一種旋毛蟲重組抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種旋毛蟲重組抗原及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]旋毛蟲(Trichinella spiralis)是一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生性線蟲，能夠感染包括人類在內(nèi)的150多種哺乳動物，呈世界性分布。旋毛蟲病在我國被列為三大食源性人獸共患病之首(其余為囊蟲病及棘球蝴病)。1964年以來，先后在西藏、云南、吉林、黑龍江、廣西、四川和湖北等15個省(市、自治區(qū))出現(xiàn)人旋毛蟲病的暴發(fā)流行，病例達(dá)38700余起，死亡330余人。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，豬旋毛蟲病不僅可以造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且是肉類食品安全性的一個重要指標(biāo)。我國每年用于豬旋毛蟲病檢驗的費用高達(dá)15億元，然而仍有大量出口豬肉由于該病的漏檢而被退回，嚴(yán)重?fù)p害了我國肉產(chǎn)品安全性的國際形象。
[0003]目前，對于這種危害嚴(yán)重的寄生蟲病，只有噻苯咪唑、甲苯咪唑等咪唑類藥物可以治療，但可引起毒副作用，表現(xiàn)為嚴(yán)重程度不一的食欲減退、發(fā)熱、惡心、嘔吐、蕁麻疹、眩暈、顫抖、輕度失眠、脫發(fā)及可逆性肝損害等。目前，還沒有有效的用于預(yù)防旋毛蟲的疫苗和診斷旋毛蟲病的特異的方法。因此，尋找新的疫苗候選抗原和藥物靶點是防控該病的主要研究內(nèi)容。
[0004]水孔蛋白(Aquaporins, AQPs)又叫做親水孔蛋白，是一種位于細(xì)胞膜上的，能選擇性高效跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的水通道蛋白，屬于主要內(nèi)在蛋白(Major Intrinsic Protein,MIP)家族成員。自從1991年首次在人的紅細(xì)胞質(zhì)膜中克隆、鑒定AQPl以來，目前已在病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物、蠕蟲、植物和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)存在水孔蛋白。水孔蛋白在寄生蟲中除了調(diào)節(jié)水通透性外，還參與寄生蟲滲透壓適應(yīng)、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝廢物排出等過程，研究發(fā)現(xiàn)寄生蟲水孔蛋白還可以參與抗寄生蟲藥物的運(yùn)輸。水孔蛋白因在寄生蟲生存中發(fā)揮重要的作用，并有望成為抗寄生蟲疫苗候選分子和藥物靶點，而受到廣泛關(guān)注。但是，目前尚未有對旋毛蟲水孔蛋白(TsAQP)作為疫苗候選分子和藥物靶點的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種旋毛蟲重組抗原，其具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，能夠用于制備預(yù)防旋毛蟲感染的疫苗。
[0006]本發(fā)明提供一種旋毛蟲重組抗原，其包含由旋毛蟲水孔蛋白(TsAQP)基因開放閱讀框基因序列編碼的氨基酸序列。
[0007]作為優(yōu)選，其包含序列表SEQ ID N0.4的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明還提供免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的旋毛蟲重組抗原。
[0009]作為優(yōu)選，所述免疫原性組合物還包含佐劑或醫(yī)學(xué)上可接受的載體或賦形劑；更優(yōu)選地，所述佐劑為弗式完全佐劑和弗氏不完全佐劑。
[0010]本發(fā)明的第三個目的是提供一種疫苗，所述疫苗的有效成分為權(quán)利要求1或2所述的旋毛蟲重組抗原或權(quán)利要求3-6任一所述的免疫原性組合物。
[0011]本發(fā)明的第四個目的是上述疫苗的制備方法，步驟如下:
(O制備旋毛蟲重組抗原；作為優(yōu)選，用旋毛蟲新生幼蟲中制備旋毛蟲重組抗原；
(2)將旋毛蟲重組抗原與佐劑混合制劑，得到疫苗。
[0012]本發(fā)明的第五個目的是提供上述旋毛蟲重組抗原、免疫原性組合物在制備預(yù)防旋毛蟲感染的藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的第六個目的是提供旋毛蟲重組抗原的核酸。
[0014]本發(fā)明的第七個目的是提供包含權(quán)利要求8所述核酸的表達(dá)載體。
[0015]本發(fā)明的第八個目的是提供包含權(quán)利要求9所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明的重組抗原具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性，能夠用于制備預(yù)防旋毛蟲感染的疫苗，具有良好的免疫效果。
【附圖說明】
[0017]附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30- NSl的雙酶切鑒定。其中，M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:pET-30- NSl重組表達(dá)質(zhì)粒；2:pET-30- NSl重組表達(dá)質(zhì)粒I和Xho I雙酶切鑒定；圖2為純化后的TsAQPPI重組蛋白電泳圖；其中，M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1_4:純化后的TsAQPPI重組蛋白；
圖3為TsAQPPI重組蛋白的West-blotting鑒定結(jié)果。其中，M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，3:佐劑對照組小鼠血清；2，4 =TsAQPPI重組蛋白免疫血清；
圖4為免疫小鼠血清抗體滴度的間接ELISA檢測；
圖5為TsAQP基因和內(nèi)參基因在旋毛蟲不同發(fā)育期的表達(dá)情況，其中，圖5A為TsAQP基因和內(nèi)參基因在旋毛蟲肌幼蟲期的擴(kuò)增曲線；圖5B為TsAQP基因和內(nèi)參基因在旋毛蟲三日齡成蟲期的擴(kuò)增曲線；圖5C為TsAQP基因和內(nèi)參基因在旋毛蟲新生幼蟲期的擴(kuò)增曲線；圖6為TsAQP基因在旋毛蟲不同發(fā)育時期差異表達(dá)情況柱狀圖；臨界值:360.382。
【具體實施方式】
[0018]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
[0019]實施例1
1、旋毛蟲TsAQP基因開放閱讀框(OFR)的克隆 1.1旋毛蟲RNA的提取
旋毛蟲肌幼蟲(ML)的制備:肌幼蟲(ML)由小鼠體內(nèi)保存，將小鼠胴體用胃蛋白酶和1%鹽酸消化，然后放置梨形瓶使其自然沉淀；將沉淀物收集至50mL離心管中，用生理鹽水沖洗3遍，棄上清，沉淀即為旋毛蟲肌幼蟲。
[0020]旋毛蟲3日齡成蟲(Ad3)的制備:3日齡成蟲(Ad3)取自小鼠小腸。將感染肌幼蟲3d的小鼠致死，縱剖小鼠小腸，用生理鹽水清洗3遍后，將小腸剪斷，侵于生理鹽水中，經(jīng)50目慮篩，放置于平皿中。在37°C放置6h，收集平皿中的生理鹽水，靜置沉淀，棄上清，沉淀物即為Ad3。
[0021]旋毛蟲新生幼蟲(NBL)的制備:將Ad3繼續(xù)在37°C溫箱中培養(yǎng)至7d，將生理鹽水經(jīng)300目濾篩過濾，過濾物即為新生幼蟲(NBL)。
[0022]利用Trizol法提取旋毛蟲RNA。步驟為:將旋毛蟲肌幼蟲、3日齡成蟲和新生幼蟲分別離心后加入Iml Trizol，勻漿器冰上勻漿5min。將勻漿液上清移至新的EP管中，室溫放置5min后，加入0.2 ml氯仿。將Trizol-氯仿混合物劇烈震蕩15s，室溫放置5min后，于4°C，12000g離心15min。離心后，混合物分為三層，將上層水樣轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，室溫孵育1min后，于4°C，12000 g離心20min。棄上清，加入Iml 75%乙醇，禍旋混勾，于4°C，7500g離心5min。棄上清，置于超凈臺中室溫風(fēng)干約10_30min，加入30 μ I無RNA酶的ddH20，_70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0023]1.2旋毛蟲cDNA的獲得
將提取的旋毛蟲肌幼蟲(ML)、3日齡成蟲(Ad3)和新生幼蟲(NBL)的總RNA分別利用通用引物(多聚胸腺嘧啶核苷酸)在42°C恒溫下，反轉(zhuǎn)錄30min，獲得旋毛蟲cDNA。
[0024]1.3 TsAQP基因的擴(kuò)增
以前述內(nèi)容獲得的旋毛蟲肌幼蟲cDNA為模板，用上游引物序列 AQPPF (5 φ -GTGAGCAGAGCATATTCACA-3 φ ) 和下游引物序列 AQPPR(5￠ -GGGGCTTTAGAAATGTGAGA-3φ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到TsAQP基因的開放閱讀框序列0RF。PCR 反應(yīng)體系:10\卩0?緩沖液5 4 1^，(1見13 mixture (2.5 mmol/L) 4 μ L，引物(10 μ mol/L)各 lyL，LA Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L，模板基因組 DNA I μ L，加入 ddH20 至 50 μ L。反應(yīng)條件:94°C 5 min ；94°C 60s, 56°C 60s, 72°C 60s，35 個循環(huán)；72°C 1min0
[0025]1.4 TsAQP基因的克隆、序列分析
(I)將上述1.3的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化(北京天根公司DNA純化試劑盒)，具體步驟見試劑盒說明書。
[0026](2) TsAQP基因與pMD_18T克隆載體的連接
連接體系為:PMD18T克隆載體lyL(50ng/yL)，TsAQP基因PCR純化產(chǎn)物4 μ L，Solut1n I 5μL，混勻后置16°C連接4h后轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐青霉素抗性LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑選轉(zhuǎn)化后的單個菌落，進(jìn)行PCR陽性鑒定。
[0027](3) TsAQP基因的序列分析
分別取陽性重組菌送上海生工測序公司測序，測序結(jié)果參見序列表中SEQ ID N0.1，其編碼的氨基酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2。將測序結(jié)果利用Blast比對。將比對正確的序列利用在線軟件MotifScan software進(jìn)行親水性分析。將預(yù)測出的親水性區(qū)域，串聯(lián)后(AAS1)，在Y端和:V端分別加上酶切位點及/ ZAoI后人工合成該段序列，編號為NS1，具體序列參見序列表中SEQ ID N0.3，其編碼的氨基酸序列參見序列表中SEQ IDN0.4。
[0028]2、TsAQP蛋