用于身體重構(gòu)和身體成形的受控釋放脂肪酸組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含生理上可接受的代謝脂質(zhì)和生理上可接受的、優(yōu)選可生物降解的受控釋放(CR)化合物的組合物，其中所述脂質(zhì)是無細(xì)胞的且所述CR?化合物在生理條件下經(jīng)延遲時間段釋放所述代謝脂質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及這樣的組合物用于生產(chǎn)美容或治療組合物、優(yōu)選用于脂肪組織膨脹或脂肪組織修復(fù)的用途。此外，本發(fā)明涉及用于治療或美容性處理哺乳動物的方法，其包括施用本發(fā)明的組合物，和優(yōu)選注射所述組合物，同時撤回注射針，直到目的組織區(qū)域得到處理。
【專利說明】用于身體重構(gòu)和身體成形的受控釋放脂肪酸組合物
[0001]本發(fā)明涉及包含生理上可接受的代謝脂質(zhì)和生理上可接受的、優(yōu)選可生物降解的受控釋放(CR)化合物的組合物，其中所述脂質(zhì)是無細(xì)胞的且所述CR-化合物在生理條件下經(jīng)延遲時間段釋放所述代謝脂質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及這樣的組合物用于生產(chǎn)美容或治療組合物、優(yōu)選用于脂肪組織膨脹或脂肪組織修復(fù)的用途。此外，本發(fā)明涉及用于治療或美容性處理哺乳動物的方法，其包括施用本發(fā)明的組合物，和優(yōu)選注射所述組合物，同時撤回注射針，直到目的組織區(qū)域得到處理。
[0002]發(fā)明背景
脂肪組織儲存能量，提供隔絕且限定外部結(jié)構(gòu)特征，例如，在哺乳動物的面部、乳房、臀部或任何其它限定身體部分的形式。除了美容期望以外，還有用于脂肪組織工程改造和重構(gòu)(例如乳房切除后的乳房重構(gòu)、HIV-誘導(dǎo)的脂質(zhì)營養(yǎng)不良和創(chuàng)傷后的面部重構(gòu))的治療應(yīng)用。
[0003]用于治療脂肪組織缺陷和用于美容組織增加的傳統(tǒng)方法采用替代或添加體積至靶向身體部分的填充材料。所述填充材料被分類為自體填料和非自體填料。
[0004]自體脂肪移植，即從一部分手術(shù)分離脂肪細(xì)胞且再注入身體的另一部分，從19世紀(jì)晚期以來已實施。向面部的自體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有其永久性質(zhì)的優(yōu)點，且基于自體脂肪的注射導(dǎo)致復(fù)原面部的更柔軟和發(fā)光的面容。另一方面，一個主要缺點是主要由于注射后脂肪細(xì)胞的不同存活率而導(dǎo)致的結(jié)果的不可預(yù)測性。例如，對于注入脂肪組織區(qū)域(例如面部或乳房)的脂肪細(xì)胞，30-70%死亡，主要是因為在血管生成前狀態(tài)下不存在營養(yǎng)素和氧。另一個問題是脂肪細(xì)胞在分離過程中的存活率。該問題已經(jīng)通過多種技術(shù)(諸如使用抽吸針和分離的脂肪細(xì)胞的專門治療)得到改善。該技術(shù)的另一個缺點在于，它需要手術(shù)干預(yù)和足量的自體脂肪細(xì)胞材料，這對于許多個體不可得的。
[0005]脂肪組織工程改造的一種更現(xiàn)代的做法是注射脂肪來源的干細(xì)胞(ADSC)，其引起新脂肪細(xì)胞的增殖。然而，該方法涉及漫長、復(fù)雜且昂貴的程序，其包括吸脂，通過專門的超速離心從脂肪細(xì)胞分離ADSC，任選地用分化因子處理分離的ADSC，和將分化的細(xì)胞回注入所需目標(biāo)組織。
[0006]因為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞存活問題，設(shè)想各種非細(xì)胞填充材料。膠原是市場上最廣泛使用的填料，直到2003年透明質(zhì)酸的出現(xiàn)。膠原因為其牛來源而誘導(dǎo)輕微的免疫原性反應(yīng)，且由于新近意識到牛海綿狀腦病(BSE)的風(fēng)險，該技術(shù)走向終結(jié)。透明質(zhì)酸(HA)已多年用作非處方(off prescript1n)脂肪組織填料，即使它非常晚在2003年才被FDA批準(zhǔn)。它已成為市場上最有優(yōu)勢的填料?，F(xiàn)代商業(yè)的HA與基于二乙烯基砜的化合物高度交聯(lián)，用于增加半衰期，并且是重組的，而不是動物來源的，用于降低免疫性。HA的主要缺點是其注射后壽命有限。大多數(shù)基于HA-填料僅持續(xù)3至12個月。關(guān)于基于硅的植入物，使用HA用于豐胸可干擾基于乳房成像術(shù)的癌癥檢測。與HA相關(guān)的其它潛在問題是肉芽腫發(fā)展、結(jié)節(jié)形成和乳腺痛、植入物可觸知性、囊收縮、淺表感染和膿腫發(fā)展的更高頻率和風(fēng)險。
[0007]也已知雌激素的局部和全身施用通過脂肪組織生成的雌激素受體誘導(dǎo)而增加女性的乳房大小。已知安體舒通由于其抗雄激素性質(zhì)而誘導(dǎo)乳房發(fā)育和女性化。
[0008]用于從頭脂肪組織生成的另一種方法是通過PLGA/PEG微球體長期局部遞送胰島素和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，并且這已經(jīng)在體內(nèi)大鼠模型中進(jìn)行測試(Yuksel等人，Plastic & Reconstructive surgery, vol.105(5),2000年4月，1712 - 1720)，其中將含有胰島素和IGF-1的微球體直接施用于大鼠腹壁的深肌筋膜以評估它們經(jīng)由從非脂肪細(xì)胞合并物脂肪形成分化而從頭生成脂肪組織的潛能。所述微球體作為提供蛋白的長期局部遞送的受控釋放(CR)化合物發(fā)揮功能，所述蛋白誘導(dǎo)在施用部位的脂肪組織的從頭生成。
[0009]總之，用于治療脂肪組織缺陷和用于美容脂肪組織增加的現(xiàn)有技術(shù)要求脂肪細(xì)胞或脂肪來源的干細(xì)胞(ADSC)的自體轉(zhuǎn)移，非細(xì)胞、非永久填料的局部施用，或者可選地，月旨肪細(xì)胞分化和生長因子的局部施用。
[0010]本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于治療脂肪組織缺陷和用于美容脂肪組織增加的組合物，其在技術(shù)上容易產(chǎn)生和施用，需要最少的手術(shù)干預(yù)，并且是安全和節(jié)約成本的。
[0011]在第一方面，本發(fā)明的根本問題通過提供組合物而得到解決，所述組合物包含(i)生理上可接受的代謝脂質(zhì)，和(ii)生理上可接受的、優(yōu)選可生物降解的受控釋放(CR)化合物，其中所述代謝脂質(zhì)是無細(xì)胞的且所述CR化合物在生理條件下經(jīng)延遲時間段釋放所述代謝脂質(zhì)。
[0012]如本文所使用，術(shù)語受控釋放(CR)，是指配制活性化合物以控制活性化合物可用性的技術(shù)，例如定時釋放，諸如例如持續(xù)(延長)釋放、脈沖釋放、延遲釋放等，及其組合。通常的CR應(yīng)用是養(yǎng)料(fertilizers)、化妝品和藥物。用于本發(fā)明中使用的CR化合物是與所述脂質(zhì)和任選其它生理活性的化合物一起配制的化合物，當(dāng)施用于生理環(huán)境、優(yōu)選人體組織部分諸如面部、乳房、臀部等的部分時，與CR化合物不存在的情況下相比，所述化合物延遲所述脂質(zhì)和活性化合物的釋放。
[0013]用于本發(fā)明中使用的CR化合物和代謝脂質(zhì)應(yīng)當(dāng)是生理上可接受的，S卩，對被處理的組織基本上無毒。進(jìn)一步優(yōu)選的是，本發(fā)明的CR化合物是基本上可生物降解的，S卩，它們隨著時間被移除并優(yōu)選從施用部位代謝。
[0014]CR化合物在生理條件下經(jīng)延遲時間段釋放代謝脂質(zhì)和任選其它活性化合物。如本發(fā)明的上下文中本文所提及，生理條件，是在施用的組織部位的體內(nèi)條件，例如脂肪組織條件。
[0015]CR化合物對于代謝脂質(zhì)和任選其它活性化合物的釋放概況沒有限制，并且取決于所述組合物的配方，以及目標(biāo)組織和施用的模式和頻率。通常，初始突釋、隨后穩(wěn)態(tài)釋放起始脂肪細(xì)胞生長和/或增殖，同時維持生理有效水平的代謝脂質(zhì)和任選所需活性化合物。
[0016]在一個優(yōu)選實施方案中，所述CR化合物經(jīng)7天至12個月、優(yōu)選30至90天、更優(yōu)選50至70天、最優(yōu)選約60天的延遲時間段釋放代謝脂質(zhì)和任選其它活性化合物。
[0017]用于本發(fā)明的組合物中使用的代謝脂質(zhì)是無細(xì)胞的，這意味著它們不形成活細(xì)胞或死細(xì)胞的部分，并且它們基本上不含細(xì)胞組分諸如膜、核、核酸等。無細(xì)胞代謝脂質(zhì)具有以下優(yōu)點:它們是更低免疫原性的，藥理學(xué)安全的且更易被細(xì)胞諸如目標(biāo)組織中的細(xì)胞吸收。
[0018]親脂性是指化學(xué)化合物溶解于脂肪、油、脂質(zhì)和非極性溶劑諸如己烷或甲苯的能力。如本文所使用，術(shù)語代謝脂質(zhì)被定義為任何以下化合物:所述化合物是親脂性的，并且可以被細(xì)胞、優(yōu)選被脂肪組織中的細(xì)胞、更優(yōu)選被脂肪細(xì)胞攝入、儲存和代謝用于產(chǎn)生細(xì)胞能量，例如ATP。
[0019]本發(fā)明的組合物可以局部施用，例如通過注射，優(yōu)選多次且均勻分布注射，局部施用入組織，用于治療脂肪組織缺陷和用于美容脂肪組織增加。
[0020]釋放的代謝脂質(zhì)對被處理的組織具有許多有益效果。與分離的細(xì)胞(例如脂肪細(xì)胞和ADSC)相反，代謝脂質(zhì)是較低免疫原性的，它們不包含有害組分，諸如牛來源的膠原(BSE)，并且它們可以被目標(biāo)細(xì)胞直接和快速攝入。本發(fā)明組合物對目標(biāo)組織中的脂肪細(xì)胞和其它細(xì)胞的直接和有利的效果在于，這些細(xì)胞是連續(xù)“超喂的(superfed)”，導(dǎo)致體積增加。
[0021]為了進(jìn)一步幫助目標(biāo)組織的生長，本發(fā)明的組合物可以包含其它活性化合物，優(yōu)選脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物化合物，其將在大小和數(shù)量方面增加脂肪細(xì)胞，即刺激脂肪細(xì)胞生長和脂肪形成，即前脂肪細(xì)胞脂肪分化為脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞體積生長。
[0022]在一個更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物，優(yōu)選選自以下的脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物
a.胰島素，胰島素生長因子結(jié)合蛋白I至7(IGFBP1_7)，胰島素生長因子I(IGF-1)和胰島素生長因子2(IGF-2)，優(yōu)選胰島素，胰島素生長因子I(IGF-1)和胰島素生長因子2(IFG-2)，更優(yōu)選胰島素和胰島素生長因子I(IGF-1)，最優(yōu)選人胰島素；
b.成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，優(yōu)選FGF-1、FGF-2、FGF-10和FGF-21，更優(yōu)選FGF-1和FGF-2，最優(yōu)選FGF-1;
c.糖皮質(zhì)激素，優(yōu)選選自皮質(zhì)醇、可的松、潑尼松、潑尼松龍、曲安西龍、甲潑尼龍、地塞米松和倍他米松，優(yōu)選塞米松和倍他米松；
d.環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)活化劑，優(yōu)選選自氨茶堿、丙戊茶堿、茶堿、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、毛喉素和脫氫樅酸(DAA)，優(yōu)選氨茶堿、丙戊茶堿和茶堿；
e.過氧化物酶體增殖物-活化受體γ-2(PPAR γ 2)激動劑，優(yōu)選噻唑烷二酮類化合物，更優(yōu)選選自吡格列酮、曲格列酮、羅格列酮和吲哚美辛，優(yōu)選曲格列酮和羅格列酮；
f.骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，優(yōu)選81^-2、81^-4、81^-7和81^-9，優(yōu)選81^-2和81^-4。
[0023]—些目標(biāo)組織包含腺體組織或鄰近位于腺體組織，特別是女性乳房中。優(yōu)選的是，目標(biāo)組織鄰近或周圍的腺體組織與脂肪組織一起生長，使得結(jié)果整體而言更均勻、天然和審美上令人愉悅的。
[0024]在一個更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物是專門配制用于乳房目標(biāo)組織的生長的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種腺體生長效應(yīng)物，優(yōu)選乳腺腺體生長效應(yīng)物，更優(yōu)選選自以下的腺體生長因子
a.雌二醇和雌二醇衍生物，優(yōu)選選自雌二醇苯甲酸酯、雌二醇半水合物、雌二醇乙酸酯、雌二醇環(huán)戊丙酸酯、雌二醇戊酸酯、乙炔基雌二醇和17β_雌二醇，更優(yōu)選雌二醇和雌二醇環(huán)戊丙酸酯，最優(yōu)選17β_雌二醇；
b.表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、表皮調(diào)節(jié)蛋白(EPR)、表皮細(xì)胞有絲分裂蛋白(epigen)、乙胞素(BTC)、所有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRGl)同種型、調(diào)蛋白(HRG)、乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF))、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG2)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG3)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_4(NRG4)、肝素-結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)和雙調(diào)蛋白(AR)，優(yōu)選表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG4)、肝素-結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)和雙調(diào)蛋白(AR)，更優(yōu)選人表皮生長因子(EGF);
c.抗雄激素，優(yōu)選選自比卡魯胺、尼魯米特、安體舒通和氟他米特，更優(yōu)選安體舒通和氟他米特。
[0025]在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，用于在本發(fā)明中使用的代謝脂質(zhì)包含脂肪酸，優(yōu)選選自丁酸和更長鏈脂肪酸的脂肪酸，更優(yōu)選選自戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸，十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二 i^一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十五烷酸、二十六烷酸、二十七烷酸、二十八烷酸、二十九烷酸、三十烷酸、三i^一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、反亞油酸(linoelaidic acid)、亞麻酸、優(yōu)選α-亞麻酸、花生四稀酸、二十碳五稀酸、芥酸、二十二碳六稀酸、十八碳四稀酸、二十二碳五稀酸、二十碳四稀酸和二十二碳六稀酸，更優(yōu)選選自十八烷酸、十二烷酸、十六烷酸和油酸的脂肪酸，最優(yōu)選十六烷酸、十八烷酸和油酸。
[0026]在進(jìn)一步優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明中使用的生理上可接受的、優(yōu)選可生物降解的CR化合物選自聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚乳酸(PLA)，聚己內(nèi)酯(PCL)，泊洛沙姆，聚乙二醇(PEG) -PLGA共聚物，PEG和PLGA的組合，PLA和PEG的組合，優(yōu)選PLA-PEG-PLA，PLGA和泊洛沙姆的組合，葡聚糖，藻酸鹽和聚甲基丙烯酸酯，優(yōu)選PLA、PLGA和PEG-PLGA組合，更優(yōu)選PLGA和PLA，最優(yōu)選PLGA。
[0027]以下描述本發(fā)明的組合物的最優(yōu)選、但非限制性實施方案。
[0028]在最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)組合物，優(yōu)選無脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物或腺體生長效應(yīng)物，包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、十六烷酸和/或油酸和任選維生素C和/或E，優(yōu)選包含
(i) PLGA，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?)十六烷酸和/或油酸，優(yōu)選與白蛋白締合，和 (iii)維生素C和/或E。
[0029]在進(jìn)一步最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)具有至少一種脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、十六烷酸和/或油酸、胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松和任選維生素C和/SE，優(yōu)選包含
(i) PLGA，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?)油酸和/或十六烷酸，優(yōu)選與白蛋白締合，
(iii)人重組胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松和維生素C和/或E。
[0030]在進(jìn)一步最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)具有至少一種脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物和至少一種腺體生長因子的組合物，優(yōu)選用于乳房治療的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、十六烷酸和/或油酸、胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、EGF-1、安體舒通、雌二醇和任選維生素C和/或E，優(yōu)選包含
(i) PLGA，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?)十六烷酸和/或油酸，優(yōu)選與白蛋白締合，
(iii)人重組胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、EGF-1、安體舒通、雌二醇和維生素C和/或E。
[0031]在進(jìn)一步最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)具有至少一種脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物和至少一種雌激素生長因子的組合物，優(yōu)選用于面部治療的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、十六烷酸和/或油酸、胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、雌二醇和任選維生素C和/或E，優(yōu)選包含
(i) PGLA，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?)油酸和/或十六烷酸，優(yōu)選與白蛋白締合，
(iii)人重組胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、雌二醇和維生素C和/或E。
[0032]本發(fā)明的組合物用于治療或美容性處理中使用，并且可以任選包含其它生理上可接受的賦形劑和稀釋劑。
[0033]因此，并且在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物用于生產(chǎn)美容或治療組合物、優(yōu)選用于脂肪組織膨脹或脂肪組織修復(fù)的用途。
[0034]在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物用于脂肪組織膨脹，優(yōu)選脂肪組織體積膨脹，更優(yōu)選用于臉部組織、臀部和/或乳房。
[0035]在更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療或美容性處理選自以下的狀況 (i)選自身體畸形，優(yōu)選創(chuàng)傷后疤痕、乳房重構(gòu)和軟組織凹陷；先天性畸形，優(yōu)選漏斗狀胸畸形、乳房不對稱(例如波蘭綜合征)、偏側(cè)綜合征(例如CLOVE綜合征、Romberg綜合征)；靠近假肢的畸形，再形成輻射后大腿缺陷、HIV脂肪代謝障礙、輕度腭咽閉合不全的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥;和
(?)選自美容脂肪組織增加，優(yōu)選乳房、臀部、臉部、生殖器、手和腿的脂肪組織增加，以及醫(yī)源性畸形，優(yōu)選修復(fù)周圍的凹凸，吸脂畸形和植入物畸形的非醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。
[0036]在最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療或美容性處理醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥而用于乳房切除術(shù)后的乳房重構(gòu)或乳房或臀部增大。
[0037]在進(jìn)一步最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療或美容性處理選自以下的狀況:(I)選自創(chuàng)傷后的面部重構(gòu)和畸形，優(yōu)選痤瘡疤痕、HIV誘導(dǎo)的脂肪代謝障礙、疤痕的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥;和(II)選自美容面部增大，優(yōu)選對于臉頰、眉、前額、眉間、嘴唇、嘴角紋、鼻唇溝皺褶、鼻、眼周皺褶和凹陷眼瞼畸形的美容面部增大的非醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。
[0038]本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及用于治療或美容性處理哺乳動物、優(yōu)選人、更優(yōu)選美容或治療性處理上面引用的化妝和治療狀況之一的方法，其包括以下步驟
(i)提供本發(fā)明的組合物，
(?)任選地將麻醉局部施用于待處理的組織，
(iii)注射施用所述組合物，優(yōu)選注射所述組合物、同時撤回注射針，
(iv)任選地重復(fù)步驟(iii)，直到整個組織得到處理。
[0039]在下面，本發(fā)明將通過具體實施方案的方式進(jìn)一步說明，所述具體實施方案無一被解釋為限制隨附權(quán)利要求的范圍。
[0040]附圖
圖1(A)是鈍尖插管插入乳房的側(cè)視圖的示意圖，其顯示釋放根據(jù)本發(fā)明的液體組合物的小等分試樣，同時連續(xù)撤回針。
[0041]圖1(B)是乳房的頂視圖的示意圖，其中從乳暈邊緣上的兩個點之一或在乳房下皺襞處的兩個點之一在可變的方向和平面插入針以獲得彌散且均勻的分布。
[0042]圖2顯示這樣的圖，其描繪在與許多不同的根據(jù)本發(fā)明的脂肪酸-CR化合物一起孵育后由3T3-LI細(xì)胞(P9)攝取的甘油三酯的濃度，其中所述CR化合物控制共同配制的組合物的釋放。星號表示相對于對照的統(tǒng)計學(xué)意義。詳細(xì)程序根據(jù)實施例11所述。
[0043]根據(jù)實施例4產(chǎn)生組合物，其被指定為油酸_PLGA(50:50),油酸_PLGA(65:35)、油酸-PLA( PLA:摩爾重量=50,000),十七烷酸_PLGA( 50:50),十六烷酸_PLGA( 50:50),癸酸-PLGA(50:50)和二十二烷酸-PLGA( 50:50)。
[0044]對照由根據(jù)實施例5制成的空微球體組成。
[0045]圖3顯示這樣的圖，其描繪3T3-L1細(xì)胞(P9)中的甘油三酯的濃度，其中未分化的3T3-L1細(xì)胞用PLGA-胰島素+ PLGA-地塞米松+ PLGA-油酸處理且針對用細(xì)胞培養(yǎng)基+空PLGA微球體處理的細(xì)胞(對照)進(jìn)行比較。將其引入兩天后，各組用已包封胰島素和油酸的培養(yǎng)基進(jìn)行處理。詳細(xì)程序按照實施例12所述。
[0046]根據(jù)實施例4、6和8產(chǎn)生被指定為微球體的組合物。
[0047]根據(jù)實施例5產(chǎn)生被指定為對照的組合物。
[0048]圖4顯示這樣的圖，其指定處理后15天未經(jīng)處理(未經(jīng)處理，對照)、向腹股溝脂肪墊內(nèi)注射CMC載體(對照)、向腹股溝脂肪墊內(nèi)注射根據(jù)實施例5的空微球體(空，對照)和向腹股溝脂肪墊內(nèi)注射根據(jù)實施例4的包含油酸的微球體和載體(油酸)的Balb-c裸小鼠的腹股溝脂肪墊的體積。表示與對照相比的統(tǒng)計學(xué)意義。
[0049]圖5顯示這樣的圖，其指定處理后30天未經(jīng)處理(未經(jīng)處理，對照)、向腹股溝脂肪墊內(nèi)注射CMC載體(對照)、向腹股溝脂肪墊內(nèi)注射根據(jù)實施例5的空微球體(空，對照)和向腹股溝脂肪墊內(nèi)注射根據(jù)實施例4的包含油酸的微球體和載體(油酸)的Balb-c裸小鼠的腹股溝脂肪墊的體積。表示與對照相比的統(tǒng)計學(xué)意義。
[0050]圖6(A)和(B)顯示用不具有(A)和具有(B)油酸的PLGA微球體處理后15天，根據(jù)實施例13的PLGA微球體處理的腹股溝脂肪墊的CT掃描照片。
[0051]實施例1-本發(fā)明的組合物
對于以下組合物的各組分引用的范圍涉及用于處理患者中的一個組織區(qū)域的組合物中的各化合物的量和活性單元，并且應(yīng)理解，所述量和活性單位將隨著患者、具體目標(biāo)組織、組織表面積和體積、待治療的狀況、待獲得的效果等而變化。
[0052]組合物A
(i) 100-200 g可生物降解的PLGA微球體，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?) 100-500 g與白蛋白締合的油酸和/或十六烷酸，和
(iii)2-20 mg維生素C和/或E。
[0053]組合物A特別適合于臨時脂肪組織增加，因為其缺乏脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物，并且在一段時間之后，增加結(jié)果已經(jīng)過，例如數(shù)周至數(shù)月，超喂的(superfed)和體積增加的細(xì)胞可能用盡代謝脂質(zhì)或?qū)⒋x脂質(zhì)提供給其它細(xì)胞。維生素E的作用在于，其充當(dāng)特別用于制劑中的基于脂質(zhì)的組分的防腐劑和抗氧化劑。
[0054]組合物B
(i)100-200 g可生物降解的PLGA微球體，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(ii)100-500 g與白蛋白締合的油酸和/或十六烷酸；
(iii)50-100 IU人重組胰島素;
(iv)200-400 yg FGF-1;
(V) 2-10 mg羅格列酮;
(vi)1000-2000 yg倍他米松和
(vii)2-20 mg維生素C和/或E。
[0055]組合物B特別適合于永久脂肪組織增加，因為其包括脂肪細(xì)胞生長因子(iii)至(vi)，其刺激脂肪生成，即，前脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的增殖。
[0056]組合物C
(i) 100-200 g可生物降解的PLGA微球體，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?) 100-500 g與白蛋白締合的油酸和/或十六烷酸；
(iii)50-100 IU人重組胰島素;
(iv)200-400 yg FGF-1；
(V) 2-10 mg羅格列酮;
(vi)1000-2000 yg倍他米松;
(vii)200-400 yg EGF-1；
(viii)50-200 mg安體舒通;
(ix)2-4 mg 17 γ-雌二醇和(X) 2-20 mg維生素C和/或E。
[0057]組合物C特別適合于乳房脂肪組織增加，因為其包括刺激脂肪生成的脂肪細(xì)胞生長因子(iii)至(vi)，此外還包括促進(jìn)乳腺的生長的腺生長效應(yīng)物(vii)至(ix)。
[0058]組合物D
(i) 100-200 g可生物降解的PLGA微球體，分子量為21，000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1;
(?) 100-500 g與白蛋白締合的油酸和/或十六烷酸；
(iii)1-2 IU人重組胰島素;
(iv)4-8 yg FGF-1；
(V) 40-200 mg羅格列酮;
(vi)20-140 yg倍他米松;
(vii)0-4 mg 17 γ -雌二醇(對于男性，O mg;對于絕經(jīng)前婦女，0_1 mg;對于絕經(jīng)后婦女，2-4 mg)
(viii)2-20 mg維生素C和/或E。
[0059]組合物D特別適合于面部脂肪組織增加，因為其包括刺激脂肪生成的脂肪細(xì)胞生長因子(iii)至(vi)，此外還包括與皮膚駐留的成纖維細(xì)胞中的雌激素受體相互作用并刺激膠原形成的雌二醇。
[0060]實施例2-本發(fā)明的方法
以下描述用于實施本發(fā)明的兩種方法。[0061 ]方法 A
(i) 本發(fā)明的組合物，特別是組合物A至D之一，
(?)將局部麻醉應(yīng)用于目標(biāo)組織區(qū)域，特別是臉部、乳房或臀部，
(iii)對于交叉和重疊的分布平面，以定時間隔在目標(biāo)區(qū)域上產(chǎn)生I_大小的切口，
(iv)用配有15-30規(guī)格泡沫尖針或銳V尖插管的注射器中的組合物產(chǎn)生多個且均勻分布的注射，同時撤回，因此沿注射道產(chǎn)生垂直沉積物，
(v)重復(fù)步驟(iv)，直到均勻地覆蓋整個目標(biāo)區(qū)域。
[0062]方法B
(i)本發(fā)明的組合物，特別是組合物A至D之一，
(?)將包括神經(jīng)阻滯的局部或區(qū)域麻醉應(yīng)用于目標(biāo)組織區(qū)域，特別是臉部、乳房或臀部，
(iii)將包含所述組合物的注射器的15-30規(guī)格鈍尖針插入初始注射點處的適當(dāng)?shù)慕M織深度，
(iv)當(dāng)撤回針時，以緩慢且連續(xù)的方式遞送所述組合物，直到從皮膚完全移除針，或者，可選地，針的方向以徑向方式連續(xù)改變，且注射新線，而不撤回，直到覆蓋所有的目標(biāo)區(qū)域，
(v)在垂直于初始注射點的第二點注射一系列線，以提供更大目標(biāo)區(qū)域的更好覆蓋率，
(vi)可以在多個目標(biāo)區(qū)域、特別是在面部目標(biāo)區(qū)域重復(fù)步驟(ii)至(V)。
[0063]實施例3-本發(fā)明的注射技術(shù)
用于施用本發(fā)明的組合物的優(yōu)選的注射技術(shù)類似于外科醫(yī)生使用的自體脂肪轉(zhuǎn)移技術(shù)且參考圖1 (A)和I (B)進(jìn)行描述。
[0064]上面圖1(A)和(B)的注射技術(shù)后面的基本原理是在整個目標(biāo)組織均勻分布本發(fā)明的組合物，以提供由共配制的CR化合物控制其釋放的多重且均勻分布的代謝脂質(zhì)沉積，以確保代謝脂質(zhì)和任選的效應(yīng)化合物在整個目標(biāo)區(qū)域的均勻擴(kuò)散。優(yōu)選的可生物降解的微球體在形狀和大小上類似于脂肪細(xì)胞。
[0065]優(yōu)選的注射體積可以在0.1 mL和500 mL之間變化，因為這些取決于注射部位、患者和外科醫(yī)生的選擇。在注射階段期間，小體積定期釋放，以允許三維成形并防止囊腫形成。優(yōu)選按摩注射目標(biāo)區(qū)域以確保均勻分布并同樣防止囊腫形成。
[0066]實施例4- PLGA-脂肪酸微球體的合成
1.從Sigma Aldrich獲得聚(乳酸-共-乙醇酸)50:50 (30，000_60，000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)65:35 (40,000-75,000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)85:15 (50,000-75,000)。在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0067]2.聚合物已經(jīng)完全溶解之后，將100 HL目的脂肪酸(癸酸、十七烷酸、十六烷酸、油酸、二十二烷酸)添加至二氯甲烷溶液，同時旋轉(zhuǎn)。
[0068]3.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0069]4.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液。
[0070]5.使該混合物均勻化5分鐘。
[0071]6.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0072]7.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0073]8.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0074]9.收集上清液，然后第一次洗滌用于分析。
[0075]10.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0076]11.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0077]12.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0078]13.收集的上清液用于獲得被包封的脂肪酸的總量。包封效率為10-90%之間。
[0079]14.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠或引入細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0080]實施例5- PLGA微球體(空)的合成
1.從Sigma Aldrich獲得聚(乳酸-共-乙醇酸)50:50 (30，000_60，000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)65:35 (40,000-75,000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)85:15 (50,000-75,000)。在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0081]2.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0082]3.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液。
[0083]4.使該混合物均勻化5分鐘。
[0084]5.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0085]6.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0086]7.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0087]8.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0088]9.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0089]10.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0090]11.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠。
[0091]實施例6- PLGA-地塞米松微球體的合成
1.從Sigma Aldrich獲得聚(乳酸-共-乙醇酸)50:50 (30，000_60，000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)65:35 (40,000-75,000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)85:15 (50,000-75,000)。在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0092]2.聚合物已經(jīng)完全溶解之后，添加100 mg地塞米松(Sigma Aldrich)，并完全溶解。
[0093]3.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0094]4.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液。
[0095]5.使該混合物均勻化5分鐘。
[0096]6.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0097]7.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0098]8.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0099]9.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0100]10.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0101]11.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0102]12.微球體的樣品用稀堿溶液降解，上清液使用在241 nm的UV透明板進(jìn)行分析，并與適當(dāng)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。包封效率為2-10%。
[0103]13.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠。
[0104]實施例7- PLA-脂肪酸微球體的合成
1.從Sigma Aldrich獲得聚(L-丙交酯)(PLA)(平均Mn 50，000)。在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0105]2.聚合物已經(jīng)完全溶解之后，將100 HL目的脂肪酸(癸酸、十七烷酸、十六烷酸、油酸、二十二烷酸)添加至二氯甲烷溶液，同時旋轉(zhuǎn)。
[0106]3.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0107]4.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液以形成WOW乳液。
[0108]5.使該混合物均勻化5分鐘。
[0109]6.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0110]7.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0111]8.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0112]9.收集上清液，然后第一次洗滌用于分析。
[0113]10.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0114]11.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0115]12.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0116]13.收集的上清液用于獲得被包封的脂肪酸的總量。包封效率為10-90 %之間，平均值為約45 %。
[0117]14.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠或引入細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0118]實施例8-包封胰島素的PLGA微球體的合成
1.從Sigma Aldrich獲得聚(乳酸-共-乙醇酸)50:50 (30，000_60，000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)65:35 (40,000-75,000)或聚(乳酸-共-乙醇酸)85:15 (50,000-75,000)。
[0119]2.在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0120]3.將重組人胰島素(Sigma Aldrich)溶解于pH 2的0.1M稀釋HCl溶液中。
[0121]4.聚合物已經(jīng)完全溶解之后，將溶液引入Ultra turrax機(jī)器(配有S 25 N - 10G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器)。逐滴添加等于50 mg的胰島素溶液，以獲得油包水(WO)乳液。
[0122]5.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0123]6.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液。
[0124]7.使該混合物均勻化5分鐘。
[0125]8.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0126]9.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0127]10.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0128]11.收集上清液，然后第一次洗滌用于分析。
[0129]12.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0130]13.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0131]14.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0132]15.微球體的一部分使用稀堿降解過夜，且上清液用于使用BCA測定法(B i nchon i n i c酸測定法)定量包封的胰島素的量。
[0133]16.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠或引入細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0134]實施例9- PEG-PLGA-脂肪酸微球體的合成
1.從Sigma Aldrich獲得聚(乙二醇)甲基醚-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)(PEG平均Mn 5,000,PLGA Mn 55，000)。在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0135]2.聚合物已經(jīng)完全溶解之后，將100 HL目的脂肪酸(癸酸、十七烷酸、十六烷酸、油酸、二十二烷酸)添加至二氯甲烷溶液，同時旋轉(zhuǎn)。
[0136]3.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0137]4.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液。
[0138]5.使該混合物均勻化5分鐘。
[0139]6.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0140]7.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0141]8.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0142]9.收集上清液，然后第一次洗滌用于分析。
[0143]10.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0144]11.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0145]12.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0146]13.收集的上清液用于獲得被包封的脂肪酸的總量。包封效率為10-90%之間。
[0147]14.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma-Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠或引入細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0148]實施例10- PEG-PLGA-PEG脂肪酸微球體的合成 1.從Sigma Aldrich獲得聚(丙交酯-共-乙交酯)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)(平均Mn( 1100-1000-1100))。在天平上稱重200 mg聚合物并將其溶解于HPLC級二氯甲烷中。將該混合物以500 RPM攪拌。
[0149]2.聚合物已經(jīng)完全溶解之后，將100 HL目的脂肪酸(癸酸、十七烷酸、十六烷酸、
油酸、二十二烷酸)添加至二氯甲烷溶液，同時旋轉(zhuǎn)。
[0150]3.將 95 mL 聚乙烯醇(PVA) (Mw 89，000-98，000，99+% 水解)的4% 溶液引入200mL燒杯，并使用配有S 25 N - 10 G分配元件的IKA T25數(shù)字ultra turrax儀器均質(zhì)化。
[0151]4.將均質(zhì)化速度設(shè)定在6000 RPM，并且在將溶液均質(zhì)化的同時，將具有混合物的二氯甲烷溶液以逐滴方式添加至PVA溶液。
[0152]5.使該混合物均勻化5分鐘。
[0153]6.將該均質(zhì)化溶液添加至300 mL 0.5% PVA，同時以700 RPM攪拌。
[0154]7.使溶劑蒸發(fā)4小時，導(dǎo)致微球體的形成及其硬化。
[0155]8.將含有微球體的PVA溶液以8000 RPM離心，并用雙蒸水洗滌連續(xù)3次。
[0156]9.收集上清液，然后第一次洗滌用于分析。
[0157]10.將在沉淀中的微球體重懸浮于3 mL雙蒸水中。
[0158]11.將這些懸浮的微球體進(jìn)行冷凍干燥12小時。
[0159]12.顯微鏡或/和庫爾特計數(shù)器用于測定在10-50微米之間的微球體大小。
[0160]13.收集的上清液用于獲得被包封的脂肪酸的總量。包封效率為10-90%之間。[0161 ] 14.將微球體粉末再懸浮于羧甲基纖維素(Mw 90,000, Sigma-Aldrich)的2%溶液中，并劇烈渦旋。將該溶液渦旋，然后注入小鼠或引入細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0162]實施例11-不同CR化合物/脂肪酸組合物的體外攝取
3T3-L1是衍生自(小鼠)3T3細(xì)胞的細(xì)胞系，其通常用于關(guān)于脂肪組織的生物研究中。該細(xì)胞系被普遍接受作為用于脂肪細(xì)胞研究的可預(yù)測的細(xì)胞模型。將3T3-L1細(xì)胞(P9)(ATCC，德國)以每孔25000個細(xì)胞接種于96孔板中。使這些細(xì)胞經(jīng)2天達(dá)到匯合。將培養(yǎng)基從DMEM(10%血清+鏈霉素(100U) +青霉素(0.1mg/ml))(每樣均購自Gibco，瑞士)更換為DMEM(10%血清+胰島素+地塞米松鏈霉素(100U) +青霉素(0.1mg/ml))。根據(jù)實施例4，兩天后，將該培養(yǎng)基更換為DMEM (10%血清+胰島素鏈霉素(100U) +青霉素(0.lmg/ml) + X)，此處X代表油酸、十七烷酸、十六烷酸、癸酸和二十二烷酸。根據(jù)實施例7產(chǎn)生油酸-PLA組合物。將脂肪酸以20μΜ的濃度添加至各孔。在對照的情況下，以聚合物的大致相同的濃度(5 mg/孔)添加空微球體，實施例5。在所有情況下，維持微球體大小范圍高于10微米。每三天用各自微球體的新鮮補充物更換培養(yǎng)基。使用1% Triton X-100裂解細(xì)胞，并經(jīng)由測定法測量甘油三酯水平。使用單向ANOVA以Tukey后測試進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)。
[0163]獲得且通過圖2表示的結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的組合物，即包含不同類型的代謝脂肪酸以及不同類型的CR化合物(其中所述CR化合物控制所述脂肪酸的釋放)的組合物，導(dǎo)致脂肪模型細(xì)胞中的甘油三酯的顯著增加，因此證明脂肪酸從CR組合物向細(xì)胞甘油三酯的受控攝取和摻入。甘油三酯水平的這種提高獨立于所述組合物和CR化合物的類型，以及生理相關(guān)的脂肪酸的類型、碳鏈長度和飽和度。
[0164]實施例12- CR控制的胰島素和地塞米松對甘油三酯濃度的體外影響
將3T3-L1細(xì)胞(P9)以每孔25000個細(xì)胞接種于96孔板中。使這些細(xì)胞經(jīng)2天達(dá)到匯合。將培養(yǎng)基從DMEM (10%血清)更換為DMEM (10%血清+胰島素+地塞米松+油酸+鏈霉素(100U)+青霉素(0.lmg/ml))。根據(jù)實施例4、6和8將胰島素、地塞米松和油酸包封于50: 50組成的PLGA微球體中。兩天后，將該培養(yǎng)基更換為DMEM (10%血清+胰島素+油酸+鏈霉素(100U) +青霉素(0.lmg/ml))，油酸和胰島素兩者均在分開的根據(jù)權(quán)利要求4和8的微球體中。在對照的情況下，以聚合物的大致相同的濃度(5 mg/孔)添加空微球體。在所有情況下，維持微球體大小范圍高于10微米。每三天用在所有情況下具有油酸和胰島素的微球體的新鮮補充物更換培養(yǎng)基。在第8天使用Triton X-100裂解細(xì)胞，并經(jīng)由測定法測量甘油三酯水平。使用單向ANOVA以Tukey后測試進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)。
[0165]該實驗顯示，我們的分別含有地塞米松和胰島素的微球體連同油酸微球體誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞的分化和隨后甘油三酯的儲存，其中作為對照具有非常小的差異，因此沒有甘油三酯儲存。該實驗表明，我們的CR化合物連同胰島素和地塞米松在分開微粒中的組合可以誘導(dǎo)未分化的脂肪細(xì)胞的分化及其隨后體積的增大。
[0166]實施例13-體內(nèi)動物測試
將根據(jù)實施例4制備的凍干微球體(大約25 mg聚合物/小鼠和22.5 mg油酸/小鼠)重懸浮于90KDa羧甲基纖維素鈉(具有400的聚合度和0.65-0.9的取代度)(從此處開始稱為CMC)的50-200 cP、2 %的出0溶液中過夜，并在使用前劇烈渦旋。油酸的包封效率為大約45% (45mg油酸/每10mg油酸-微球體組合物)。以50:50比率(30，000-60，000)使用聚乳酸-乙醇酸聚合物，得到直徑10-50微米的微球體。使用2月齡的Balb-c裸小鼠用于實驗，每組具有5只購自Charles Rivers labs(意大利)的小鼠。持續(xù)30天的時段使這些小鼠適應(yīng)動物設(shè)施，以避免由于緊張導(dǎo)致的繼發(fā)效應(yīng)。使用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)級的油酸。
[0167]在注射后15和30天使用CT掃描定量左腹股溝脂肪墊體積。將50mg相應(yīng)的微球體組合物注入各腹股溝脂肪墊，其中CMC作為載體，其對應(yīng)于每個脂肪墊100 μ?的總體積。使用22G針用于注射。使用3%異氟烷麻醉小鼠。通過腹側(cè)面接近腹股溝脂肪墊。注射微球體，同時緩慢撤回針，以便在脂肪墊內(nèi)具有注射內(nèi)容物的均勻分布。
[0168]在裸小鼠中注射后15天，油酸負(fù)載的微球體清楚地提高腹股溝脂肪墊的體積，如通過CT掃描所評價。該動物實驗清楚地表明，根據(jù)本發(fā)明的CR化合物/代謝脂質(zhì)組合物導(dǎo)致代謝脂質(zhì)的受控且持久的攝取，顯著且均勻地擴(kuò)大這些組合物附近的脂肪細(xì)胞組織。
【主權(quán)項】
1.組合物，其包含 (i)生理上可接受的代謝脂質(zhì)，和 (ii)生理上可接受的，優(yōu)選可生物降解的受控釋放(CR)化合物， 其中所述脂質(zhì)是無細(xì)胞的且所述CR化合物在生理條件下經(jīng)延遲時間段釋放所述代謝脂質(zhì)。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述CR化合物經(jīng)7天至12個月、優(yōu)選30至90天、更優(yōu)選50至70天、最優(yōu)選約60天的延遲時間段釋放所述代謝脂質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種脂肪細(xì)胞生長效應(yīng)物，優(yōu)選選自以下 a.胰島素，胰島素生長因子結(jié)合蛋白I至7(IGFBP1_7)，胰島素生長因子I(IGF-1)和胰島素生長因子2(IGF-2)，優(yōu)選胰島素，胰島素生長因子I(IGF-1)和胰島素生長因子2(IFG-2)，更優(yōu)選胰島素和胰島素生長因子I(IGF-1)，最優(yōu)選人胰島素； b.成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，優(yōu)選FGF-1、FGF-2、FGF-10和FGF-21，更優(yōu)選FGF-1和FGF-2，最優(yōu)選FGF-1; c.糖皮質(zhì)激素，優(yōu)選選自皮質(zhì)醇、可的松、潑尼松、潑尼松龍、曲安西龍、甲潑尼龍、地塞米松和倍他米松，優(yōu)選塞米松和倍他米松； d.環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)活化劑，優(yōu)選選自氨茶堿、丙戊茶堿、茶堿、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、毛喉素和脫氫樅酸(DAA)，優(yōu)選氨茶堿、丙戊茶堿和茶堿； e.過氧化物酶體增殖物-活化受體γ 2(PPAR γ 2)激動劑，優(yōu)選噻唑烷二酮類化合物，更優(yōu)選選自吡格列酮、曲格列酮、羅格列酮和吲哚美辛，優(yōu)選曲格列酮和羅格列酮； f.骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，優(yōu)選BMP-2、BMP-4、BMP-7和BMP-9，優(yōu)選BMP-2和BMP-4。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種腺體生長效應(yīng)物，優(yōu)選乳腺腺體生長效應(yīng)物，更優(yōu)選選自以下的腺體生長因子 a.雌二醇和雌二醇衍生物，優(yōu)選選自雌二醇苯甲酸酯、雌二醇半水合物、雌二醇乙酸酯、雌二醇環(huán)戊丙酸酯、雌二醇戊酸酯、乙炔基雌二醇和17β-雌二醇，更優(yōu)選雌二醇和雌二醇環(huán)戊丙酸酯，最優(yōu)選17β_雌二醇； b.表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-CJf化生長因子a(TGF-a)、表皮調(diào)節(jié)蛋白(EPR)、表皮細(xì)胞有絲分裂蛋白(epigen)、乙胞素(BTC)、所有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRGl)同種型、調(diào)蛋白(HRG)、乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF))、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG2)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG3)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_4(NRG4)、肝素-結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)和雙調(diào)蛋白(AR)，優(yōu)選表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG4)、肝素-結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)和雙調(diào)蛋白(AR)，更優(yōu)選人表皮生長因子(EGF); c.抗雄激素，優(yōu)選選自比卡魯胺、尼魯米特、安體舒通和氟他米特，更優(yōu)選安體舒通和氟他米特。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的組合物，其中所述代謝脂質(zhì)包含脂肪酸，優(yōu)選選自丁酸和更長鏈脂肪酸的脂肪酸，更優(yōu)選選自戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸，十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二i^一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十五烷酸、二十六烷酸、二十七烷酸、二十八烷酸、二十九烷酸、三十烷酸、三i^一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、反亞油酸(linoelaidic acid)、亞麻酸、優(yōu)選α-亞麻酸、花生四稀酸、二十碳五稀酸、芥酸、二十二碳六稀酸、十八碳四稀酸、二十二碳五稀酸、二十碳四稀酸和二十二碳六稀酸，更優(yōu)選選自十八烷酸、十二烷酸、十六烷酸和油酸，最優(yōu)選十六烷酸、十八烷酸和油酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的組合物，其中所述生理上可接受的、優(yōu)選可生物降解的CR化合物選自聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚乳酸(PLA)，聚己內(nèi)酯(PCL)，泊洛沙姆，聚乙二醇(PEG) -PLGA共聚物，PEG和PLGA的組合，PLA和PEG的組合，優(yōu)選PLA-PEG-PLA，PLGA和泊洛沙姆的組合，葡聚糖，藻酸鹽和聚甲基丙烯酸酯，優(yōu)選PLA、PLGA和PEG-PLGA組合，更優(yōu)選PLGA和PLA，最優(yōu)選PLGA。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、十六燒酸和/或油酸和任選維生素C和/或E，優(yōu)選地 (i) PLGA，分子量為21,000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1， (?)十六烷酸和/或油酸，優(yōu)選與白蛋白締合，和 (iii)維生素C和/或E。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、十六烷酸和/或油酸、胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松和任選維生素C和/或E，優(yōu)選地 (i) PLGA，分子量為21,000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1， (?)十六烷酸和/或油酸，優(yōu)選與白蛋白締合， (iii)人重組胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松和維生素C和/或E。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、油酸和/或十六烷酸、胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、EGF-1、安體舒通、雌二醇和任選維生素C和/或E，優(yōu)選地 (i) PLGA，分子量為21,000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1， (?)油酸和/或十六烷酸，優(yōu)選與白蛋白締合， (iii)人重組胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、EGF-1、安體舒通、雌二醇和維生素C和/或E。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的組合物，其包含可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球體、油酸和/或十六烷酸、胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、雌二醇和任選維生素c和/Se，優(yōu)選地 (i) PLGA，分子量為21,000 Da，且乳酸與乙醇酸的比率為約1:1， (?)油酸和/或十六烷酸，優(yōu)選與白蛋白締合， (iii)人重組胰島素、FGF-1、羅格列酮、倍他米松、雌二醇和維生素C和/或E。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的組合物，其用于治療或美容性處理中使用，其任選進(jìn)一步包含生理上可接受的賦形劑和稀釋劑。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的組合物用于生產(chǎn)美容或治療組合物、優(yōu)選用于脂肪組織膨脹或脂肪組織修復(fù)的用途。13.根據(jù)權(quán)利要求7或11的組合物，其用于脂肪組織膨脹，優(yōu)選脂肪組織體積膨脹，更優(yōu)選用于臉部、臀部和/或乳房組織。14.根據(jù)權(quán)利要求8和11的組合物，其用于治療或美容性處理選自以下的狀況 (i)選自身體畸形，優(yōu)選創(chuàng)傷后疤痕和軟組織凹陷；先天性畸形，優(yōu)選漏斗狀胸畸形、乳房不對稱(例如波蘭綜合征)、偏側(cè)綜合征(例如CLOVE綜合征、Romberg綜合征)；靠近假肢的畸形，再形成輻射后大腿缺陷、HIV脂肪代謝障礙、輕度腭咽閉合不全的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥;和(?)選自美容脂肪組織增加，優(yōu)選乳房、臀部、臉部、生殖器、手和腿的脂肪組織增加，以及醫(yī)源性畸形，優(yōu)選修復(fù)周圍的凹凸，吸脂畸形和植入物畸形的非醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。15.根據(jù)權(quán)利要求9和11的組合物，其用于治療或美容性處理 (i)用于乳房切除術(shù)后的乳房重構(gòu)的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥或 (?)乳房或臀部增大。16.根據(jù)權(quán)利要求10和11的組合物，其用于治療或美容性處理選自以下的狀況 (i)選自創(chuàng)傷后的面部重構(gòu)和畸形，優(yōu)選痤瘡疤痕、HIV誘導(dǎo)的脂肪代謝障礙、疤痕的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥;和 (?)選自美容面部增大，優(yōu)選對于臉頰、眉、前額、眉間、嘴唇、嘴角紋、鼻唇溝皺褶、鼻、眼周皺褶和凹陷眼瞼畸形的美容面部增大的非醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。17.用于治療或美容性處理哺乳動物、優(yōu)選人的方法，其包括以下步驟 (i)提供根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的組合物， (?)任選地將麻醉局部施用于待處理的組織， (iii)注射施用所述組合物，優(yōu)選注射所述組合物、同時撤回注射針， (iv)任選地重復(fù)步驟(iii)，直到整個組織得到處理。
【文檔編號】A61K8/11GK105848628SQ201480071583
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月30日
【發(fā)明人】A.Y.阿霍, R.桑迪普
【申請人】Pb&B公司