專利名稱：較重鹵原子取代的斯夸苷基染料,其制備方法及其在光動力的治療和工業(yè)應(yīng)用中作為敏 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及如下面分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷(squaraine)基染料及其藥學(xué)可接受的衍生物， 分子式1其中X是較重鹵原子，它們能被用于光動力的治療和工業(yè)應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種較重鹵原子取代斯夸苷基染料的制備方法及這種染料在光動力的治療和工業(yè)應(yīng)用中作為敏化劑的用途。
本發(fā)明還涉及如分子式1的斯夸苷染料，其中X是溴或碘，或其藥學(xué)可接受的衍生物，它們可以在診斷和治療人或動物的癌及其它疾病的光動力應(yīng)用中被用作光敏劑。
本發(fā)明還涉及其中X是重鹵原子的如分子式1的斯夸苷染料或其衍生物，它們可被用作水消毒的光動力工業(yè)應(yīng)用中的光敏劑。
光動力治療是用于癌癥和多種疾病的診斷和治療的最新方式。大量證據(jù)提示光動力治療代表一種用于許多癌癥的方便有效的方法。光動力治療包括通過光和化學(xué)藥品(光敏劑)的聯(lián)合作用使活細(xì)胞失活。在靜脈注射后，光敏劑被腫瘤細(xì)胞選擇性地保留。腫瘤組織中比正常組織中有更多的敏化劑。當(dāng)用特定波長的光或激光照射時(shí)，敏化劑產(chǎn)生高反應(yīng)性物種，這些高反應(yīng)性物種改變生物組織而引起癌細(xì)胞的選擇性破壞。
唯一已經(jīng)過廣泛研究的敏化劑是光敏鈉，一種血卟啉衍生物(HpD)，也稱為第一代光敏劑。光敏鈉和其商業(yè)變體Photosan、發(fā)光菌是首先被許可臨床使用并首先獲得管理批準(zhǔn)的?？墒?，光敏鈉的缺點(diǎn)是它是一種組份對所采用的合成方法高度敏感的混合物產(chǎn)品。已知會引起皮膚光敏性的不希望的副作用，因?yàn)樗陨眢w緩釋。在這些情況下，用光敏鈉治療的病人需要長時(shí)間呆在黑暗中直到它從身體內(nèi)排泄完。光敏鈉在光譜的紅區(qū)僅有微弱的吸收(在630nm的摩爾吸收系數(shù)為3000 M-1cm-1)，導(dǎo)致難于將光傳送到某些腫瘤位置以及大腫瘤光穿透的不完全。因此，利用光敏鈉的光動力治療僅顯示在小于10mm深度的表層的癌?？梢詤⒖糄ougherty，T.J.Photochem.Photobiol.1987，45，879；Kessel，D.；Dougherry，T.J.PhorphyrinPhotosensitization；Plenum Publishing Corp.；New York，1983；Brown，S.B.；Truscott，T.G.Chem.Ber，1993，29，955；Andreoni，A.；Cubeddu，R.Phorphyrins in Tumor Phototherapy；Plenum Publishing Corp.NewYork，1984；Brasseur，N.；Hasarat，A.；Langlois，R.；Wagner，J.R.；Roussean，J.；van Lier J.E.Photochem.Photobiol.1987，45，581；Spikes，J.D.，Photochem.Photobiol.1986，43，691；Firey，P.A.；Ford，W.E.；Sounik，J.R.；Kenney，M.E，；Rodgers，M.A.J.J.Am.Chem.Soc.1988，110，7626；Moan，J.Cancer Lett.1986，33，45；Tralau，C.J.；Young，A.R.；Walker，N.P.J.；Vernon，D.I.；MacRobert，A.J.；Brown，S.B.；Brown，S.G.Photochem.Photobiol.1989，49，305。
為了克服第一代敏化劑的缺點(diǎn)，合成了在長波長區(qū)表現(xiàn)出強(qiáng)吸收的第二代敏化劑。正在光動力治療的不同臨床階段進(jìn)行評價(jià)的第二代敏化劑包括二氫卟吩類、porphycenes、苯并卟啉類、酞菁類、紅紫素類和氨基乙酰基丙酸介導(dǎo)的卟啉類。紅紫素類具有良好的光學(xué)性質(zhì)和生物分布型，但是需要加溶劑和乳化劑如脂質(zhì)體或脂蛋白用于其光動力應(yīng)用。二氫卟吩類在光譜的紅區(qū)和紅外區(qū)有強(qiáng)吸收并與光敏鈉競爭，但皮膚光敏性是它們的主要問題。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酞菁和金屬酞箐類在600-700nm區(qū)有強(qiáng)吸收，但是磺化程度對光動力活性的細(xì)節(jié)是不清楚的?？梢詤⒁娒绹鴮＠?03267、5965598、5889181、586035和5789586號；Kostenich，G.A.；Zuravkin，I.N.；Zhavrid，E.A.J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1994，22，211；Leach，M，W.；Higgins，R.J.；Autry，S.A.；Boggan，J.E.；Lee，S.-J.H.；Smith，K.M.Photochem.Photobiol.，Bai，S.；Lin，C.；Guo，Z.Proc.SPIE 1993，1616，275；Vogel，E.；Kocher，M.Schmickler，H.；Lex，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1986，25，197；Leunig，M.；Richert，C.；Gamarra，F(xiàn).；Lumper，W.；Vogel，E.；Jochani D.；Goetz，A.E.Br.J.Cancer 1993，68，225；Boyle，R.W.；Legnoff，C.C.；Vanheir，J.E.Br.J.Cancer 1993，67，1177；Wohrl，D.；Shopova，M.；Muller，S.；Muleiv，A.D.；Mantereva，V.N.；Krastev，K.K.J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1993，21，155；Morgan，A.R.；Garbo，G.M.；Keck，R.W.；Ericksen，L.D.；Selman，S.H.Photochem.Photobiol.1990，51，589。
仍期望開發(fā)這樣的光敏劑，它在長波長區(qū)有強(qiáng)吸收，對正常組織無毒，在生理pH時(shí)溶于緩沖液，能夠在光動力治療期間被漂白，并顯示出更高的治療效果。
斯夸苷形成一類染料，在紅至接近紅外區(qū)具有尖銳并且強(qiáng)的吸收帶。這些染料的摩爾吸收系數(shù)通常在500,000M-1CM-1范圍內(nèi)。斯夸苷在靜電復(fù)印光感受器、太陽能電池和光學(xué)記錄裝置中有工業(yè)應(yīng)用。然而，由于這些染料非常低的系間竄越效率，它們作為光動力治療應(yīng)用中的光敏劑的潛力還沒有研究?？梢詤⒖济绹鴮＠?001523、5552253、5444463號；Law，K.-Y.Chem.Rev.1993，93，449；Piechowski，A.P；Bird，G.R；Morel，D.L；Stogryn，E.L.J.Phy.Chem.1984，88，934。
因此，研究斯夸苷基染料以觀察與先前技術(shù)有關(guān)的問題是否可以被克服。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種光敏劑，基于斯夸苷部分，它適用于光動力治療應(yīng)用。我們的初步研究表明當(dāng)與母體未取代斯夸苷染料相比時(shí)，斯夸苷部分的鹵化作用導(dǎo)致增大的水溶性和系間竄越效率。這些鹵化染料在近紅外區(qū)(＞600nm)表現(xiàn)出強(qiáng)吸收和在微觀不均一性介質(zhì)中顯著的紅移。三重激發(fā)態(tài)是包含在這些系統(tǒng)中的主要過渡態(tài)，它與分子氧有效地相互作用以定量的收率產(chǎn)生生物學(xué)高反應(yīng)性的單線態(tài)氧，由此使它們成為光治療應(yīng)用中潛在的候選者?？梢詤⒖糝amaiah，D.；Joy，A.；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V.；Das，S.；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783。
可是，這些鹵化斯夸苷染料的收率在規(guī)定的條件下較低，并且在膜模型和藥物載體系統(tǒng)如聚合物中其單線態(tài)氧(胞毒劑)的產(chǎn)生效率是未知的。而且，在文獻(xiàn)中對斯夸苷基染料的生物學(xué)性質(zhì)或光動力治療應(yīng)用尚無報(bào)道。對于確定敏化劑在光動力治療應(yīng)用中的用途是重要的生物學(xué)性質(zhì)包括敏化劑在生理pH和照射條件下的穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性、藥理學(xué)方面、生殖毒性和它的體內(nèi)光動力活性的效率等。
本發(fā)明試圖克服上述限制。在本發(fā)明中通過修改加工條件，我們得到了收率增加的較重鹵原子改性的斯夸苷基染料。我們首次研究了典型的斯夸苷基光敏劑的生物學(xué)性質(zhì)。這些研究包括這些敏化劑在生理pH條件下的穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性和在黑暗中和照射條件下的誘變性。另外研究了這些敏化劑的光動力作用的體內(nèi)和體外效率和機(jī)理。
本發(fā)明的主要目的是提供有效的斯夸苷基染料和/或其藥學(xué)可接受的衍生物，它們能夠在光動力治療應(yīng)用包括癌癥的治療中用作敏化劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供斯夸苷基染料和/或其藥學(xué)衍生物，由于它們在微觀不均一性介質(zhì)中的高熒光量子產(chǎn)率，它們能被用作診斷癌的熒光傳感器。
本發(fā)明的又一目的是提供斯夸苷基染料和/或其衍生物，它們能夠用于光動力工業(yè)應(yīng)用如水的消毒等。
本發(fā)明的再一目的是通過在化學(xué)裝置中連接或引入斯夸苷基染料，能夠?qū)崿F(xiàn)使這種藥物傳遞或靶向于確定的活細(xì)胞的生物學(xué)專一性，由此有效的第三代光敏劑也能夠開發(fā)出來。
在說明書附圖中

圖1表示在有光和無光情況下，如分子式1的斯夸苷染料的細(xì)胞殺傷效率的曲線圖。圖2表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的突變種誘導(dǎo)的曲線圖。圖3表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的突變種誘導(dǎo)的曲線圖。圖4表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的微核誘導(dǎo)的曲線圖。圖5表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的微核誘導(dǎo)的曲線圖。
因此，本發(fā)明涉及一種如分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷染料和其藥學(xué)可接受的衍生物，其中X是較重鹵原子。 分子式1在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X選自溴或碘。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，如分子式1的化合物是雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，如分子式1的化合物是雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
本發(fā)明還涉及如分子式1的較重鹵原子取代的斯夸苷染料或其藥學(xué)可接受的衍生物的制備方法，其中X是較重鹵原子， 分子式1包括雙(2，4，6三羥基苯基)斯夸苷與鹵素溶液或鹵鹽在有機(jī)酸中，在50-80℃的溫度范圍內(nèi)，在攪拌下反應(yīng)1-5小時(shí)，冷卻上述反應(yīng)混合物，過濾并洗滌所得化合物，接著重結(jié)晶得到所需化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，鹵鹽是一氯化鹵。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，有機(jī)酸是冰醋酸。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，在過濾和洗滌步驟之前將水加入反應(yīng)混合物中。
在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，鹵原子選自溴和碘。
本發(fā)明還涉及如分子式1的化合物在光動力治療應(yīng)用中作為光敏劑的用途。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，如分子式1的化合物用作腫瘤的熒光檢測劑并用在癌及其它有關(guān)疾病的光動力治療中。
本發(fā)明還涉及如分子式1的化合物在水消毒中作為敏化劑的用途。
本發(fā)明也涉及如分子式1的化合物在通過將其引入化學(xué)裝置使這種藥物靶向于確定的活細(xì)胞來設(shè)計(jì)有效的第三代光敏劑中的用途。
在如分子式1的化合物的制備中，雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的芳環(huán)用較重鹵原子如溴改性以得到雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和用碘改性以得到雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
觀察到具有斯夸苷部分的結(jié)構(gòu)式為雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的化合物及其藥學(xué)衍生物在生理pH條件下具有良好的溶解性和表現(xiàn)出很好地進(jìn)入光動力窗的強(qiáng)吸收(＞600nm)。這些染料在黑暗中是非常穩(wěn)定且無毒的，并且當(dāng)暴露于光時(shí)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞殺傷效率。它們進(jìn)行快速的光漂白并且它們的光降解產(chǎn)物在有光和無光的情況下是無毒的。它們不誘導(dǎo)顯著的突變。由于上述斯夸苷基染料具有良好的光物理和生物學(xué)性質(zhì)，這些化合物非常適合作為光敏劑用于光動力治療和工業(yè)應(yīng)用。
下面的實(shí)施例是說明性，因此，它們不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明范圍的。實(shí)施例1雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem.Int.Ed.Engl.1965，4，694)通過在50-60℃攪拌溶液1-3h溶解在冰醋酸中(1∶4.7×103)中。溶液冷卻后，溴的醋酸溶液(1∶1.7×102)在1-2h內(nèi)被逐滴加入，反應(yīng)混合物在50-60℃加熱1-2h，然后在冰箱中保存10-12h。將形成的沉淀物過濾并用75-100ml水洗滌。然后，從水與異丙醇(3∶1)的混合物中重結(jié)晶得到75-85％的雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的生化性質(zhì)熔點(diǎn)314-315℃，IR(KBr)νmax3413，1622，726和519cm-1；分子量計(jì)算的642.6874；測定的642.6879(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水]λmax610nm(ε47000M-1cm-1)；[甲醇]λmax612nm(ε210000M-1cm-1)；性狀深藍(lán)色粉末。實(shí)施例2雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem.Int.Ed.Engl.1965，4，694)通過在60℃-70℃攪拌溶液1-2h溶解在冰醋酸(1∶4.7×103)中。冷卻后，冰醋酸中的一氯化碘(1∶1.7×102)在1-2h內(nèi)被逐滴加入。將反應(yīng)混合物在50-60℃加熱1-2h，把15ml的水加入其中，并在冰箱中保存10-12h。將形成的沉淀物過濾，用水(75-100ml)洗滌，并從甲醇與異丙醇(3∶1)的混合物中重結(jié)晶得到65-75％的雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的生化性質(zhì)熔點(diǎn)270-271℃；IR(KBr)νmax3383，1603，726和568cm-1；分子量計(jì)算的834.6320；測定的834.8360(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水]λmax617nm(ε63000M-1cm-1)，[甲醇]λmax620nm(ε249000M-1cm-1)；性狀深藍(lán)色粉末。實(shí)施例3由于三線激發(fā)態(tài)是雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷從532nm激光閃爍光分解研究得到的主要瞬時(shí)中間產(chǎn)物，所以，測定了由這些系統(tǒng)產(chǎn)生光敏單線態(tài)氧的效率，因?yàn)閱尉€態(tài)氧是在光動力治療中II型反應(yīng)的主要胞毒劑。由于雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的單脫質(zhì)子化形式有大的三線態(tài)收率并有長的壽命(Ramaaiah.D.Joy，A；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V；Das，S；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783)，而且這些是所期望在生理pH條件(約7.4)下的主要種類的形式。這些染料在光動力治療中用作敏化劑的一級特征，我們研究了在藥物載體、膜模擬物和微觀不均一性介質(zhì)存在下，它們的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)存在下，使用雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷所得的結(jié)果列于表1中。
表1列出了在存在和不存在聚乙烯吡咯烷酮的情況下雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。
表1化合物PVP，mM單線態(tài)氧量子產(chǎn)率雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷 0 0.13±0.00514 0.29±0.001雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷 0 0.47±0.01714 0.62±0.007該結(jié)果顯示在由雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷兩者敏化的情況中，在PVP存在下，單線態(tài)氧的量子產(chǎn)率均顯著增加。在雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的情況中，單線態(tài)氧的產(chǎn)生效率在微觀不均一性介質(zhì)中比在甲醇中多近15％。另外，這些研究指出較重鹵原子取代斯夸苷染料能作為光動力治療應(yīng)用中有效的光敏劑。實(shí)施例4通過使用質(zhì)粒DNA(PM2 DNA)和研究在各種條件下的DNA裂解，對斯夸苷體的外光動力活性的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的評估。DNA裂解之后，調(diào)控超螺旋(形式I)轉(zhuǎn)變到開環(huán)(形式II)和直線形式(形式III)。通過化合物/劑的一種單股斷裂的誘導(dǎo)使形式I轉(zhuǎn)變?yōu)樾问絀I，以及通過如以前文獻(xiàn)(Epe，B.；Hegler，J.J.Methods Enzymol.1994，234，122)所述的DNA弛豫分析對這些形式的定量，表明了它的DNA裂解效率。質(zhì)粒DNA裂解是非常靈敏的技術(shù)，它可以被用于測試敏化劑的各種性質(zhì)以及通過使用清除劑和活化劑得到的DNA損傷分布型，能用作對損傷有直接責(zé)任的物種的一種指紋圖譜并且也提供體外光動力活性機(jī)理的信息。
在冰上的磷酸鹽緩沖液(5mM KH2PO4，50mM NaCl，pH7.4)中的PM2 DNA(10,000bp，10μg/ml)被暴露于斯夸苷染料外加來自距離33cm的1000W鹵燈(Philips，PF811)的光線下。改性DNA通過乙醇/乙酸鈉沉淀和通過DNA弛豫分析定量單股斷裂(SSB)。將超氧物歧化酶(SOD)(20μg/m)、過氧化氫酶(315U/ml)加入或用D2O取代緩沖液中的H2O(最終的同位素純度大于96％)以便對包含的活性物質(zhì)有更好的了解。對典型的斯夸苷基染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的這些研究結(jié)果列于表2中。
表2列出了在有和沒有添加劑的情況下，通過雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷使質(zhì)粒DNA裂解的效率。
表2所列的結(jié)果指出，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶對雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷誘導(dǎo)的DNA裂解效率都沒有顯著影響。因此，在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中沒有添加劑的情況下觀察到的過氧化物和過氧化氫(單股斷裂(SSB)的可能數(shù)量定為100％。
表2在下列條件下單股斷裂的相對數(shù)量(％)化合物pH7.0 pH7.8D2O SOD 過氧化氫酶緩沖液 (20g/mL)(315U/mL)雙(3，5-二溴- 127±12 105±4 526±28 109±5 115±52，4，6-三羥基苯基)斯夸苷雙(3，5-二碘- 134±9109±22 614±97 100±2 92±62，4，6-三羥基苯基)斯夸苷這些物種后來的芬頓(Fenton)反應(yīng)不包括在DNA裂解中。在D2O中雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷誘導(dǎo)的DNA裂解近5和6倍的增強(qiáng)有力地表明，在這些情況中體外的光動力活性是由單線態(tài)氧介導(dǎo)的。實(shí)施例5在有光和無光的情況中敏化劑的穩(wěn)定性信息對于它的實(shí)際使用是重要的。因此，通過利用分光光度法測定吸光度變化研究了在有光和無光情況下，在乙醇和磷酸鹽緩沖液中，在生理pH條件(pH7.4)下，在25℃時(shí)這些染料的穩(wěn)定性。典型的斯夸苷基染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在黑暗中相對時(shí)間的吸光度變化結(jié)果列于表3中。
表3列出了雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在乙醇和緩沖液(pH7.4)中，在黑暗中的穩(wěn)定性。
表3在黑暗 吸光度中的時(shí) 雙(3，5-二溴-2，4，6-雙(3，5-二溴-2，4，6- 雙(3，5-二碘-2，4，6-間，min 三羥基苯基)斯夸苷 三羥基苯基)斯夸苷 三羥基苯基)斯夸苷(乙醇)(緩沖液) (緩沖液)0 1.90 1.84 1.7530 1.88 1.72 1.4760 1.88 1.65 1.3890 1.88 1.61 1.36在黑暗中的結(jié)果顯示染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在乙醇中非常穩(wěn)定，但超過90min，在pH7.4緩沖溶液中受到輕微的漂白。雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在pH7.4緩沖溶液中，在照射條件下所得的結(jié)果列于表4中。
表4列出了雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在緩沖液(pH7.4)中，在照射條件下的穩(wěn)定性。
表4在黑暗中的時(shí)吸光度間，min雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基苯基)斯夸苷基)斯夸苷0 1.8 1.7251.35 0.87101.30 0.74151.25 0.65201.17 0.58301.10 0.47在照射條件下(1000W鹵燈(Philips，PF811)，距離33cm)的結(jié)果顯示，這些染料表現(xiàn)出顯著的光漂白。與雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷(25％)比較，化合物雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷受到很迅速的光漂白(在照射5min內(nèi)近50％)，在兩種情況中光漂白均隨照射時(shí)間的增長而增加。盡管光漂白可能被認(rèn)為是在腫瘤光敏劑中不利的性質(zhì)，但由于可以調(diào)節(jié)劑量到保持腫瘤中的光敏劑在有效水平，它具有潛在的益處。另外，因?yàn)樗鼈兊目焖俟馄?，光動力治療后的病人不需要長時(shí)間呆在黑暗中，并且如果需要，治療可以短時(shí)間間隔頻繁地重復(fù)。實(shí)施例6為了測定有光與無光時(shí)斯夸苷基敏化劑的細(xì)胞殺傷效率(細(xì)胞毒性)，將AS52細(xì)胞暴露在各種濃度的敏化劑下，暴露于光是用1000W鹵燈，距離33cm，在無Ca2+和Mg2+的PBS(140mM NaCl，3mMKCl，8mM Na2HPO4，pH7.4)中在冰上(106細(xì)胞/ml)進(jìn)行的。照明10min相當(dāng)于在400和800nm之間的225kJ/m2。細(xì)胞通過離心成團(tuán)并在PBSG中重懸浮三次。細(xì)胞在新制介質(zhì)中以3×104細(xì)胞/ml在37℃重懸浮，且細(xì)胞數(shù)被重復(fù)計(jì)數(shù)60小時(shí)。由生長曲線的指數(shù)部分(在24和60h之間)，在重懸浮時(shí)增殖的細(xì)胞數(shù)通過外推法計(jì)算。細(xì)胞存活率定義為增殖與重懸浮細(xì)胞之比。用典型的斯夸苷基染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷得到的結(jié)果示于圖1中。
該結(jié)果顯示，在照明條件下，細(xì)胞存活率的百分?jǐn)?shù)隨雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的濃度增加而降低，表明它們在這些條件下的高細(xì)胞殺傷效率。同時(shí)，雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在黑暗中沒有表現(xiàn)出顯著的效果，由此表明了它們在無光情況下的無毒性。這些結(jié)果清楚地證明了較重鹵原子取代斯夸苷染料的光動力治療應(yīng)用。實(shí)施例7斯夸苷基敏化劑的誘變特性是在AS52細(xì)胞中測定的，該AS52細(xì)胞攜帶有細(xì)菌的鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(gpt)基因作為賦與對6-硫代鳥嘌呤的敏感性的選擇標(biāo)記。AS52細(xì)胞在含有11μg/ml黃嘌呤219μg/ml黃嘌呤、22μg/ml腺嘌呤、1.2μg/ml氨蝶呤和8.8μg/ml霉酚酸的清潔介質(zhì)中培養(yǎng)一星期，以消除自發(fā)gpt突變種。細(xì)胞(0.5×106)在回收介質(zhì)(含1.2μg/ml胸腺嘧啶脫氧核苷、11.5μg/ml黃嘌呤、3μg/ml腺嘌呤)中培養(yǎng)48h，然后，如上所述在有光和無光的情況下，暴露于雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷中，之后培養(yǎng)一星期(表達(dá)時(shí)間)。在此時(shí)間內(nèi)，保持細(xì)胞指數(shù)增長。2×105個(gè)細(xì)胞被稀釋在10ml培養(yǎng)介質(zhì)中和被平鋪在皮氏培養(yǎng)皿(94mm)中。2小時(shí)后，將6-硫代鳥嘌呤加入到各平皿(終濃度2.5μg/ml)中以選擇。將200個(gè)細(xì)胞加入到5ml培養(yǎng)介質(zhì)平鋪在皮氏培養(yǎng)皿(60mm)中以確定克隆效率。將平皿保溫7至9天。用Nacl溶液(0.9％v/v)代替介質(zhì)。細(xì)胞群用甲醇(-20℃)固定15min并用吉姆薩(Giemsa)(10％在H2O中)染色15min。暴露于斯夸苷外加光線后接下來的抗6-硫代鳥嘌呤細(xì)胞的定量和細(xì)胞毒性的確定(處理和未處理的細(xì)胞的平皿培養(yǎng)效率之比)，根據(jù)文獻(xiàn)(Tindall，K.R；Stankowski Jr.L.F.；Machanoff，R.；Hsie，A.W.Mutat Res.1986，160，121-131)進(jìn)行。
所得結(jié)果示于圖2和圖3中，它們表明在有光和無光情況下雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷不誘導(dǎo)立即的突變。雖然在有光的情況發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，但當(dāng)與黑暗和控制值比較時(shí)，未發(fā)現(xiàn)自發(fā)突變頻率的顯著增加。實(shí)施例8為進(jìn)一步了解遺傳效果，由雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷誘導(dǎo)的微核也在AS52細(xì)胞中定量。AS52細(xì)胞被如上所述地暴露于斯夸苷中及在全部介質(zhì)中重懸浮。在39℃培養(yǎng)24小時(shí)后，約1×105個(gè)細(xì)胞通過細(xì)胞旋轉(zhuǎn)離心法和用甲醇在-21℃處理1小時(shí)被固定在顯微鏡的載玻片上。在PBS(無Ca2+和Mg2+)中用二苯并二酰亞胺(bisbenzimide)染色3min后，用熒光顯微鏡檢測了2000個(gè)細(xì)胞的微核存在。所得結(jié)果示于圖4和圖5中，它們表明這些染料沒有誘導(dǎo)大量的微核。
本發(fā)明的斯夸苷基染料具有用于光動力的治療和工業(yè)應(yīng)用中的光敏劑的令人滿意的性質(zhì)。這些系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)包括1.以雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷結(jié)構(gòu)為代表的斯夸苷基敏化劑是純的單一物質(zhì)。
2.它們的合成工藝是經(jīng)濟(jì)的。
3.它們在黑暗中十分穩(wěn)定并且在膜模型和載體系統(tǒng)存在時(shí)其穩(wěn)定性增加。
4.它們在生理pH條件下的緩沖液中有非常好的溶解性，因此，藥物制劑能夠通過本身的傳統(tǒng)工藝來制備并避免使用添加劑和載體。
5.它們具有良好的吸收性質(zhì)(＞600nm)及很大的吸收系數(shù)，(約100,000M-1cm-1)6.它們具有好的長壽命的三線態(tài)收率并且在膜模型和載體系統(tǒng)中以定量收率產(chǎn)生單線態(tài)氧。
7.它們在黑暗中無毒而且當(dāng)暴露于光時(shí)顯示出良好的細(xì)胞殺傷作用，如所希望的理想的光敏劑一樣。
8.它們受到快速的光漂白，因此，光動力治療后的病人不需要長時(shí)間呆在黑暗中，并且如果需要，治療可以短時(shí)間間隔頻繁地重復(fù)。
9.在有光和無光情況下，它們的光降解副產(chǎn)物是無毒的。
10.這些染料的光動力活性在暴露于光下5min內(nèi)是最大的，因此，用于治療需要非常短的照射時(shí)間間隔。
11.它們是非誘變的。
12.它們可以被有效地用于靶向于確定的細(xì)胞器的第三代光敏劑的合成。
權(quán)利要求
1.一種如分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷染料及其藥學(xué)可接受的衍生物， 分子式1其中X是較重鹵原子。
2.如權(quán)利要求1所述的染料，其中X選自溴或碘，且分別以雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷為代表。
3.一種如分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷染料或其藥學(xué)可接受的衍生物的制備方法，其中X是較重鹵原子， 分子式1該方法包括雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷與鹵素溶液或鹵鹽在有機(jī)酸中，在50-80℃的溫度范圍內(nèi)，在攪拌下反應(yīng)1-5小時(shí)，冷卻以上反應(yīng)混合物，過濾并洗滌所得化合物，接著通過重結(jié)晶得到所需化合物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中的鹵鹽是一氯化鹵。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中的有機(jī)酸是冰醋酸。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中在過濾和洗滌步驟前將水加入反應(yīng)混合物中。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中的鹵原子選自溴和碘。
8.如分子式1的化合物在光動力治療應(yīng)用中作為光敏劑的用途。
9.如分子式1的化合物在癌和其它相關(guān)疾病的光動力治療中作為腫瘤熒光檢測劑的用途。
10.如分子式1的化合物在水消毒中作為敏化劑的用途。
11.如分子式1的化合物在通過將其引入化學(xué)裝置以使這樣的藥物靶向于確定的活細(xì)胞而設(shè)計(jì)有效的第三代光敏劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及如下面分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷基染料及其藥學(xué)可接受的衍生物,以及其制備方法,其中X是較重鹵原子,它們可被用于光動力的治療和工業(yè)應(yīng)用中。
文檔編號C09B13/00GK1361205SQ0013729
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月29日
發(fā)明者拉邁亞·達(dá)納博伊納, 阿倫·泰扎特威蒂爾·卡利亞特, 蘇雷什·達(dá)斯, 貝恩德·埃佩 申請人:科學(xué)工業(yè)研究院