專利名稱：一類具有外周鎮(zhèn)痛作用的κ阿片受體激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類K阿片受體激動(dòng)劑，可以在激活受體后產(chǎn)生外周鎮(zhèn)痛作用。
背景技術(shù)：
K阿片受體(K-opioid receptor, 0P2, K0R)屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體超家族成員中的一種亞型。研究表明，K阿片受體與痛覺調(diào)節(jié)、利尿作用、神經(jīng)內(nèi)分泌物的分泌有關(guān)。K阿片受體激活后通過Gi蛋白調(diào)節(jié)能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其調(diào)控的蛋白質(zhì)磷酸化，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作 用。K阿片受體(K-opioid receptor,0P2,K0R)屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體超家族成員中的一種亞型。研究表明，K阿片受體與痛覺調(diào)節(jié)、利尿作用、神經(jīng)內(nèi)分泌物的分泌有關(guān)。K阿片受體激活后通過Gi蛋白調(diào)節(jié)能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其調(diào)控的蛋白質(zhì)磷酸化。初級感覺神經(jīng)元內(nèi)及其外周末梢上存在著K阿片受體，在炎癥及神經(jīng)損傷的情況下，K阿片受體合成增加并轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)末梢或者受損部位，增加傳導(dǎo)痛覺沖動(dòng)的神經(jīng)纖維中的K阿片受體的表達(dá)，增強(qiáng)外周鎮(zhèn)痛作用。疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，是臨床上最常見的癥狀之一。它包括傷害性刺激作用于機(jī)體所引起的痛感覺，以及機(jī)體對傷害性刺激的痛反應(yīng)(軀體運(yùn)動(dòng)性反應(yīng)和/或內(nèi)臟植物性反應(yīng)，常伴隨有強(qiáng)烈的情緒色彩)。痛覺可作為機(jī)體受到傷害的一種警告，引起機(jī)體一系列防御性保護(hù)反應(yīng)。但另一方面，疼痛作為報(bào)警也有其局限性(如癌癥等出現(xiàn)疼痛時(shí)，已為時(shí)太晚)。而某些長期的劇烈疼痛，對機(jī)體已成為一種難以忍受的折磨。疼痛的感知同時(shí)涉及到感官和情感變化，尤其慢性疼痛，往往伴隨著抑郁、焦慮及生活質(zhì)量的下降。因此，鎮(zhèn)痛是醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要任務(wù)。阿片類藥物在急性和慢性疼痛的治療中發(fā)揮著重要的作用。雖然此類藥物的在急性疼痛的感官鑒別中的特點(diǎn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床調(diào)查中已經(jīng)完整詮釋，但是它們在慢性疼痛中的作用并沒有深入研究。目前，應(yīng)用于臨床的外周鎮(zhèn)痛藥物主要為μ阿片受體鎮(zhèn)痛藥，如芬太尼類藥物。還未有K阿片受體鎮(zhèn)痛藥應(yīng)用于臨床。近年來，大多數(shù)研究表明K阿片受體的激活可以改變心臟功能僅有少數(shù)研究表明K阿片受體與疼痛相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療阿爾茨海默病的化合物，該化合物是K阿片受體激動(dòng)劑，對阿爾茨海默病有預(yù)防或者治療作用。本發(fā)明所述的化合物包括含治療有效量的化學(xué)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明采用高通量篩選技術(shù)，建立了 K阿片受體激動(dòng)劑高通量篩選模型并應(yīng)用于化合物大規(guī)模篩選，通過篩選一批從CHEMDIV公司購買的化合物并進(jìn)行功能性驗(yàn)證尋找到了具有化學(xué)式(I)的K阿片受體激動(dòng)劑，同時(shí)對其進(jìn)行相關(guān)的AD藥效學(xué)和機(jī)制研究。本發(fā)明的技術(shù)方案為在中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞(CHO)內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K阿片受體，建立K阿片受體激動(dòng)劑高通量篩選模型，進(jìn)行初篩，復(fù)篩，構(gòu)效關(guān)系分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物整體藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，得到一類具有外周鎮(zhèn)痛作用的候選藥物。具體步驟如下步驟一建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K阿片受體的CHO細(xì)胞株。步驟二 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定及最佳細(xì)胞數(shù)確定。步驟三陽性藥驗(yàn)證。步驟四采用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和摸索的最佳檢測條件對化合物進(jìn)行K阿片受體激動(dòng)劑的高通量篩選，得到有明顯量效關(guān)系的化合物。 步驟五進(jìn)行動(dòng)物整體鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，得到一類具有外周鎮(zhèn)痛作用的候選藥物。


圖I :標(biāo)準(zhǔn)曲線及最佳細(xì)胞數(shù)曲線圖2 :陽性藥(K阿片受體特異性激動(dòng)劑U50，488)量效關(guān)系曲線圖3:化合物量效關(guān)系曲線圖4 :化合物8對小鼠冰醋酸扭體試驗(yàn)扭體次數(shù)的影響圖5 :化合物8對小鼠冰醋酸扭體試驗(yàn)潛伏期的影響
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合

本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式I.建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K阿片受體的CHO細(xì)胞株。應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的盒交換技術(shù)(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量構(gòu)建G蛋白偶聯(lián)受體細(xì)胞株，并使其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K阿片受體，培養(yǎng)CH0-0P2細(xì)胞使其達(dá)到穩(wěn)定生長狀態(tài)。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定及最佳細(xì)胞數(shù)確定。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的正確性以及能篩選出可靠的K阿片受體激動(dòng)劑，在建立模型時(shí)需要測定標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定最佳細(xì)胞數(shù)。待CH0-0P2細(xì)胞生長到80%的時(shí)用O. 5mM EDTA的PBS消化細(xì)胞，離心去除上層液體，最后將細(xì)胞用刺激緩沖液重懸用于確定最佳細(xì)胞數(shù)。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit試劑盒，配制標(biāo)準(zhǔn)cAMP梯度稀釋液及腺苷酸環(huán)化酶激活劑(forskolin)梯度稀釋液。標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法將cAMP的標(biāo)準(zhǔn)溶液4 μ mol/L(LANCEd) cAMP檢測試劑盒自帶)，用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，cAMP與抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個(gè)小時(shí)后檢測；最佳細(xì)胞數(shù)檢測方法將5mM的forskolin母液用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度2倍的工作濃度，forskolin與含有細(xì)胞的抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個(gè)小時(shí)后在EnVision微孔板測讀儀上檢測。根據(jù)forskolin量效曲線窗口(性噪比S/B)及曲線與cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相近的細(xì)胞濃度作為最佳細(xì)胞數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線及最佳細(xì)胞數(shù)確定見圖I。3.選用K阿片受體選擇性激動(dòng)劑U50，488對所建立的高通量篩選模型進(jìn)行驗(yàn)證并且根據(jù)量效曲線計(jì)算其的ec5Q。
陽性藥測定方法將23. 8mM的U50，488母液，用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，配置能引起最佳細(xì)胞數(shù)Ratio EraO效應(yīng)的forskolin稀釋液。陽性藥U50,4882. 5μ I與含有最佳細(xì)胞數(shù)的抗體溶液5 μ I加入384孔板中共同孵育15分鐘，再將forskolin稀釋液2. 5 μ I加入384孔板中孵育30分鐘，加入10 μ I終止液再孵育一個(gè)小時(shí)后用EnVision微孔板測讀儀檢測。陽性藥量效曲線見圖2。4.在上述的最佳檢測條件下進(jìn)行K阿片受體激動(dòng)劑的的初篩和復(fù)篩。初篩與復(fù)篩過程相同，初篩只選用一個(gè)濃度對8萬個(gè)化合物進(jìn)行初步篩選，再選擇初篩有效的化合物梯度稀釋8個(gè)濃度進(jìn)行復(fù)篩，過程如下用Janus全自動(dòng)加樣工作站稀釋化合物并吸取5 μ I轉(zhuǎn)移到384孔板中，再用Multidrop自動(dòng)加樣儀將含有最佳細(xì)胞數(shù)的抗體溶液5 μ I加入384孔板中，兩者共同孵育45分鐘后，Multidrop自動(dòng)加樣儀將10 μ I終止液加入384孔板中，再次孵育一個(gè)小時(shí)，用EnVision微孔板測讀儀檢測。復(fù)篩得到一系列具有K阿片受體激動(dòng)作用的化合物，各個(gè)化合物的EC5tl圖見圖3.復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選得到的化合物可以根據(jù)母核的結(jié)構(gòu)總結(jié)為一類，結(jié)構(gòu)式與EC5tl如下
權(quán)利要求
1.下式化合物或其藥學(xué)上可以接受的鹽
2.權(quán)利要求I要求保護(hù)的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可以接受的鹽用于制備K阿片受體激動(dòng)劑的用途。
3.按照權(quán)利要求2的用途，作為K阿片受體激動(dòng)劑，用于治療外周疼痛。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的κ阿片受體激動(dòng)劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。此類化合物有很強(qiáng)的體外激動(dòng)κ阿片受體的活性，EC50均為nM水平，其中活性最強(qiáng)的化合物的EC50為8.74±0.72nM，可用于外周鎮(zhèn)痛。鎮(zhèn)痛試驗(yàn)的結(jié)果表明，扭體抑制率與化合物濃度存在劑量依賴關(guān)系。
文檔編號A61P25/28GK102964279SQ20121054376
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者何玲, 嚴(yán)明, 張陸勇 申請人:中國藥科大學(xué)