專利名稱：黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國是世界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、總產(chǎn)量最高的國家，在全國各地均有種植。黃瓜又是病蟲害最多，受病蟲危害最重的蔬菜之一，生長過程中經(jīng)常受到多種病害的危害，對農(nóng)藥的需求量很大，需求種類也較多，是現(xiàn)在農(nóng)藥殘留超標(biāo)的主要蔬菜品種之一。隨著我國黃瓜生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化，品種的要求也越來越嚴(yán)格，不僅要求高產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)，黃瓜的果實(shí)形狀及口感、低農(nóng)藥殘留量等也成為重要的種植指標(biāo)。為了滿足國內(nèi)市場的需求，并盡快與國際市場接軌，解決黃瓜農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題迫在眉睫。黃瓜霜霉病是黃瓜生產(chǎn)中的主要病害之一，其來勢猛、傳播快、為害重，能在1-2 周內(nèi)使植株大部分葉片枯死，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，以致絕收。為了防治霜霉病，在生產(chǎn)上需使用大量農(nóng)藥，其中霜霉威(Propamocarb)是抑制霜霉病危害的主要噴灑類藥劑之一，能夠有效地抑制黃瓜霜霉病的擴(kuò)散，目前在生產(chǎn)上已經(jīng)廣泛使用。研究表明，黃瓜農(nóng)藥殘留量與生態(tài)類型關(guān)系密切，華南型黃瓜農(nóng)殘量相對最高，其次為華北型，歐洲型含量略低于華北型， 腌漬型的農(nóng)殘含量相對最低(見參考文獻(xiàn)劉芳芳，秦智偉，周秀艷.低農(nóng)藥殘留量的黃瓜種質(zhì)資源篩選.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41 (7) :32-36)，然而與黃瓜農(nóng)藥殘留量相關(guān)基因的研究還未見報(bào)道。因此尋找與黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對于加快無公害黃瓜育種進(jìn)程具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述存在的問題提供一種黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，能夠更好地利用上述黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因分子標(biāo)記，并將黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因分子標(biāo)記應(yīng)用于黃瓜育種的輔助選擇。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，該方法包括如下步驟以霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT14為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7. 5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的低霜霉威殘留性黃瓜東農(nóng)803帶型一致，則該霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系為低霜霉威殘留性品種或品系，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火Imin, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸Imin, 72°C延伸lOmin，最后4°C保存，所述的CSWCT14為引物 1 5，-TCCAATCGACCTAAATCCAAA-3，，引物 2 5，-TGGCCCTAACTGTTGATGC-3，。所述的黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，所述PCR擴(kuò)增中，每20 μ 1 的 PCR 反應(yīng)體系如下10Xbuffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 1 0· 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 :10. 7μ 1。黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法在輔助選擇無公害黃瓜材料中的應(yīng)用。有益效果1.本發(fā)明直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題，因此，本發(fā)明能夠克服黃瓜霜霉威殘留性鑒定易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，在苗期就能夠通過分子標(biāo)記對黃瓜品種和品系的霜霉威殘留性進(jìn)行鑒定和篩選，淘汰高霜霉威殘留性植株，減少人力和物力的浪費(fèi)，提高育種效率。同時(shí)， DNA分子標(biāo)記技術(shù)操作簡單，成本低廉，用時(shí)短，在一天內(nèi)即可完成全部的檢測過程。2.所需樣本數(shù)量少，操作比較簡便，效率高，成本低廉。3.本發(fā)明易于掌握，不受環(huán)境條件影響，重復(fù)性高。


圖1黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因分子標(biāo)記的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果(東農(nóng)804)。M DL2000DNA Marker ；1 對照東農(nóng) 803 ；2 15 東農(nóng) 804 單株。圖2黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因分子標(biāo)記的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果(東農(nóng)80 。M DL2000DNA Marker ；1 對照東農(nóng) 803 ；2 8 東農(nóng) 805 單株。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。所有引物合成均由生工生物工程(上海)有限公司完成。以下實(shí)施例中所有用到的黃瓜材料均為公知公用。實(shí)施例1 黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，該方法包括如下步驟以霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT14為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7. 5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的低霜霉威殘留性黃瓜東農(nóng)803帶型一致，則該霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系為低霜霉威殘留性品種或品系，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火Imin, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸Imin, 72°C延伸lOmin，最后4°C保存，所述的CSWCT14為引物 1 5，-TCCAATCGACCTAAATCCAAA-3，，引物 2 5，-TGGCCCTAACTGTTGATGC-3，。實(shí)施例2 所述的黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，所述PCR擴(kuò)增中，每 20 μ 1 的 PCR 反應(yīng)體系如下10Xbuffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 :10. 7μ 1。
實(shí)施例3 黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法在輔助選擇無公害黃瓜材料中的應(yīng)用。以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組培育出的黃瓜雜交新品種東農(nóng)804和東農(nóng) 805為材料；提取其單個(gè)植株DNA為模板，以本發(fā)明提供的1個(gè)黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)分子標(biāo)記CSWCT14為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，東農(nóng)804和東農(nóng)805單株的PCR擴(kuò)增帶型與低霜霉威殘留性對照東農(nóng)803擴(kuò)增帶型完全一致，且PCR檢測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室鑒定結(jié)果的吻合率為100%，證明了 CSWCT14是一個(gè)實(shí)用的黃瓜霜霉威殘留性檢測的分子標(biāo)記。
權(quán)利要求
1.一種黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征是該方法包括如下步驟以霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT14為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7. 5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的低霜霉威殘留性黃瓜東農(nóng)803帶型一致， 則該霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系為低霜霉威殘留性品種或品系，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lmin，72°C延伸lOmin，最后4°C保存，所述的CSWCT14為引物 1 :5，-TCCAATCGACCTAAATCCAAA-3，，引物 2 :5’ -TGGCCCTAACTGTTGATGC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征是所述PCR擴(kuò)增中，每20 μ 1的PCR反應(yīng)體系如下=IOXbuffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1， lOpmol/μ 1 的 Primer 1 :0. 8 μ 1，IOpmol/μ 1 的 Primer 2 0. 8μ l,25mM MgCl2 :2. 5 μ 1， 5U/ μ 1 的 TaqDNA 聚合酶0. 2 μ 1，60ng/ μ 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 10. 7 μ 1。
3.—種上述黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法在輔助選擇低霜霉威殘留性黃瓜材料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒定方法。本發(fā)明的方法包括以霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT14為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的低霜霉威殘留性黃瓜東農(nóng)803帶型一致，則該霜霉威殘留性未知的黃瓜品種或品系為低霜霉威殘留性品種或品系，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸1min，72℃延伸10min，最后4℃保存。本發(fā)明用于鑒定黃瓜霜霉威殘留性相關(guān)基因。
文檔編號C12Q1/68GK102586403SQ20111000261
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者周秀艷, 武濤, 秦智偉, 辛明, 馬佰慧 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)