本發(fā)明涉及一種黃瓜雌性相關(guān)基因及編碼蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃瓜(cucumissativus)是屬于葫蘆科(cucurbitaceae)中的一種主要蔬菜作物，其性別類型復(fù)雜多樣。因此在二十世紀(jì)五十年代末就將黃瓜確定為性型分化研究的模式植物，黃瓜如此多樣的性別分化不僅受控于基因和內(nèi)源激素，還受環(huán)境的影響，其作用機(jī)制十分復(fù)雜，目前黃瓜性型分化的研究已經(jīng)成為植物研究者的關(guān)注焦點(diǎn)。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的與低夜溫影響黃瓜雌性形成有關(guān)的假定蛋白的研究不僅可以揭示該蛋白在黃瓜雌性分化中的作用機(jī)制，更為黃瓜高產(chǎn)育種提供了應(yīng)用價(jià)值。曹宗異等(1957)研究了環(huán)境影響下黃瓜雌雄花比例的變化，認(rèn)為外界環(huán)境的影響改變了植物新陳代謝的類型，這樣必然會(huì)定向地改變植物的性別。江俏梅等(1995)的研究表明，影響瓜類作物性別表現(xiàn)的因素主要有品種本身的遺傳性、環(huán)境條件(溫度光照等)及化學(xué)調(diào)控等。溫度對(duì)黃瓜性型表現(xiàn)的影響大于光強(qiáng)度和光周期，低夜溫是影響黃瓜雌性形成的主導(dǎo)因素，光周期影響不明顯。厲建梅(2011)發(fā)現(xiàn)了雌花分化受季節(jié)影響顯著的黃瓜種質(zhì)資源‘c09-123’，程國輝(2012)通過研究其雌性形成的光溫條件及黃瓜雌性形成具體的溫度反應(yīng)閥值，確定‘c09-123’為溫敏型雌性試驗(yàn)材料，其性別轉(zhuǎn)換溫度閾值為12℃～24℃。劉欣童(2016)對(duì)不同夜溫條件下‘c09-123’相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行比較分析，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究篩選出與低夜溫誘導(dǎo)黃瓜雌性形成密切相關(guān)的蛋白，該蛋白在12℃低夜溫處理樣品中上調(diào)表達(dá)，因此，推測它很可能參與了低溫誘導(dǎo)的黃瓜雌花分化。因此研究黃瓜性別相關(guān)基因，并分析其功能對(duì)于黃瓜新品種培育方面具有重要的理論和實(shí)際意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib及編碼蛋白和應(yīng)用。

本發(fā)明黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib的cdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本發(fā)明黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

本發(fā)明黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib在提高黃瓜雌花節(jié)率中的應(yīng)用。

所述cspap-fib基因?qū)胫参锛?xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，使所述cspap-fib基因在植物中表達(dá)，得到雌花節(jié)率高的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物為黃瓜。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明首次在黃瓜中報(bào)道與黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib，并通過pcr技術(shù)克隆出黃瓜cspap-fibcdna全長。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對(duì)于黃瓜中cspap-fib基因cdna全長為870bp，編碼289個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白屬于葉綠體中一個(gè)不穩(wěn)定的疏水蛋白，無明顯信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，并且含有一個(gè)pap-fibrillin結(jié)構(gòu)域，預(yù)示其可能參與花藥內(nèi)源激素調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白互作、活性氧積累及花藥的發(fā)育。

將cspap-fib導(dǎo)入黃瓜中，使其過表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因后代黃瓜。cspap-fib過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株雌花節(jié)率明顯高于對(duì)照植株，促使轉(zhuǎn)基因黃瓜植株具有更高的產(chǎn)量。進(jìn)而為培育強(qiáng)雌性黃瓜新品種，提供一種新的解決途徑。

附圖說明

圖1為提取的rna的電泳圖；

圖2為菌液pcr檢測結(jié)果；

圖3為轉(zhuǎn)cspap-fib基因抗性植株的pcr檢測；

圖4為cspap-fib亞細(xì)胞定位結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib的cdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

以下實(shí)施例中如無特別說明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1.trizol法提取黃瓜溫敏型材料‘c09-123’的rna

(1)采用trizol法提取黃瓜葉片總rna：取100mg新鮮黃瓜葉片組織，加入液氮充分研磨，將粉末轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管中；加入1mltrizol，充分震蕩，15～30℃靜置5min；加入300μl氯仿，劇烈搖蕩15s，12000rpm4℃離心15min；取上清移入新的無菌離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置20min，12000rpm4℃下離心15min；棄上清，加入1ml75％depc-乙醇，渦旋洗滌10s，7500rpm4℃離心5min(重復(fù)操作2次)；棄乙醇，將離心管導(dǎo)致于干凈濾紙上晾干；用30μl1‰depc水溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)rna電泳檢測：取1μlrna，使用sma3000紫外分光光度計(jì)檢測提取的rna質(zhì)量與濃度，將檢測合格的rna樣品(rna量≥6μg，濃度≥300ng/μl，2.1≥od260/280≥1.8，od260/230≥1.8)。表明黃瓜‘c09-123’的rna提取成功。提取的rna的電泳圖如圖1所示。

實(shí)施例2.兩步法反轉(zhuǎn)錄(toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒)

(1)反轉(zhuǎn)錄體系為：總rna1ml，5×rtbuffer2μl，rtenzymemix0.5μl，primermix0.5μl，nuclease-freewater6μl，total10μl。

(2)反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃溫浴15min，然后98℃加熱5min，冰上放置5min終止反應(yīng)，即獲得相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna。

實(shí)施例3.熱啟動(dòng)pcr擴(kuò)增cspap-fib基因

根據(jù)cspap-fib基因中內(nèi)含子的分布情況，利用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)克隆全長的特異性引物(cspap-fib-f，cspap-fib-r)。引物序列如下：

cspap-fib-f：5′-atggaaattatggaacacaacag-3′

cspap-fib-r：5′-tcaagagatgaaatctagagagtca-3′

(1)pcr克隆反應(yīng)體系為：10×pcrbuffer2μl(含20mmol·l^-1mg²⁺)，dntps(10mmol·l^-1)2μl，上游引物(20μmol·l^-1)0.5μl，下游引物(20μmol·l^-1)0.5μl，taq酶(2u)0.2μl，加ddh2o至20μl。

(2)pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物在含有0.5mg/l溴化乙錠(ethidiumbromide)的1％瓊脂糖凝膠上電泳。cspap-fibcdna全長為870bp，其核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。其編碼289個(gè)氨基酸，編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

實(shí)施例4.pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的回收

使用1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下快速切下目的條帶，回收cspap-fib基因的目的片段，具體方法參照北京全式金膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。步驟如下：

切取凝膠：用刀片切取瓊脂糖凝膠中的目的基因條帶，放入已知重量的離心管中，再次稱重，二者之差為切取的凝膠重量，100mg凝膠，視為100μl；溶解凝膠：加入3倍體積gsb，55℃水浴10min，2-3min震蕩1次，至凝膠全部溶解；降至室溫后，轉(zhuǎn)移到離心柱內(nèi)，靜置1min后，10000g離心1min，棄掉流出液；清洗dna：加入650μlwb，12000g離心1min，棄掉流出液；再離心2min；洗脫dna：將離心柱置于一個(gè)干凈離心管中，開蓋靜置1min，加入40μl預(yù)先預(yù)熱(65℃)的eb，靜止1min后10000g離心1min，將洗脫的dna于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5.pcr擴(kuò)增片段的純化

首先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離要純化的片段；用干凈的無菌手術(shù)刀切下目的dna條帶放入預(yù)稱重的1.5mleppendorf管；每0.1g瓊脂糖凝膠需加入200μls1溶液；50℃溫育，直至瓊脂糖完全融解；每5μl(不足5μl，以5μl計(jì))dna需加入5μldna結(jié)合液(玻璃粉懸液)，輕輕顛倒混勻，冰上放置10min；室溫6000rpm離心20s；棄上清，加700μl乙醇洗液，輕輕抽吸，使玻璃粉懸浮，冰上放置5min；重復(fù)上述步驟6000rpm，離心20s；棄上清，小心去除全部殘液；加30-50μlte，輕輕吹打懸浮玻璃粉，50℃溫育10min；室溫6000rpm離心20s，吸上清至新的eppendorf管，于4℃或–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例6.連接peasy-t3載體與陽性克隆篩選

將cspap-fib基因回收產(chǎn)物與peasy-t3克隆載體進(jìn)行連接。反應(yīng)程序16℃16h。

(1)連接反應(yīng)體系為：回收產(chǎn)物4μl，-t3zerocloningvector1μl，將5μl連接產(chǎn)物全部加入至剛剛解凍的50μltrans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激30s，立即置于冰上2min；加1ml液體lb后，200rpm、37℃培養(yǎng)60min；200μl菌液均勻涂板，37℃過夜培養(yǎng)。

(2)酶切反應(yīng)體系為：buffer1μl，ecori1μl，質(zhì)粒3μl，ddh2o6μl，總體系10μl。

用槍頭挑取白色單個(gè)菌落至液體lb(含有amp)的離心管中，200rpm/min、37℃震蕩培養(yǎng)6h，進(jìn)行pcr檢驗(yàn)及ecori酶切驗(yàn)證。pcr反應(yīng)體系同cspap-fib基因克隆反應(yīng)體系，將模板更換為菌液。質(zhì)粒提取方法參照質(zhì)粒小量提取試劑盒(em101)說明書(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行。將鑒定獲得的cspap-fib基因的陽性菌液，送至蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測序。

實(shí)施例7.植物過量表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述純化的cspap-fib基因全長序列，分別pcr擴(kuò)增peasy-t3-cspap-fib質(zhì)粒，用xcmⅰ單酶切pcxsn-1250載體。t4連接酶連接目的片段與載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞。通過菌液pcr及測序鑒定出構(gòu)建成功的pcxsn-cspap-fib過量表達(dá)載體。

8.植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌lba4404

采用凍融法將pcxsn-cspap-fib質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌lba4404中。

(1)感受態(tài)細(xì)胞的制備將根癌農(nóng)桿菌lba4404在yeb培養(yǎng)基(含利福平)上劃線，28℃培養(yǎng)48h；挑取單菌落于yeb液體培養(yǎng)基(含利福平)中，28℃，200r/mim震蕩過夜培養(yǎng)，直至菌液的od600＝0.5；將菌液分裝，冰浴10min；12000rpm離心30s，棄上清，20mm預(yù)冷cacl2懸浮，冰浴20min；12000rpm離心30s，棄上清，100μl20mm預(yù)冷cacl2重懸，-80℃保存。

(2)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eh105：將10μl重組質(zhì)粒加入到100μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰上靜置10min；液氮速凍5min，37℃水浴鍋中熱激2.5min；加入1ml液體yeb培養(yǎng)基，在28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)3.5h；6000rpm離心1min，棄上清；重懸菌液，涂在含有50mg/mlkan和50mg/mlrif的yeb固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48h。

(3)陽性克隆的鑒定挑取單菌落并以菌液為模板進(jìn)行pcr鑒定。將轉(zhuǎn)化成功的菌液置于-80℃冰箱保存，用于黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化。菌液pcr檢測結(jié)果如圖2所示，圖2中m：dnamarker2k；1-2：pcr產(chǎn)物。

實(shí)施例9.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化方法

將過量表達(dá)載體pcxsn-cspap-fib轉(zhuǎn)入到溫敏型黃瓜材料‘c09-123’中。

(1)種子發(fā)芽：將黃瓜種子置于55-65℃水中浸泡1h，去種皮，70％酒精消毒1min，滅菌水清洗1遍，3％的次氯酸鈉消毒10min，滅菌水清洗5遍，平鋪到發(fā)芽培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)1-2d。

(2)農(nóng)桿菌的活化：將農(nóng)桿菌按1:100的比例加入50mlyeb(含rif和kan)液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm震蕩培養(yǎng)36-48h。6000rpm離心10min，棄上清，1/2ms緩沖液重懸，菌液od600＝0.2-0.3。

(3)侵染子葉節(jié)：無菌操作臺(tái)中，用小刀將黃瓜種子子葉分開，去除全部下胚軸及生長點(diǎn)，置于重懸的菌液中，28℃，200rpm侵染12-15min左右。

(4)子葉節(jié)共培養(yǎng)與分化培養(yǎng)：將侵染后的子葉節(jié)置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，28℃黑暗培養(yǎng)1-2d。長出白色斑點(diǎn)時(shí)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，25℃，光照16h，黑暗8h條件下培養(yǎng)28d左右。

(5)植株生根培養(yǎng)與馴化：在無菌操作臺(tái)中，用小刀切下分化芽，移入生根培養(yǎng)基中。5-7d左右進(jìn)行移栽，注意保濕。置于28/18℃，光照16/8h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完成馴化后，移栽到溫室中定值。

實(shí)施例10.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

采用ctab法和trizol法分別提取黃瓜葉片dna和rna，進(jìn)行pcr和qrt-pcr鑒定。轉(zhuǎn)cspap-fib基因抗性植株的pcr檢測如圖3所示。圖3中m：dna2000mark；y：質(zhì)粒陽性對(duì)照；c：未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；w：水對(duì)照；1-3：轉(zhuǎn)正義基因植株檢測；4-6：轉(zhuǎn)反義基因植株檢測。

實(shí)施例11.轉(zhuǎn)基因黃瓜雌花節(jié)率的調(diào)查分析

黃瓜雌花節(jié)率調(diào)查方法：黃瓜植株主蔓上第1朵雌花出現(xiàn)的節(jié)位即第1雌花節(jié)位雌花率為主蔓上著生雌花節(jié)位數(shù)占有花節(jié)位數(shù)的比例，計(jì)算公式為：

雌花節(jié)率＝主蔓上有雌花節(jié)位總數(shù)/主蔓上有花節(jié)位數(shù)×100％。

表1低夜溫(26℃/12℃晝/夜)條件下雌花節(jié)率

表2正常夜溫(26℃/18℃晝/夜)條件下雌花節(jié)率

以上結(jié)果表明cspap-fib過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株雌花節(jié)率明顯高于對(duì)照植株，促使轉(zhuǎn)基因黃瓜植株具有更高的產(chǎn)量。從而提供了一種獲得黃瓜強(qiáng)雌性植株品系的方法。

實(shí)施例12.cspap-fib的亞細(xì)胞定位

1、擬南芥原生質(zhì)體提取步驟：

(1)將擬南芥種子播種于ms培養(yǎng)基上，4℃黑暗春化兩天后轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)室(22℃，16/8(l/d光強(qiáng)130μlmol.m-2s-1))中培養(yǎng)，7d后，將萌發(fā)的擬南芥幼苗移栽到基質(zhì)土(蛭石：土＝1：2)中生長。當(dāng)植株長至8～10個(gè)葉片時(shí)，取材葉片制備原生質(zhì)體；

(2)剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5-1mm寬的葉條；

(3)將切好葉條置于預(yù)先配置好的纖維素酶解液中，并用鑷子幫助使葉子完全浸入酶解液，25℃，低于8rpm，黑暗條件下酶解至少3個(gè)小時(shí)；

(4)用w5溶液潤濕35-75um的尼龍膜或60-100目篩子，然后用它過濾含有原生質(zhì)體的酶解液；將過濾完的原生質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，100×g離心3min；

(5)棄上清，緩慢加入10ml預(yù)冷的w5溶液，重懸原生質(zhì)細(xì)胞；

(6)重復(fù)步驟(5)，冰上靜至原生質(zhì)體30分鐘，期間可以取少量原生質(zhì)細(xì)胞在顯微鏡下觀察，以檢驗(yàn)細(xì)胞的完整性擬南芥葉肉體大小大約30-50μm。

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)

(1)將上步檢驗(yàn)好的擬南芥原生質(zhì)細(xì)胞100×g離心3min，棄上清，盡量去除w5溶液，加入2mlmmg溶液，重懸原生質(zhì)體，使之最終濃度在2×10⁵個(gè)/ml；

(2)cspap-fib-pcambia1302質(zhì)粒的制備：

cspap-fib質(zhì)粒制備：

將帶有handiii和bamhi酶切位點(diǎn)的cspap-fib基因片段連接到克隆載體t3(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到t1感受態(tài)細(xì)胞(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑斑測序，對(duì)完全正確的菌液利用質(zhì)粒提取試劑盒(easypurehipureplasmidmaxiprepkit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取得到cspap-fib質(zhì)粒。

cspap-fib-pcambia1302質(zhì)粒制備：

分別用handiii和bamhi內(nèi)切酶(購自neb公司)對(duì)cspap-fib質(zhì)粒和pcambia1302載體質(zhì)粒(購自北京華越洋生物公司)進(jìn)行雙酶切。酶切條件為37℃，2h；酶切體系為buffer2μl、handiii1μl、bamhi1μl、質(zhì)粒16μl。然后跑電泳，分別回收cspap-fib和pcambia1302目的條帶，將兩個(gè)回收產(chǎn)物利用t4dna連接酶(購自neb公司)連接，連接條件為16℃，16h；連接體系為buffer1μl、cspap-fib產(chǎn)物4μl、pcambia1302產(chǎn)物4μl、t4連接酶1μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到t1感受態(tài)細(xì)胞(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑斑pcr驗(yàn)證，對(duì)正確的菌樣再次使用質(zhì)粒提取試劑盒(easypurehipureplasmidmaxiprepkit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取得到cspap-fib-pcambia1302質(zhì)粒。

(3)取干凈的2ml離心管，加入20μl(約30μg)cspap-fib-pcambia1302質(zhì)粒dna和200μl原生質(zhì)細(xì)胞，輕柔混勻，25℃靜止5min；

(4)加入220μl(等體積)的40％peg4000溶液，輕柔混勻，25℃靜止5min；

(5)加入1ml預(yù)冷的w5溶液，輕柔混勻；

(6)重復(fù)步驟(5)，加入加入1ml預(yù)冷的w5溶液，1％bsa，輕柔混勻，25℃光照培養(yǎng)16h。

(7)激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白表達(dá)情況。

cspap-fib亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖4所示，其中bright為明場，gfp為綠色熒光，chlorophy為葉綠素自發(fā)熒光，merged為疊加結(jié)果，圖中標(biāo)尺為10μm。由圖4可知cspap-fib基因在葉綠體中表達(dá)。

序列表

<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib及編碼蛋白和應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>870

<212>cdna

<213>黃瓜（cucumissativusl.）

<220>

<223>黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib

<400>1

atggctgctctagccagctctcttcttcagtcttcactccagatccgtacttccgattct60

tcttttgggtctctttttccatctacaatacatcggattgcacccagtttcaacctcaag120

tgttcccgcctccactctctgttttccctcgacggcggacccagaagaattttatctttg180

aaatcggtttcagtcaatgtttacgcggaccctgcgtcggcctctccctctgttgttgac240

gaataccaggccaagtctgagctccttgcatccttgaaggtcaagctactgactgcggtt300

tcagggttaaacagaggtcttgctgctgatgaggatgatttacagaaggcagacgaggct360

gccaaggagattgaagctgttggggggcctgtggacctctcagttgatcttgacaaattg420

caaggaagatggaaattgatatacagcagtgcattctcatctcgtactttaggcggtagt480

agaccaggacctcccacgggaaggctacttcctattactcttggtcaggtgtttcagcga540

atcgacatcatcagtaaagattttgataacattgtagaactcgaactaggtgctccttgg600

cctctacctcctgctgaagtcactgctacattggctcacaagtttgaaatcatagggtct660

gctaagattaaaattatttttgagaaaacgaccgtgaaaacaactgggaacttgtcacag720

cttccaccattagaggtacctcggattccagatgccttgaggcctccgtccaacactgga780

agtggtgaatttgaagtcacttaccttgacaacgatattcgaatcaccagaggagataga840

ggagaactcagggtgtttgttatctcataa870

<210>2

<211>289

<212>prt

<213>黃瓜（cucumissativusl.）

<220>

<223>黃瓜雌性相關(guān)基因cspap-fib編碼蛋白

<400>2

metalaalaleualaserserleuleuglnserserleuglnile

51015

argthrseraspserserpheglyserleupheproserthrile

202530

hisargilealaproserpheasnleulyscysserargleuhis

354045

serleupheserleuaspglyglyproargargileleuserleu

505560

lysservalservalasnvaltyralaaspproalaseralaser

657075

proservalvalaspglutyrglnalalyssergluleuleuala

808590

serleulysvallysleuleuthralavalserglyleuasnarg

95100105

glyleualaalaaspgluaspaspleuglnlysalaaspgluala

110115120

alalysgluileglualavalglyglyprovalaspleuserval

125130135

aspleuasplysleuglnglyargtrplysleuiletyrserser

140145150

alapheserserargthrleuglyglyserargproglypropro

155160165

thrglyargleuleuproilethrleuglyglnvalpheglnarg

170175180

ileaspileileserlysasppheaspasnilevalgluleuglu

185190195

leuglyalaprotrpproleuproproalagluvalthralathr

200205210

leualahislysphegluileileglyseralalysilelysile

215220225

ilepheglulysthrthrvallysthrthrglyasnleusergln

230235240

leuproproleugluvalproargileproaspalaleuargpro

245250255

proserasnthrglyserglygluphegluvalthrtyrleuasp

260265270

asnaspileargilethrargglyaspargglygluleuargval

275280285

phevalileser

289

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物cspap-fib-f

<400>3

atggaaattatggaacacaacag23

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物cspap-fib-r

<400>4

tcaagagatgaaatctagagagtca25