑制因子全長(zhǎng)序列上設(shè)計(jì)一對(duì)引物cMmMIFF和cMmMIFR，以cDNA為模板進(jìn)行全長(zhǎng)的驗(yàn)證。 測(cè)序以及分析同步驟2.。所使用的引物序列如下：
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