誘導(dǎo)辣椒素受體y739位點(diǎn)的特異性抗體的多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體生產(chǎn)領(lǐng)域，具體地，涉及一種特異性誘導(dǎo)辣椒素受體Y739位點(diǎn)的 抗體的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 瞬時(shí)感受器電位香草酸受體（transientreceptorpotentialvaniloid 1，VR1),又稱為辣椒素受體，屬于瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道（transientreceptor potentialcationchannel)，廣泛分布于傷害性感受器上產(chǎn)生疼痛或痛過敏。近期的研究 表明，VR1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。VR1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常。但VR1影響腫瘤 的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。對(duì)VR1的進(jìn)一步研究有助于了解和闡明其參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生 發(fā)展的分子機(jī)制。
[0003] 已有研究表明VR1具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，VR1活化可由自身不同氨基酸位點(diǎn)的磷 酸化所調(diào)節(jié)，這些磷酸化過程涉及PKA，PKC及鈣調(diào)蛋白激酶CaMKII等通路。一項(xiàng)新的研究 表明VR1的羧基端Y739位點(diǎn)可被磷酸化，并與鱗狀細(xì)胞皮膚癌的轉(zhuǎn)化有關(guān)。該磷酸化位點(diǎn) 位于與激酶A錨定蛋白AKAP的相互作用的重要區(qū)域內(nèi)，多個(gè)VR1被磷酸化調(diào)節(jié)位點(diǎn)也位于 該區(qū)域，與VR1的辣椒素及熱敏活性相關(guān)。該位點(diǎn)的磷酸化極有可能參與調(diào)解VR1對(duì)辣椒 素、PH、熱刺激等的敏感程度。而要研究VR1的Y739位點(diǎn)的生物學(xué)功能，尤其是其被磷酸化 后功能的改變，該位點(diǎn)特異的磷酸化抗體將是一個(gè)必不可少的工具。然而，目前市場上卻并 沒有VR1Y739位點(diǎn)特異性的磷酸化抗體，這嚴(yán)重阻礙了該蛋白功能的進(jìn)一步研究和其與腫 瘤發(fā)生發(fā)展相互關(guān)系和機(jī)制的闡明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的填補(bǔ)市場上沒有VR1Y739位點(diǎn)特異性的磷酸化抗體的空白。本 發(fā)明通過提供一種誘導(dǎo)辣椒素受體Y739位點(diǎn)的特異性抗體的多肽來實(shí)現(xiàn)，該多肽的特征 在于，其序列為NH2-CGYTPDGKDDYR-C0NH2，或NH2-CGYTPDGKDDp[Ser]R-C0NH2。
[0005] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白相偶聯(lián)。
[0006] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，采用序列為NH2-CGYTPDGKDDYR-C0NH2的多肽進(jìn)行免 疫，可以獲得辣椒素受體Y739位點(diǎn)的抗總肽段抗體。
[0007] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，采用序列為NH2-CGYTroGKDDp[Ser]R-C0NH2的多 肽進(jìn)行免疫，獲得辣椒素受體Y739位點(diǎn)的特異性磷酸化抗體。
[0008] 本發(fā)明的另一方面是提供一種辣椒素受體Y739位點(diǎn)的特異性抗體，其特征在于， 所述特異性抗體能特異性地結(jié)合權(quán)利要求1中序列為NH2-CGYTPDGKDDYR-C0NH2的多肽和序 列為NH2-CGYTPDGKDDp[Ser]R-C0NH2的多肽中的一個(gè)或兩個(gè)。
[0009] 本發(fā)明的另一方面包括編碼所述多肽的核酸，以及所述特異性抗體的核酸。
[0010] 本發(fā)明還提供了制備辣椒素受體Y739位點(diǎn)的特異性抗體的方法，其特征在于包 括以下步驟：
[0011] A)采用權(quán)利要求1所述的多肽作為抗原免疫動(dòng)物；
[0012] B)收集步驟A)中動(dòng)物的血清，兩步特異性多肽親和法純化得到所述特異性抗體。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一種藥物組合物，其用于治療與鱗狀細(xì)胞皮膚癌的轉(zhuǎn)化有 關(guān)的疾病，其特征在于，所述藥物組合物制備過程中采用所述多肽獲得辣椒素受體Y739位 點(diǎn)的特異性抗體，并且所述特異性抗體包含在所述藥物組合物中。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是，通過采用本發(fā)明的多肽，可以特異性誘導(dǎo)出辣椒素受體 Y739位點(diǎn)的磷酸化抗體和抗總肽段抗體，填補(bǔ)市場上沒有VR1Y739位點(diǎn)特異性的磷酸化 抗體的空白。同時(shí)，對(duì)研究VR1的相關(guān)功能，闡明VR1蛋白在炎性痛，過敏性疼痛以及VR1 參與調(diào)控的腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有重要作用。
【附圖說明】
[0015] 圖1顯示了本發(fā)明多肽與本發(fā)明特異性抗體的western blot結(jié)果圖；
[0016] 圖2顯示了本發(fā)明辣椒素受體Y739位點(diǎn)的特異性抗體的westernblot結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 將通過以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)論述。
[0018] I.多肽合成
[0019] 采用固相合成法合成，即先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié) 構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以該結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng) 過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈，重復(fù)操作，直到達(dá)到所要合成 的肽鏈長度為止，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。
[0020] 通過固相合成法合成出純度高于90%的磷酸化及非磷酸化多肽，合成量10mg，所 合成多肽序列如下：
[0021]磷酸化多肽（P肽）NH2-CGYTPDGKDDp [Ser] R-C0NH2
[0022]非磷酸化多肽（N肽）NH2-CGYTPDGKDDYR-C0NH2
[0023] II.純化
[0024] 多肽的粗產(chǎn)品由RP-HPLC方法純化。HPLC條件：流動(dòng)相：Α) 0. 1 % TFA水溶液； B)0. 1% TFA乙腈溶液；梯度：A/B(90/40)到A/B(40/90)30min ;流速：lml/min ;溫度：室溫 (23°C);檢測：214nm的紫外。
[0025] 具體實(shí)施步驟為：將粗品溶解在流動(dòng)相中，注入20-30mg(2-2. 5ml)樣品，開始層 析，并將主峰收集到50ml管中，然后凍干。
[0026] III.3.鑒宙
[0027] 純化后的多肽由液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS)鑒定多肽的純度，具體條件為：流動(dòng)相： A) 0. 05 %TFA水溶液B) 0. 1 %TFA乙腈溶液；梯度：A/B(90/10)到A/B(40/60) 15min;流速： lml/min;溫度：室溫（23°C);檢測：214nm的紫外；MSAPI:ESI。
[0028] IV.多妝偶聯(lián)
[0029] 將所得的高純度多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)相偶聯(lián)以增強(qiáng)其免疫原性。偶聯(lián)所用 緩沖液為：Na2HP04, NaH2P04, NaCl，EDTA，調(diào)pH至7. 2。
[0030] 具體步驟如下：1)柱床準(zhǔn)備：純水及偶聯(lián)緩沖液洗滌柱床；2)多肽準(zhǔn)備：少量DMF 溶解多肽，靜置半小時(shí)，待溶液中無顆粒狀不溶物，加適量AH液配制成6mg/ml的多肽溶液， 從多肽溶液中分出需要偶聯(lián)的量；3)KLH、Sulf〇-SMCC準(zhǔn)備：根據(jù)質(zhì)量比，偶聯(lián)多肽總量：純 KLH= 1 :1，計(jì)算出KLH的量，按照質(zhì)量比，純KLH:Sulf〇-SMCC= 10 :1，計(jì)算出Sulfo-SMCC 的量；4)KLH和Sulfo-SMCC反應(yīng)與反應(yīng)物收集：將稱取的KLH溶于適量的AH液配置成終濃 度10mg/ml，Sulfo-SMCC用DMS0溶解成100mg/ml的溶液，將二者混合搖勻，室溫反應(yīng)4h并 間斷混搖使其充分反應(yīng)，用層析柱分離樣品；5)KLH與Sulfo-SMCC的反應(yīng)物與多肽偶聯(lián)：向 每一管需偶聯(lián)多肽中加入相應(yīng)量KLH與Sulfo-SMCC反應(yīng)物，室溫反應(yīng)2h或室溫過夜，并用 垂直混合儀混勻，將偶聯(lián)好的多肽至于_20°C保存。
[0031] V.兔多抗血清制備
[0032] 所得KLH載體蛋白偶聯(lián)合成多肽作為抗原免疫新西蘭兔（RB54273和RB54274)。 免疫采血過程如下：
[0033]
[0034] VI.血清ELISA檢測
[0035] 設(shè)立陰性對(duì)照（免疫前兔的陰性血清）和空白對(duì)照（封閉用2% BSA代替兔多抗 血清），