專利名稱：一種重組肝癌復(fù)合表位抗原,其制備方法及在制備肝癌特異免疫治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一種重組抗原，具體地說涉及一種重組肝癌復(fù)合表位抗原，還涉及該抗原的制備方法及其在制備肝癌特異性免疫治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)是世界上肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，我國(guó)肝癌患者約占全世界的50％，患者的5年存活率＜12％，死亡率高達(dá)每年20/105。因此，在我國(guó)加強(qiáng)肝癌的防治研究有著重要意義。
目前，肝癌的主要治療方法為傳統(tǒng)的手術(shù)切除、局部或全身化療等，盡管患者的長(zhǎng)期生存率有所提高，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍在43％-61％。為預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)、治療不能手術(shù)切除及不能耐受化療的病人，人們一直在努力尋找著一種更有效的治療方法。隨著分子免疫學(xué)、腫瘤免疫治療學(xué)的迅猛發(fā)展，使免疫治療可能成為治療肝癌的有效手段。目前開展的細(xì)胞因子免疫療法、過繼性免疫治療雖在肝癌的治療中取得了一些可喜的療效，但激發(fā)的免疫反應(yīng)并非腫瘤特異性。而主動(dòng)特異性免疫治療即腫瘤疫苗因其特異性高、針對(duì)性強(qiáng)成為免疫治療的方向與主流，顯示了良好的應(yīng)用前景。
目前尋找、鑒定腫瘤特異性/相關(guān)性抗原是腫瘤疫苗研究的核心問題。對(duì)肝癌細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原的研究尚處于不成熟階段，大多集中于抗原mRNA及其蛋白的表達(dá)。肝癌組織中高表達(dá)AFP(80％)、MAGE-1(80％)、MAGE-3(68％)等抗原，其中除AFP外均為腫瘤睪丸(CT)抗原，它們?cè)诙喾N腫瘤組織中高表達(dá)，在除睪丸外的正常組織中不表達(dá)，此現(xiàn)象提示，可利用這些腫瘤抗原設(shè)計(jì)開發(fā)疫苗進(jìn)行肝癌的免疫治療。近年來人們對(duì)自身抗原(如AFP)的研究中發(fā)現(xiàn)針對(duì)自身蛋白的T細(xì)胞克隆在胚胎時(shí)并沒有完全被免疫系統(tǒng)清除，這些自身蛋白質(zhì)的CTL表位和MHC結(jié)合可為TCR識(shí)別進(jìn)而激活T細(xì)胞，如果通過恰當(dāng)?shù)姆绞矫庖邫C(jī)體，可產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應(yīng)。Vollmer和Butterfield開辟了AFP分子作為靶標(biāo)的細(xì)胞免疫治療的新途徑，證實(shí)了AFP這種癌胚抗原作為腫瘤排斥性抗原的可行性(Vollmer CM，Eilber FC，Butterfield LH，et al.Alpha-fetoprotein-specific genetic immunotherapy forhepatocellular carcinoma.Cancer Res，1999，59(13)3064-3067.Grimm CF，Ortmann D，Mohr L，et al.Mouse alpha-fetoprotein-specific DNA-basedimmunotherapy of hepatocellular carcinoma leads to tumor regression in mice.Gastroenterology，2000，119(4)1104-1112.)。以AFP為靶標(biāo)的治療既可減低AFP的水平，又有利于延緩和抑制肝癌細(xì)胞的增殖提高機(jī)體的免疫功能。另外研究證實(shí)MAGE家族的多個(gè)成員在肝癌中高表達(dá)，在癌旁組織、肝硬化和慢性肝炎的肝組織中均未檢測(cè)出MAGE基因的表達(dá)。同時(shí)從中也已鑒定出多個(gè)與不同HLA類型結(jié)合的CTL表位肽序列(Traversari C，van der Bruggen P，Luescher IF，et al.A nonapeptide encoded by human gene MAGE-1 is recognizedon HLA-A1 by cytolytic Tlymphocytes directed against tumor antigen MZ2-E.JExp Med，1992，1761453-1457.Celis E，F(xiàn)ikes J，Wentworth P，et al.Identificationof potential CTL epitopes of tumor-associated antigen MAGE-1 for five commonHLA-A alleles.Molecular Immunology，1994，311423-1430.Chaux P，Lethe B，Van Snick J，et al.A MAGE-1 peptide recognized on HLA-DR15 by CD4(+)Tcells.Eur J Immunol，2001，31(6)1910-1916.Fujie T，Tahara K，Tanaka F，er al.A MAGE-1-encoded HLA-A24-binding synthetic peptide induces specificanti-tumor cytotoxic T lymphocytes.Int J Cancer，1999，80(2)169-172.)，提示MAGE抗原用于肝癌的免疫治療、腫瘤疫苗的研究均具有良好的應(yīng)用前景。目前，MAGE抗原肽疫苗的研究已在黑素瘤等腫瘤患者中展開臨床試驗(yàn)并已取得一定的療效(Weber JS，Hua FL，Spears L.A phase I trial of an HLA-A1restricted MAGE-3 epitope peptide with incomplete Freund′s adjuvant in patientswith resected high-risk melanoma.J Immunother，1999，22(5)431-440.)。盡管如此，抗原肽疫苗應(yīng)用中也表現(xiàn)出穩(wěn)定性差，抗原表位單一的缺點(diǎn)。對(duì)某一蛋白質(zhì)抗原而言，它不僅含有CTL表位、B細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位，而且還可含有抑制性、與自身抗原交叉反應(yīng)性表位等不利于保護(hù)性免疫的區(qū)段。因此，在疫苗設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)摒棄后者，再者細(xì)胞免疫中真正起作用的是T細(xì)胞表位。表位策略可最大限度減少無關(guān)成分甚至抑制成分的干擾，產(chǎn)生的免疫效果更加特異有效。應(yīng)用單純的肽疫苗有其限制性，如只能與特定HLA類型配合應(yīng)用。如采用多種腫瘤表位聯(lián)合接種，即多表位復(fù)合免疫原策略，可克服腫瘤的免疫逃逸及滿足人群MHC限制性的覆蓋面。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有肽疫苗的缺陷，本發(fā)明公開了一種重組肝癌復(fù)合表位抗原，該抗原具有如序列表中序列1所示的氨基酸序列或序列1所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有與序列1的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。
本發(fā)明還公開了一種具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的重組肝癌復(fù)合表位抗原，該抗原具有序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有與序列2的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。序列2所示氨基酸序列是在序列1所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在其N端增加15個(gè)氨基酸殘基而成。
本發(fā)明還公開了編碼上述具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的重組肝癌復(fù)合表位抗原的核苷酸序列，如序列表中序列30所示。
本發(fā)明還公開了該重組肝癌復(fù)合表位抗原的制備方法。
根據(jù)文獻(xiàn)我們從肝癌中高表達(dá)的多種腫瘤抗原中挑選出AFP、MAGE-1抗原作為模式腫瘤抗原，從中選擇6個(gè)CTL表位作為候選表位，所選擇表位見下表。
表1所選用表位一覽表

根據(jù)Livingston BD等(Livingston BD，Newman M，Crimi C.Optimizationof epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNAvaccines.Vaccine，2001，19(32)4652-4660.)的報(bào)道，緊鄰表位3’端的氨基酸與表位在細(xì)胞內(nèi)的加工遞呈密切相關(guān)，且以堿性氨基酸(K，R)，含有酰胺基氨基酸(N，Q)，小分子氨基酸(C，G，A)等為好。因此構(gòu)建多表位疫苗時(shí)應(yīng)盡量避免在表位C+1位出現(xiàn)不利的氨基酸殘基，以滿足所有表位肽的有效加工遞呈。原則上以-NG-加以連接，個(gè)別下一個(gè)表位第一位是N或小分子時(shí)，可以減少一個(gè)氨基酸。為了充分激活CD4+細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用，我們還在抗原中加入PADRE通用表位。將表位進(jìn)行合理串聯(lián)后，克隆入表達(dá)載體pBVIL1，用于構(gòu)建以T細(xì)胞表位為主的重組肝癌復(fù)合表位抗原。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了T(多CTL表位)和Tat(TatPTD與PADRE)2個(gè)片段進(jìn)行復(fù)合多表位基因的合成，抗原基因的合成采用核心模板法(Donato AD，Nigris M，Russo N，et al.A method for synthesizing genes and cDNAs by the polymerasechain reaction.Analytical Biochemistry，1993，212(1)291-293.)，根據(jù)抗原表位的氨基酸序列和大腸桿菌中高表達(dá)的偏性密碼子，推斷出核苷酸序列加以合成。分別設(shè)計(jì)數(shù)對(duì)不超過58個(gè)堿基的3’端有一段互補(bǔ)重疊的引物，通過幾次PCR反應(yīng)可按設(shè)計(jì)合成抗原的基因。
將T、Tat基因克隆于原核表達(dá)載體pET22b分別構(gòu)建PET/T、PET/Tat，再將測(cè)序正確的pET/Tat載體和PCR產(chǎn)物(P78)用EcoR I和BamH I雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109構(gòu)建pET/Tat+T。將T與Tat+T基因分別亞克隆至原核表達(dá)載體pBVIL1(參見中國(guó)專利申請(qǐng)表達(dá)載體pBVIL1及其構(gòu)建方法和用途，專利號(hào)ZL00100695.9)中，重新構(gòu)建原核表達(dá)載體pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列測(cè)定，證明表達(dá)載體構(gòu)建成功。
將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T分別轉(zhuǎn)化E.coli HB101，然后通過熱誘導(dǎo)培養(yǎng)，取全菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，證明兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒均已獲得了高效的表達(dá)，再經(jīng)離子交換柱及凝膠過濾純化，可獲得兩個(gè)重組肝癌復(fù)合表位抗原的純品，它們的氨基酸序列分別如序列表中序列1和序列2所示。
本發(fā)明還公開了上述重組肝癌復(fù)合表位抗原在制備腫瘤特異性免疫治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)，將Tat+T融合蛋白加入BHK、SP2/0細(xì)胞，進(jìn)行蛋白抗原的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)活性檢測(cè)，結(jié)果表明Tat確具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，Tat+T融合蛋白可跨膜進(jìn)入細(xì)胞漿，而不含TatPTD的T蛋白則不能進(jìn)入細(xì)胞漿。
大量研究結(jié)果表明，細(xì)胞免疫在腫瘤免疫中起了重要作用，而真正特異性殺傷腫瘤的是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，因此以增強(qiáng)機(jī)體CTL應(yīng)答為目標(biāo)的疫苗研究已成為腫瘤疫苗研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)類抗原通常較難產(chǎn)生CTL活性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)類外源性抗原，通常只能進(jìn)入MHC-II類分子加工途徑。為了增強(qiáng)蛋白質(zhì)疫苗的CTL活性本發(fā)明采用了制備基因工程TatPTD融合分子的方法。HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞漿，制備基因工程TatPTD融合分子可介導(dǎo)外源蛋白質(zhì)分子進(jìn)入細(xì)胞，按MHC-I類分子的抗原加工遞呈，因此，本發(fā)明的重組肝癌復(fù)合表位抗原用于肝癌特異性免疫治療，可有望突破蛋白質(zhì)免疫原不易引起CTL活性的瓶頸，發(fā)揮蛋白疫苗安全穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明所制備的重組肝癌復(fù)合表位抗原加上藥學(xué)上可接受的輔料，可以制備腫瘤特異性免疫治療藥物。本發(fā)明設(shè)計(jì)研究的基因工程重組多表位免疫原則具有安全、穩(wěn)定、減少免疫逃避和增加MHC覆蓋面的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，在多個(gè)CTL表位的基礎(chǔ)上，融合了通用DR等位基因表位(Pan-allelic DRepitope，PADRE)能和人類及多種動(dòng)物不同DR分子結(jié)合，遞呈于細(xì)胞表面，進(jìn)而激活CD4+T輔助細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用(Eileen DF，Stephen L H，JohnS et al.Pan DR binding sequence provides T-cell help for induction of protectiveantibodies against Plasmodium yoelii sporozoites.Vaccine，1999，17(9)，1201-1205.)。
本發(fā)明所制備的重組肝癌復(fù)合表位抗原在肝癌特異性免疫治療中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為分步PCR示意圖。
圖2為Tat基因分步PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖譜。其中泳道1為Tat12PCR產(chǎn)物；泳道2為Tat34PCR產(chǎn)物；M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000圖3為T基因分步PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖。其中泳道1為T12PCR產(chǎn)物；泳道2為T34PCR產(chǎn)物；泳道3為T56PCR產(chǎn)物；泳道4為T78PCR產(chǎn)物；M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000圖4為原核表達(dá)載體pBVIL1/T的酶切鑒定圖譜。其中泳道1為pBVIL1/Xho I；泳道2為pBVIL1-T/Xho I；泳道3為pBVIL1-T/Xba I；泳道4為pBVIL1-T/Xba I+Xho I；泳道5為T基因PCR產(chǎn)物；泳道M1為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL15000；泳道M2為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000圖5為原核表達(dá)載體pBVIL1/Tat+T的酶切鑒定圖譜。其中泳道1為pBVIL1/Xho I；泳道2為pBVIL1-TatT/Xho I；泳道3為pBVIL1-TatT/XbaI；泳道4為pBVIL1-TatT/Xba I+Xho I；泳道5為Tat+T基因PCR產(chǎn)物；M1為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL15000；M2為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000圖6為pBVIL1/T的序列分析結(jié)果圖譜。
圖7為pBVIL1/Tat+T的序列分析結(jié)果圖譜。
圖8為Tat+T蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖譜。其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為pBVIL1/Tat+T全菌體；泳道2為pBVIL1/Tat+T超聲破碎上清；泳道3為pBVIL1/Tat+T超聲破碎沉淀；泳道4為純化的Tat+T蛋白。
圖9為Tat+T融合蛋白的跨膜活性的免疫熒光檢測(cè)圖譜。其中a為Tat+T蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的SP2/0細(xì)胞；b為Tat+T蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的BHK細(xì)胞；c為T蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的SP2/0細(xì)胞。
圖10為Tat+T融合蛋白跨膜活性的Western印跡檢測(cè)圖譜。其中泳道1為T蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的SP2/0細(xì)胞；泳道2為SP2/0細(xì)胞；泳道3為Tat+T蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的SP2/0細(xì)胞；泳道4為pBVIL1/Tat+T全菌體對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一肝癌復(fù)合表位抗原的分子設(shè)計(jì)與基因合成一.材料原核表達(dá)載體pET22b為Novagen公司產(chǎn)品；原核表達(dá)載體pBVIL1已經(jīng)申請(qǐng)中國(guó)專利并獲得授權(quán)，專利號(hào)ZL00100695.9，專利名稱“表達(dá)載體pBVIL1及其構(gòu)建方法和用途”，并已經(jīng)進(jìn)行保藏，保藏號(hào)CGMCC No0437；宿主菌大腸桿菌JM109、HB101均為市購(gòu)，本室保存；高保真PyrobestTMDNA聚合酶，DNA限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I、Nde I和HindIII，DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、DL 15000購(gòu)自大連寶生物公司；克隆載體pGEM-T Easy，DNA限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamHI、T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；普通Taq DNA聚合酶為BBI公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大生物公司；GeneAmp PCR System2400PCR擴(kuò)增儀為PE公司產(chǎn)品。
二.方法結(jié)果1.多表位的確定與組裝選取肝癌高表達(dá)的AFP和MAGE-1作為模式腫瘤抗原，選中6個(gè)CTL表位(如表1所示)，考慮到表位間的連接對(duì)表位加工和遞呈的重要性，參照Livingston的報(bào)道，以-NG-為連接臂對(duì)各表位加以連接。
選取HIVTat蛋白的47-57位氨基酸作為融合肽TatPTD序列。
多CTL表位(簡(jiǎn)稱T)的氨基酸序列NYKHCFPEINGKVLEYVIKVNGYLEYRQVPVNGVALQTMKQNGFMNKFIYEINGLSPNLNRFLNGEYVIKVSARVRF(如序列表中序列11所示)TatPTD與通用PADRE表位(簡(jiǎn)稱Tat)的氨基酸序列RHMGYGRKKRRQRRRGEFRGGSAKFVAAWTLKAAAKLR(如序列表中序列12所示)2.引物設(shè)計(jì)與合成將以上多表位和TatPTD的氨基酸序列根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢(shì)表達(dá)密碼子反推出DNA序列，采用核心模板法的方式分步合成基因。設(shè)計(jì)如下PCR引物Tat1-Tat4為合成Tat的引物

其中Tat3引入NdeI酶切位點(diǎn)，Tat4引入HindIII酶切位點(diǎn)。
P1-P10為合成多表位T的引物

其中P7引入EcoR I酶切位點(diǎn)，P8引入BamH I酶切位點(diǎn)，P9引入Nde I酶切位點(diǎn)，P10引入HindIII酶切位點(diǎn)。引物由三博公司合成、純化。
3.PCR法合成基因?qū)⒑铣傻囊锇凑蘸诵哪０宸ㄟM(jìn)行分步PCR(圖1)，具體合成方法是
第1次PCR(反應(yīng)體系為50μl)去離子水32μl，10×PCR Buffer5μl，第1對(duì)引物Tat1、Tat2(P1、P2)各1μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，Mgcl25μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶1μl。PCR反應(yīng)條件95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共5個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；第2次以上PCR(反應(yīng)體系為50μl)去離子水32μl，10×PCRBuffer 5μl，相應(yīng)引物(Tat3與Tat4，P3與P4，P5，P6，依次類推)各1μl，2.5mmol/LdNTPs 4μl，Mgcl25μl，PCR產(chǎn)物(1/50稀釋)1μl為模板，Taq DNA聚合酶1μl。PCR反應(yīng)條件95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。1.2％瓊脂糖DNA凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
Tat基因的由2步PCR獲得，Tat12，Tat34PCR產(chǎn)物的大小分別為88bp和114bp(圖2)；T基因采用4步PCR合成，各步PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小分別為T12 88bp，T34 155bp，T56 225bp，T78(T910)249bp(圖3)。
PCR產(chǎn)物的純化使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(博大公司)按說明書方法純化。
4.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建小量提取原核表達(dá)載體pET22b的質(zhì)粒DNA與PCR產(chǎn)物用Nde I和HindIII進(jìn)行雙酶切。將表達(dá)載體與目的片段按1∶3比例于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，氨芐青霉素抗性篩選克隆，構(gòu)建pET/T和pET/Tat表達(dá)載體。將測(cè)序正確的pET/Tat重組載體和PCR(P7，P8)產(chǎn)物用EcoR I和BamH I限制性內(nèi)切酶雙酶切，將回收的載體與PCR產(chǎn)物按1∶3比例于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，氨芐青霉素抗性篩選克隆，構(gòu)建pET/Tat+T表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)pET/Tat+T序列設(shè)計(jì)合成引物，將多表位和含Tat融合肽的基因重組于原核表達(dá)載體pBVIL I中，引物設(shè)計(jì)如下I1如序列表中序列27所示；I2如序列表中序列28所示；I3如序列表中序列29所示其中I1、I3引入Xho I酶切位點(diǎn)，I2引入Xba I酶切位點(diǎn)，6個(gè)His及終止密碼子。
引物由三博公司合成、純化。引物I1、I2擴(kuò)增Tat+T基因片段，引物I3、I2擴(kuò)增T基因。反應(yīng)體系(50μl)中加入10×Pyrobest Buffer 5μl，dNTP(2.5mM)4μl，引物F(10μM)1μl，引物R(10μM)1μl，pET/Tat+T模板1μl，Pyrobest DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，去離子水至50μl。擴(kuò)增參數(shù)如下95℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s、72℃30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
將PCR(I1、I2和I3、I2)產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pBVIL I用Xho I和XbaI限制性內(nèi)切酶雙酶切，將回收的載體與PCR產(chǎn)物于室溫連接3h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，氨芐青霉素抗性篩選克隆，進(jìn)行pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的酶切(圖4，圖5)及DNA序列鑒定(圖6，圖7)。Tat+T抗原的氨基酸序列及其基因序列如序列表中序列2和序列30所示。
實(shí)施例二肝癌復(fù)合表位抗原的表達(dá)與純化一.材料SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為上海生化所產(chǎn)品；層析介質(zhì)SephadexG-50、Q-Sepharose Fast Flow、S-Sepharose Fast Flow為Pharmacia公司產(chǎn)品；Kodak自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)；BIO-RAD蛋白電泳儀。余同上。
二.方法結(jié)果1.抗原的表達(dá)與純化1.1表達(dá)菌株的培養(yǎng)挑取單個(gè)克隆于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1％接種量接種于LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37℃活化至A值達(dá)0.4-0.6時(shí)，42℃水浴搖床繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集菌體。取1ml誘導(dǎo)后的菌體沉淀，重懸于1×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，1000r/min離心3min，取10μl裂解液進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，再用脫色液脫色后觀察重組蛋白的表達(dá)，選取表達(dá)量最高的作為蛋白純化的工程菌。
取-70℃保存的工程菌株20μl接種于LB培養(yǎng)基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5％的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)，30℃空氣搖床培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)A600值達(dá)到0.5時(shí)，立即將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到42℃水浴搖床中，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。收集菌體，6000r/min離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。
1.2提取包涵體將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/L pH8.0TE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(1mg/ml懸液)，室溫下磁力攪拌10分鐘。于冰浴中超聲破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8℃12000r/min離心20分鐘，棄上清，沉淀用1mol/LNaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用pH8.0TE配制)溶解，加1％β-巰基乙醇。再于20℃12000r/min離心10分鐘，去沉淀取上清。
1.3純化將上述溶解的包涵體溶液過Q-Sepharose FF陰離子交換柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巰基乙醇)洗，收集未結(jié)合部分，再過S-Sepharose FF陽(yáng)離子交換柱，用平衡液清洗后，用不同濃度的NaCl(用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.1mol/L NaCl洗脫峰。再過Sephardex G-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰，得到Tat+T的純化蛋白(圖8)。
實(shí)施例三肝癌復(fù)合表位抗原的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)活性檢測(cè)一.材料Tat+T、T純化蛋白實(shí)施例二中制備；金黃地鼠腎BHK細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0市購(gòu)，本室保存；RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基為GibcoBRL公司產(chǎn)品；精制胎牛血清購(gòu)自黑龍江同江市江海生物高新技術(shù)開發(fā)責(zé)任有限公司；BIO-RAD蛋白電泳儀；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自中山公司；抗His單克隆抗體為Invitrogen公司產(chǎn)品；Western印跡用PVDF膜為Pharmacia公司產(chǎn)品；ECL系統(tǒng)購(gòu)自Pierce公司。余同上。
二.方法結(jié)果將Tat+T融合蛋白加入含BHK、SP2/0細(xì)胞的6孔板，37℃孵育2h，收集并洗滌細(xì)胞，分別制樣進(jìn)行間接免疫熒光法和Western印跡檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立不含Tat的T融合蛋白作為對(duì)照。結(jié)果表明Tat+T融合蛋白均能進(jìn)入BHK、SP2/0細(xì)胞，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，且SP2/0細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與轉(zhuǎn)導(dǎo)效率略高于BHK細(xì)胞，而不含Tat的T融合蛋白在BHK、SP2/0細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)熒光(圖9)。
將收獲的細(xì)胞裂解后進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳，Western印跡檢測(cè)Tat融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，同時(shí)設(shè)立不含TatPTD的T融合蛋白作為陰性對(duì)照，設(shè)立原核表達(dá)載體pBVIL1/Tat+T誘導(dǎo)表達(dá)的全菌體作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果Tat+T融合蛋白組出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子量大小一致的反應(yīng)條帶，不含Tat的T融合蛋白組未出現(xiàn)此條帶(圖10)。上述結(jié)果表明，Tat融合蛋白具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，可使Tat+T融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿，而不含TatPTD的T融合蛋白則不具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>一種重組肝癌復(fù)合表位抗原，其制備方法及在制備肝癌特異免疫治療藥物中的應(yīng)用<130>
<160>30<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>92<212>PRT<213>
<400>1Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Asn Gly Lys Val Leu Glu Tyr1 5 10 15Val Ile Lys Val Asn Gly Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Val Asn20 25 30Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Asn Gly Phe Met Asn Lys Phe35 40 45Ile Tyr Glu Ile Asn Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Asn50 55 60Gly Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg Val Arg Phe Gly Ser Ala65 70 75 80Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala85 90<210>2<211>107<212>PRT<213>
<400>2Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Glu Phe Asn1 5 10 15Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Asn Gly Lys Val Leu Glu Tyr Val20 25 30Ile Lys Val Asn Gly Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Val Asn Gly35 40 45Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Asn Gly Phe Met Asn Lys Phe Ile50 55 60Tyr Glu Ile Asn Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Asn Gly
65 70 75 80Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg Val Arg Phe Gly Ser Ala Lys85 90 95Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala100 105<210>3<211>9<212>PRT<213>
<400>3Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>
<400>4Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>
<400>5Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Val1 5<210>6<211>12<212>PRT<213>
<400>6Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg Val Arg Phe1 5 10<210>7<211>9<212>PRT<213>
<400>7Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln1 5<210>8<211>9
<212>PRT<213>
<400>8Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile1 5<210>9<211>10<212>PRT<213>
<400>9Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu1 5 10<210>10<211>13<212>PRT<213>
<400>10Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>11<211>77<212>PRT<213>
<400>11Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Asn Gly Lys Val Leu Glu Tyr1 5 10 15Val Ile Lys Val Asn Gly Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Val Asn20 25 30Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Asn Gly Phe Met Asn Lys Phe35 40 45Ile Tyr Glu Ile Asn Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Asn50 55 60Gly Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg Val Arg Phe65 70 75<210>12<211>38<212>PRT<213>
<400>12Arg His Met Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly1 5 10 15
Glu Phe Arg Gly Gly Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys20 25 30Ala Ala Ala Lys Leu Arg35<210>13<211>50<212>DNA<213>
<400>13acggtcgtaa gaaacgtcgt cagcgtcgtc gtggtgaatt ccgtggtgga50<210>14<211>50<212>DNA<213>
<400>14gcagctttaa gagtccacgc cgcaacgaat ttcgcggatc caccacggaa50<210>15<211>25<212>DNA<213>
<400>15cgccatatgg gttacggtcg taaga 25<210>16<211>25<212>DNA<213>
<400>16gcgaagctta gccgcagctt taaga 25<210>17<211>49<212>DNA<213>
<400>17gtaccggcag gtgccggtga atggtgtagc gctgcaaacg atgaagcag 49<210>18<211>50<212>DNA<213>
<400>18ttgatctcgt agatgaactt gttcatgaaa ccgttctgct tcatcgtttg50<210>19<211>50<212>DNA<213>
<400>19ccttgagtat gtcattaagg tcaatggtta cctggagtac cggcaggtgc50<210>20<211>50<212>DNA<213>
<400>20catttaagaa cctgtttagg tttggagaca gaccgttgat ctcgtagatg50<210>21<211>50<212>DNA<213>
<400>21tacaagcact gcttccctga gatcaatggt aaagtccttg agtatgtcat50<210>22<211>50<212>DNA<213>
<400>22gcgaactctt gcactgacct tgatcacata ctcaccattt aagaacctgt50<210>23<211>27<212>DNA<213>
<400>23cgcgaattca attacaagca ctgcttc 27<210>24<211>27<212>DNA<213>
<400>24cgcggatcca aagcgaactc ttgcact 27<210>25<211>27<212>DNA<213>
<400>25cgccatatga attacaagca ctgcttc 27<210>26<211>27<212>DNA<213>
<400>26cgcaagctta aagcgaactc ttgcact 27<210>27
<211>25<212>DNA<213>
<400>27cgcctcgagg gttacggtcg taaga 25<210>28<211>46<212>DNA<213>
<400>28cgctctagat tagtggtggt ggtggtggtg agccgcagct ttaaga 46<210>29<211>27<212>DNA<213>
<400>29cgcctcgaga attacaagca ctgcttc27<210>30<211>321<212>DNA<213>
<400>30ggttacggtc gtaagaaacg tcgtcagcgt cgtcgtggtg aattcaatta caagcactgc60ttccctgaga tcaatggtaa agtccttgag tatgtcatta aggtcaatgg ttacctggag120taccggcagg tgccggtgaa tggtgtagcg ctgcaaacga tgaagcagaa cggtttcatg180aacaagttca tctacgagat caacggtctg tctccaaacc taaacaggtt cttaaatggt240gagtatgtga tcaaggtcag tgcaagagtt cgctttggat ccgcgaaatt cgttgcggcg300tggactctta aagctgcggc t 32權(quán)利要求
1.一種重組肝癌復(fù)合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列或序列1所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有與序列1的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組肝癌復(fù)合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3.一種具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的重組肝癌復(fù)合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有與序列2的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的重組肝癌復(fù)合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求4所述具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的重組肝癌復(fù)合表位抗原的基因，其特征在于具有序列表中序列30所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1或3所述重組肝癌復(fù)合表位抗原的制備方法，包括如下步驟(1)引物設(shè)計(jì)與合成；(2)PCR合成基因；(3)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；(4)重組肝癌復(fù)合表位抗原的表達(dá)與純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中PCR合成基因采用的是核心模板法，通過分步PCR合成。
8.權(quán)利要求1或3所述重組肝癌復(fù)合表位抗原在制備腫瘤特異性免疫治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組肝癌復(fù)合表位抗原，還公開了其制備方法及在制備肝癌特異免疫治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組肝癌復(fù)合表位抗原具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，含有多個(gè)腫瘤抗原T細(xì)胞表位，應(yīng)用基因合成和分子克隆技術(shù)獲得，具有安全穩(wěn)定，減少免疫逃避等優(yōu)點(diǎn)，在肝癌特異性免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1958606SQ20051011683
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日
發(fā)明者何競(jìng), 凌世淦, 張賀秋, 宋曉國(guó), 王國(guó)華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所