專利名稱：葡糖苷酸化的對乙酰氨基酚作為肝臟疾病的標(biāo)志的制作方法
葡糖苷酸化的對乙酰氨基酚作為肝臟疾病的標(biāo)志相關(guān)申請
本申請要求2008年10月1日提交的美國臨時專利申請序列號61/194，835的優(yōu)先權(quán)， 其通過引用整體并入本文。政府權(quán)益聲明
本發(fā)明是政府支持進(jìn)行的，其獲美國國立衛(wèi)生研究院R01DK068039的資助。政府在發(fā)明中享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
對乙酰氨基酚(APAP)是最常用的非阿片類鎮(zhèn)痛藥，與大多數(shù)其他類似產(chǎn)品相比是標(biāo)準(zhǔn)的退熱及鎮(zhèn)痛劑。APAP代謝(絕大部分發(fā)生在肝臟中)是良好確定的(圖1)。至少給予劑量的1/2與葡糖醛酸(GLUC)結(jié)合，1/3與硫酸鹽(SULF)結(jié)合，主要經(jīng)由CYP2E1的CYP-450 依賴混合功能氧化酶途徑代謝大約5-9%。這引起毒性反應(yīng)性中間代謝物(NAPQI)的形成， 其進(jìn)一步與谷胱甘肽結(jié)合，形成無毒的半胱氨酸和巰基尿酸結(jié)合物。對乙酰氨基酚的推薦劑量的不足5%未改變地由腎臟排出。對乙酰氨基酚經(jīng)歷從體內(nèi)一級清除(first-order elimination)，且具有短的血漿半衰期(2. 0-2. 4小時)。APAP提供了在藥物代謝物從肝臟排出中外排轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮完整功能的很好的實(shí)例。 為了從肝臟排出，所有APAP代謝物都需要外排轉(zhuǎn)運(yùn)(efflux transport)，并且各個都可以在膽汁和尿中檢測。體內(nèi)處置研究與體外功能轉(zhuǎn)運(yùn)研究顯示，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCC2、ABCC3、 ABCC4和ABCG2各個具有轉(zhuǎn)運(yùn)多種非偶聯(lián)或偶聯(lián)的藥物包括APAP代謝物的能力。ABCC2和 ABCG2定位于肝細(xì)胞小管(頂)膜，從其中它們將它們的轉(zhuǎn)運(yùn)底物排出至膽小管中。因此， 在健康肝臟中，APAP的硫酸鹽、葡糖醛酸和谷胱甘肽結(jié)合物的膽汁排出主要是由ABCC2介導(dǎo)，然而，ABCG2看起來也參與了 APAP-SULF結(jié)合物的排出。ABCC3和ABCC4表達(dá)在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的竇狀小管(基底外側(cè))膜上，從其中ABCC3和ABCC4將它們的底物排出到血液中。APAP-GLUC代謝物由肝細(xì)胞通過竇狀小管排出主要由ABCC3介導(dǎo)，但ABCC4看起來介導(dǎo) APAP-SULF代謝物的排出。最近的研究顯示ABCC3和ABCC4在APAP-SULF的排出中具有等同的作用。最近研究(Drug. Metabolism and Disposition, 35:1970-1978 (2007))已顯示在由甲硫氨酸膽堿缺乏飲食(MCD)飼養(yǎng)大鼠8周引起的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠模型中，肝外排轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCC3和ABCC4的蛋白表達(dá)升高。對這些MCD大鼠的大劑量APAP給予(1 mmol/kg )(相當(dāng)于150磅的人IOg劑量，250磅的人17g劑量)相對于對照產(chǎn)生APAP-GLUC 由膽汁排出向血漿排出的轉(zhuǎn)換。然而，考慮到人沒有甲硫氨酸膽堿缺乏，以及給予大鼠模型的大劑量APAP，已推測MCD大鼠對于人NASH或人肝臟藥物代謝研究不是一個好的模型。通常接受的是沒有動物模型可以精確地概括人NASH。眾多的生化差異使得任何直接對比都潛在地充滿假象。例如，MCD模型缺乏胰島素抵抗，其是NASH中常見的組成(Rinella ME和 Green RM, J Hepatol. 2004 Jan ； 40 (1) 47-51.)。而且，脂肪變性在人中發(fā)生在典型的西方高脂肪飲食中，導(dǎo)致通過肝臟的脂肪凈通量增加，而MCD模型是通過脂代謝的生化損傷引起脂肪變性和脂肪性肝炎。因此，直接將MCD模型和人進(jìn)行對比是不合適的。這尤其考慮到MCD飲食，因?yàn)檫@種非自然飲食對其變量的影響相對于肝臟損傷對其變量的影響是不能描繪的。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明提供了一種診斷人類肝臟疾病的方法，其包括
(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中受試人處于肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)。(b)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和 (c)如果血漿樣品或尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，
則鑒定受試人患有肝臟疾病。第二方面，本發(fā)明提供了鑒定受試人處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括
(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)的量，其中受試人需要治療性藥物的治療；
(b)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和
(c)如果血漿樣品或尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則鑒定受試人處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。第三方面，本發(fā)明提供了確定受試人治療性藥物的合適劑量的方法，其包括
(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)的量，其中受試人需要治療性藥物的治療；
(b)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和
(c)如果血漿樣品或尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則確定受試人應(yīng)該接受非標(biāo)準(zhǔn)劑量的藥物。第四方面，本發(fā)明提供了機(jī)器可讀存儲介質(zhì)，其包含一組指令，用于使代謝物測量裝置執(zhí)行第一、第二、第三實(shí)施方式的方法的任何實(shí)施方式的測量、比較和鑒定步驟。在本文中提供了本發(fā)明這些方面各個的實(shí)施方式。


圖1是顯示了對乙酰氨基酚代謝的流程圖。圖2提供了顯示患有NAFLD的人中肝臟ABCC3和ABCC4表達(dá)的放射自顯影圖。圖3A - B (A)顯示ABCC2蛋白定位在健康正?；颊吒沃械男」苣し浅ｑ薨櫟倪吘?A)，但在NASH肝中，ABCC2明顯地嵌入(blurred into)遠(yuǎn)離小管的膜泡中(B)。圖4顯示了 4h血漿中APAP及其主要代謝物的濃度。圖5是顯示了正常健康志愿者、脂肪變性患者和脂肪性肝炎患者尿液中APAP及代謝物的濃度的圖。圖6 A-C是對于NASH (A)、肝部炎癥(B)、肝纖維變性(C)的血漿APAP_Gluc分析的圖。
具體實(shí)施方式
所有引用的參考都通過引用的方式整體并入于本文。在此申請中，除非另有說明，利用的技術(shù)可以在幾本熟知的參考書的任何中找到，例如-Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook 等人，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) ,“Guide to Protein Purification，， in Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed. , (1990) Academic Press, Inc.) ,PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis^A 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128，ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc. , Clifton, N. J.) \)JsR the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX)。如本文所用，單數(shù)形式“一”和“其”(“a”、“an”和“the”)包含復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確指出。如本文所用，“和”(“and”)與“或”(“or”)互換使用，除非另有明確說明。第一方面，本發(fā)明提供了診斷人類肝臟疾病的方法，其包括
(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中受試人處于肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)。(b)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和 (c)如果血漿樣品或尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，
則鑒定受試人患有肝臟疾病。在第一方面的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法包括
(a)對處于肝臟疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)；
(b)獲得受試人的血漿樣品和/或尿液樣品；
(c)測量血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量；
(d)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和
(e)如果血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高， 則鑒定受試人患有肝臟疾病。發(fā)明人已表明該發(fā)明的方法提供非侵入的血液檢測或尿液檢測來鑒定患者患有各種肝臟疾病。受試人可以是處于肝臟疾病風(fēng)險(xiǎn)的任何人，包括青少年和成年受試人。通過本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從受試人獲得血漿樣品和/或尿液樣品。如本文所用，術(shù)語“肝臟疾病”包括顯示本文描述的對乙酰氨基酚代謝改變的任何肝臟疾病，包括但不限于肝纖維變性、肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎、毒素誘導(dǎo)的脂肪性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝硬化和膿毒血癥。如本文所用，“對乙酰氨基酚，，(APAP)是熟知的止痛和退熱劑和其制劑，結(jié)構(gòu)如圖1所示?？梢詫κ茉嚾耸┯萌魏魏线m劑量的APAP。盡管可以對受試人施用多于一種劑量的APAP，但是指示的最高劑量IOOOmg是優(yōu)選的，以最小化毒性風(fēng)險(xiǎn)，又可以便于代謝物形成的分析。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，給受試人施用250 mg到1000 mg之間的APAP總劑量。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人在測試前至少M(fèi)小時不攝入任何APAP。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，給受試人施用250 mg到1000 mg之間的APAP總劑量?？梢允┯萌魏魏线m劑型的APAP，包括但不限于液體口服劑量形式和固體口服劑量形式。如本文所用，“APAP-葡糖苷酸”是指APAP的一種特定的代謝物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。如本文所用，“對照”是標(biāo)準(zhǔn)化具有健康肝臟的受試人中測量的APAP-葡糖苷酸的量的任何方式。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，對照包括預(yù)先確定的正常個體或群體的 APAP-葡糖苷酸的水平(即已知的未患目的肝臟疾病)。如本文所用，APAP-葡糖苷酸相對于對照“升高”的量可以是指任何高于對照，以及優(yōu)選地是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的升高(如P < 0.05)。在多種優(yōu)選的實(shí)施方式中，血漿樣品或尿液樣品中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照的APAP-葡糖苷酸升高的水平是1. 2倍、1. 4倍、 1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或者更高差異。施用APAP后在任何恰當(dāng)?shù)臅r間點(diǎn)獲得的血漿樣品和尿液樣品來檢測APAP-普糖苷酸可以用于發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的方法中。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量血漿樣品中APAP-葡糖苷酸的量，該測量在APAP施用后在1分鐘到180分鐘之間進(jìn)行；更優(yōu)選地是在1分鐘到120分鐘之間；還更優(yōu)選地是在1分鐘到 60分鐘之間。在不同的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式中，測量在10分鐘到180分鐘之間；30分鐘到180分鐘之間；45分鐘到180分鐘之間；60分鐘到180分鐘之間；10分鐘至Ij 120分鐘之間；30分鐘到120分鐘之間；45分鐘到120分鐘之間；10分鐘到60分鐘之間；30分鐘到60分鐘之間和45分鐘到60分鐘之間進(jìn)行。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量了尿液樣品中APAP-葡糖苷酸的量，并且其中測量在APAP施用后 120分鐘到480分鐘之間；更優(yōu)選地120分鐘到360分鐘之間；還更優(yōu)選地120分鐘到300 分鐘之間或120分鐘到240分鐘之間進(jìn)行。在不同的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式中，測量在APAP 施用后180分鐘到480分鐘之間；180分鐘到360分鐘之間；180分鐘到300分鐘之間； 180分鐘到240分鐘之間；240分鐘到480分鐘之間；240分鐘到360分鐘之間；240分鐘到300分鐘之間；300分鐘到480分鐘之間；300分鐘到360分鐘之間；360分鐘到480 分鐘之間進(jìn)行。在多種進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式中，可進(jìn)行1、2、3、4或更多次測量以例如評估在一個或更多時間點(diǎn)與對照比較APAP-葡糖苷酸的升高。這些方法可以進(jìn)一步包括檢測和 /或測量血漿和/或尿液中的其他分析物，包括但不限于APAP、APAP-硫酸鹽、APAP-NAC和 APAP-GG/CYS?？梢赃M(jìn)行任何合適的處理步驟以制備血漿樣品和/或尿液樣品用于APAP-葡糖苷酸測量。在一個示例性實(shí)施方式中，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將蛋白從血漿樣品和/或尿液樣品中沉淀， 并離心；然后得到的上清用于本發(fā)明方法的測量步驟。測量血漿樣品和尿液樣品之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量可以用任何合適的分析物測量技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于色譜(例如高壓液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、GC質(zhì)譜(GC-MQ、薄層色譜(TLC)等)、核磁共振(NMR)、光譜電化學(xué)技術(shù)、毛細(xì)管電泳和免疫學(xué)技術(shù)。在以上任何實(shí)施方式的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量、比較和鑒定步驟是自動的；在這個實(shí)施方式中，這些步驟可以使用自動儀器來進(jìn)行，這種設(shè)備用于進(jìn)行上述任何技術(shù)。這種設(shè)備包含機(jī)器可讀存儲介質(zhì)，其包含使設(shè)備執(zhí)行測量、比較和鑒定步驟的指令。獲自人測試受試者的血漿樣品和/或尿液樣品在測量APAP-GLUC之前可以保存； 合適的保存條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以將樣品可在合適的溫度冷凍至期望的保存長度；在一個實(shí)施方式中，樣品在-80°C穩(wěn)定長達(dá)一年。在該第一方面的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人處于非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 的風(fēng)險(xiǎn)。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括一系列病理損害，從肝脂肪變性到一種形式的脂肪肝——稱為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，NAFLD中最嚴(yán)重的形式。人活檢中與NASH診斷獨(dú)立相關(guān)的組織學(xué)特征包括肝脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣變性、小葉炎癥、Mallory' s透明蛋白和竇周纖維變性。而且，NASH具有進(jìn)展成需要肝移植的肝硬化的潛能。如本文公開的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在NASH患者中，ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體不是正確地定位在NASH肝的小管膜上，而是定位在遠(yuǎn)離小管的膜泡中。這種ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常定位在 Lickteig等人(2007)描述的大鼠MCD模型中沒有發(fā)現(xiàn)。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在NASH患者中， 肝臟ABCC3和ABCC4表達(dá)上調(diào)。盡管沒有受任何作用機(jī)制束縛，但是發(fā)明人相信，ABCC2向膜泡的改變的肝運(yùn)輸改變了對APAP-GLUC的處置以有利于通過ABCC3和/或ABCC4的血漿維持(然后再排到尿中)，而不是通過ABCC2的膽汁清除。這個實(shí)施方式中的方法可以用于分級患有NAFLD的受試者，并區(qū)分患有NASH的受試者與患有肝脂肪變性的受試者。目前診斷NASH的方法依賴于肝活檢。因此，用于診斷 NASH的非侵入方法是有臨床價(jià)值的，并允許更快地開始NASH的治療，所述治療包括但不限于積極減輕體重方案和治療性藥物治療。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，處于NASH風(fēng)險(xiǎn)的受試人患有非酒精性脂肪肝病、脂肪變性代謝綜合征、肥胖、血脂異常、胰島素抵抗、心血管病和糖尿病中的一種或多種。在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人處于肝纖維變性的風(fēng)險(xiǎn)。 肝纖維變性是過度增生的損傷愈合，其中過多的結(jié)締組織在肝中形成。細(xì)胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生或退化不足，或二者兼有。纖維變性自身不會引起癥狀，但是會導(dǎo)致門脈高壓(瘢痕形成扭曲了經(jīng)肝的血流)或肝硬化(不能適當(dāng)?shù)靥鎿Q被破壞的肝細(xì)胞導(dǎo)致肝功能異常)。目前診斷肝纖維變性的方法依賴于肝活檢。因此，非侵入的診斷肝纖維變性的方法是有臨床價(jià)值的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，處于肝纖維變性風(fēng)險(xiǎn)的受試人患有或以前患有過誘發(fā)肝纖維變性的一個或多個狀況，這些狀況選自α 1-抗胰蛋白酶缺乏、威爾森氏病(Wilson’ s disease)、果糖血癥、半乳糖血癥、III、IV、VI、IX和X型糖元貯積癥、血色病、戈謝病、 Zellweger綜合征、酪氨酸血癥、細(xì)菌感染、病毒感染(例如乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒 (HCV))、寄生蟲感染、布加氏綜合征(Budd-Chiari syndrome )、酒精中毒、藥物成癮、心力衰竭、肝靜脈閉塞病、膽道梗阻和門靜脈栓塞。如下更詳細(xì)公開的，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)患有肝纖維變性的受試人比未患肝纖維變性的受試人在血漿樣品和尿液樣品中APAP-GLUC的量升高。本發(fā)明的這種方法允許更快地開始對肝纖維變性的治療，包括但不限于去除肝臟損傷的基礎(chǔ)，例如通過抗病毒治療消滅HBV 或HCV ；酒精性肝病的戒酒；在血色病和Wilson’ s病患者中分別去除如鐵或銅等重金屬； 或在膽道梗阻中減少膽管壓力。肝纖維變性一般在組織學(xué)上可分級為輕度(血管周圍極小的瘢痕)，中度(瘢痕由肝血管擴(kuò)展出來)或重度(瘢痕在血管間形成橋)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果受試人血漿樣品和尿液樣品之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則該受試人被鑒定為患有重度肝纖維變性。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人患有NASH。在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人處于肝炎的風(fēng)險(xiǎn)，肝炎是一種肝臟的炎癥，其特征為彌漫性或斑片性的壞死。主要病因是特定的肝炎病毒、酒精和藥物。因此，在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人患有或以前患有過選自下列的一種或多種疾病酒精中毒、藥物成癮、細(xì)菌感染、病毒感染(如A、B、C、D和/或E型肝炎)、真菌感染、原生動物感染、寄生蟲感染、螺旋體感染、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。如下更詳細(xì)公開的，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)患有肝臟炎癥(肝炎)的受試人具有高于未患肝纖維變性的受試人的血漿和尿液中的APAP-GLUC的量。肝臟炎癥一般在組織學(xué)上被分級為輕度(少于2個炎癥病灶)，中度(2-4個炎癥病灶)，或重度(多于4個炎癥病灶)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果受試人血漿和尿液之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則該受試人被鑒定為患有中度或重度肝臟炎癥。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果受試人血漿和尿液之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則該受試人被鑒定為患有重度肝炎。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人患有NASH和/或肝纖維變性。第二方面，本發(fā)明提供了鑒定受試人處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括
(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中APAP-葡糖苷酸的量，其中受試人需要治療性藥物的治療；
(b)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和
(c)如果血漿樣品或尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則鑒定受試人處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。在第二方面的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法包括
(a)對需要治療性藥物治療的受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)；
(b)獲得受試人的血漿樣品和/或尿液樣品；
(c)測量血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量；
(d)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和
(e)如果受試人血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則鑒定受試人處于不良藥物反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。第三方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法可以確定受試人治療性藥物的合適劑量，其包括
(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中受試人需要治療性藥物的治療；
(b)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和
(c)如果血漿樣品或尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則確定受試人應(yīng)該接受非標(biāo)準(zhǔn)劑量的藥物。在第三方面的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法包括
(a)對需要治療性藥物治療的受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)；
(b)獲得受試人的血漿樣品和/或尿液樣品；
(c)測量血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量
(d)將血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和(e) 如果受試人血漿樣品和尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則鑒定受試人為應(yīng)該接受非標(biāo)準(zhǔn)劑量的藥物。本發(fā)明的第一、第二和第三方面所有共有的術(shù)語具有相同的定義；除非上下文明確指出，本發(fā)明的第一方面的所有實(shí)施方式被應(yīng)用到本發(fā)明的第二和第三方面。如本文公開的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在NASH患者中，ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體不是正確地定位在NASH肝的小管膜上，而是定位在遠(yuǎn)離小管的膜泡中。這種ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常定位在 Lickteig等人(2007)描述的大鼠MCD模型中沒有發(fā)現(xiàn)。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在NASH患者中， 肝臟ABCC3和ABCC4表達(dá)上調(diào)。盡管沒有受任何作用機(jī)制束縛，但是發(fā)明人相信，ABCC2向膜泡的改變的肝運(yùn)輸改變了對APAP-GLUC的處置以有利于通過ABCC3和/或ABCC4的血漿維持(然后再排到尿中)，而不是通過ABCC2的膽汁清除。因此APAP代謝物消除由膽汁向血漿/尿液的部分改變表明可影響藥物消除路徑的排出轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和/或細(xì)胞定位的改變， 并因此提供方法以鑒定由于排出轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和/或定位變化而處于不良藥物反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的受試人。如本文所用，“處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)”是指受試人更可能經(jīng)歷一種或多種與接受的藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。這種可能的不良反應(yīng)包括對于任何給定藥物的任意一種產(chǎn)品說明書中列舉的任何這種不良反應(yīng)以及特殊的不良反應(yīng)。如本文所用，“藥物的非標(biāo)準(zhǔn)劑量”是指考慮到升高的藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，主治醫(yī)師應(yīng)該改變對受試人施用的藥物劑量。在本發(fā)明的第二和第三方面的多個優(yōu)選的實(shí)施方式中，需要治療性藥物治療的受試人處于NASH、肝纖維變性和/或肝炎的風(fēng)險(xiǎn)或患有這些疾病。處于這些疾病中每一種的風(fēng)險(xiǎn)的受試人在本發(fā)明的第一方面都有詳細(xì)公開。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人患有導(dǎo)致ABCC2、ABCC3和/或ABCC4轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和/或定位改變的任何疾病。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，疾病導(dǎo)致ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常定位。在多個優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療性藥物是這樣的藥物，其代謝物通過ABCC2、ABCC3 和/或ABCC4從肝臟中轉(zhuǎn)運(yùn)出去。在多個非限制性實(shí)例中，這些治療性藥物包括阿霉素、順鉬、依托泊甙、氨甲蝶呤、嗎啡、依折麥布(ezeitimibe)、葡糖醛酸化的共軛藥物、谷胱甘肽共軛藥物和硫酸共軛藥物。APAP的任何合適劑量都可以給受試人施用。雖然可以給受試人施用多于一種劑量，但是在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，施用單個劑量以便于代謝物形成的分析。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試人在測試前至少M(fèi)小時不攝入任何APAP。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式中的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，給受試人施用250 mg到1000 mg之間的APAP總劑量。可以施用任何合適劑型的APAP，包括但不限于液體劑量形式和固體口服劑量形式。施用APAP后在任何恰當(dāng)?shù)臅r間點(diǎn)獲得的血漿樣品和尿液樣品來檢測APAP-普糖苷酸可以用于發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的方法中。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量血漿樣品中APAP-葡糖苷酸的量，并且該測量在APAP施用后在1 分鐘到240分鐘之間進(jìn)行；更優(yōu)選地是在1分鐘到180分鐘之間；還更優(yōu)選地是在APAP施用后在1分鐘到120分鐘或1分鐘到60分鐘之間。在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方式的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量尿液樣品中APAP-葡糖苷酸的量，并且其中測量在APAP施用后120分鐘到480分鐘之間進(jìn)行；更優(yōu)選地在APAP施用后120分鐘到360分鐘之間；還更優(yōu)選地在APAP施用后120分鐘到300分鐘之間或120分鐘到240分鐘之間?？梢赃M(jìn)行任何合適的處理步驟以制備血漿樣品和/或尿液樣品用于APAP-葡糖苷酸測量。在一個示例性實(shí)施方式中，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將蛋白從血漿樣品和/或尿液樣品中沉淀， 并離心；然后得到的上清用于本發(fā)明方法的測量步驟。測量血漿樣品和尿液樣品之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量可以用任何合適的分析物測量技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于色譜(例如高壓液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、GC質(zhì)譜(GC-MQ、薄層色譜(TLC)等)、核磁共振(NMR)、光譜電化學(xué)技術(shù)、毛細(xì)管電泳和免疫學(xué)技術(shù)。如本文所用，“對照”是標(biāo)準(zhǔn)化具有健康肝臟的受試人中測量的APAP-葡糖苷酸的量的任何方式。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，對照包括預(yù)先確定的正常個體或群體的 APAP-葡糖苷酸的水平(即已知的未患目的肝臟疾病)。如本文所用，APAP-葡糖苷酸相對于對照“升高”的量可以是指任何高于對照，以及優(yōu)選地是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的升高(如P < 0.05)。在多種優(yōu)選的實(shí)施方式中，血漿樣品或尿液樣品中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照的APAP-葡糖苷酸升高的水平是1. 2倍、1. 4倍、 1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或者更高差異。在以上任何實(shí)施方式的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量、比較和鑒定步驟是自動的；在這個實(shí)施方式中，這些步驟可以使用自動儀器來進(jìn)行，這種設(shè)備用于進(jìn)行上述任何技術(shù)。這種設(shè)備包含機(jī)器可讀存儲介質(zhì)，其包含使設(shè)備執(zhí)行測量、比較和鑒定步驟的指令。第四方面，本發(fā)明提供了一種機(jī)器可讀存儲介質(zhì)，其包含一組指令，用于使代謝物測量裝置執(zhí)行發(fā)明的第一、第二和第三方面方法的任何實(shí)施方式的測量、比較和鑒定步驟。 如本文所用，術(shù)語“計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”包括通過CPU可讀的磁盤、光盤、有機(jī)存儲器和任何其他的易失性(如隨機(jī)存取存儲器(“RAM”))或非易失性(如只讀存儲器(“ROM”))海量存儲系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括共同運(yùn)轉(zhuǎn)的或相互關(guān)聯(lián)的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，這些計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)在數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)上排他的存在或者可被本地或遠(yuǎn)程的多個相互關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)間分布。如本文所用，“代謝物測量裝置”是指可以進(jìn)行代謝物測量以進(jìn)行本發(fā)明的裝置，這個裝置包含但不限于色譜裝置(例如高壓液相色譜(HPLC)裝置、氣相色譜(GC)裝置、 GC質(zhì)譜(GC-MQ裝置、薄層色譜(TLC)裝置等)、核磁共振(NMR)裝置、光譜裝置、電化學(xué)裝置、免疫檢測裝置和毛細(xì)管電泳裝置。
實(shí)施例實(shí)施例1 在診斷為NASH的人中肝臟外排轉(zhuǎn)運(yùn)體升高的表達(dá)
進(jìn)行研究以確定患有NAFLD的患者是否顯示了改變的對乙酰氨基酚代謝與處置。正常肝臟、脂肪變性、具有脂肪肝的NASH和末期NASH(隱源性肝硬化)患者的肝臟樣本獲自NIH 資助的肝組織獲得和分布系統(tǒng)(LTPADS)。免疫印跡蛋白分析。全細(xì)胞裂解物(20μβ/孔)利用在7. 5%凝膠上的SDS-PAGE分離，并以30毫安恒流過夜轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。所有的膜用含吐溫-20的PBST配制的5%的脫脂奶粉在室溫封閉1小時。然后膜在一級抗體溶液(1:2000在PBST-牛奶中稀釋)中在4°C 孵育過夜，一級抗體由ABCC3、ABCC4單克隆抗體(Abeam, Cambridge, ΜΑ)或GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)組成。過夜孵育后，將膜在辣根過氧
11化酶偶聯(lián)的二級抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)溶液中在室溫孵育 1 /]、#。ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare
Life Sciences, Piscataway, NJ))通過制造商的步驟進(jìn)行檢測。圖2顯示在患有NAFLD的人中肝臟ABCC3和ABCC4的表達(dá)。當(dāng)與對照比較時，具有脂肪變性的肝臟中ABCC3和ABCC4的表達(dá)幾乎沒有變化；但是各期NASH患者肝臟中蛋白表達(dá)顯著提高。雖然之前認(rèn)為人體中這些轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的表達(dá)具有大的個體間差異，但是看起來這種差異很大程度上可能是由于疾病狀態(tài)引起的。實(shí)施例2診斷為NASH的人的肝臟中ABCC2的細(xì)胞定位改變。改變的細(xì)胞運(yùn)輸作為調(diào)節(jié)ABCC2功能的一種方式已經(jīng)在多種狀況下被良好證明， 如藥物誘導(dǎo)的毒性和妊娠。ABCC2活性的要求是在小管膜上的正確定位。將ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體移動遠(yuǎn)離小管膜進(jìn)入膜泡可能是一種進(jìn)化優(yōu)勢，這允許細(xì)胞快速調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)活性，而不必等待相對較慢的蛋白降解/從頭合成過程。免疫組織化學(xué)染色。簡單的說，將福爾馬林固定、石蠟包埋的人肝臟樣品的組織切片在二甲苯中脫蠟，并在乙醇中再水化，然后在檸檬酸緩沖液(PH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)。將內(nèi)源性過氧化酶活性用在甲醇中的0. 3% (ν/ν) Η202封閉20分鐘。所有切片置于Siandon kquenza 切片盒(Thermo-Scientific，ffaltham, ΜΑ)中用于保持試劑孵育。通過將所有的樣品在 Background Sniper (Biocare Medical, Concord, CA)中孵育 10 分鐘來封閉背景染色。然后將樣品在小鼠MRP2單克隆抗體中在4°C孵育過夜。第二天，將樣本各個在 Mouse Probe and HRP Polymer (Biocare Medical, Concord, CA) ) ψ IP W 15 ^vIt ^llJ 結(jié)合的抗體。通過在Betazoid DAB (Biocare Medical, Concord, CA)中孵育3分鐘，然后在去離子水中淬滅來進(jìn)行顯色。所有的樣品用新鮮過濾的蘇木精溶液(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)復(fù)染。所有的切片用 Nikon Eclipse E4000 顯微鏡和 Sony Exwave DXC-390相機(jī)照相。如圖3所示，ABCC2在正常健康人的肝臟中定位于小管膜的非常褶皺的邊緣 (very crisp edges)，但是在NASH患者肝中，ABCC2明顯地嵌入(blurred into)遠(yuǎn)離小管的膜泡中。轉(zhuǎn)移ABCC2遠(yuǎn)離它的活性位點(diǎn)的機(jī)制允許肝細(xì)胞在細(xì)胞應(yīng)變過程中有效地調(diào)節(jié)和保存重要的內(nèi)源成分，同時維持蛋白表達(dá)。ABCC2向膜泡的改變的細(xì)胞轉(zhuǎn)移改變了 APAP-GLUC的處置，以便于血漿維持，而不是膽汁清除。實(shí)施例3 =NASH兒童患者血漿和尿液中對乙酰氨基酚-葡糖苷酸的水平高于脂肪變性患者
在兒童患者中進(jìn)行了研究，這些患者的疾病狀態(tài)已經(jīng)被活檢證實(shí)。由于假定沒有干擾因素(如飲酒、不當(dāng)藥物使用)和兒童肥胖的日益流行，24例兒童患者(12-18歲)對于初步研究是理想的。相反地，由于年齡原因，兒童患者僅僅發(fā)生真正肝損傷的數(shù)量是有限的，兒童患者不能發(fā)展成氣球樣變性，限于脂肪沉積、炎癥和纖維變性。高效液相色譜分析。依據(jù)以前描述的方法(Howie等，1977a ;Chen等，2000; Slitt等2003d)，通過高效液相色譜分析定量血漿樣品和尿液樣品中的APAP及其代謝物。APAP 及其代謝物用具有 aPhenomenex Security Guard Column Guard 的 hrbmax SB-C18反相4. 6-mm χ 25_cm柱分離，用由12. 5%的HPLC級甲醇、1%乙酸和86. 5%水組成的流動相洗脫，流速為1.2 mL/分鐘。代謝物的洗脫在254nm波長下監(jiān)測。APAP及其代謝物的保持時間通過與標(biāo)準(zhǔn)品來確定。因?yàn)檫@種HPLC方法不能分開APAP的半胱氨酰甘氨酸共軛物和半胱氨酸的共軛物，所以它們作為APAP-CG/CYS—起定量。使用Beckman System Gold HPLC 系統(tǒng)(Beckman Coulter, Inc. , Fullerton, CA )分析樣品，該系統(tǒng)配置了 128-nm溶劑模塊和166-nm檢測器?；谡系姆迕娣e(integrated peak areas)來定量。 APAP及其代謝物的濃度用APAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算，因?yàn)锳PAP和其共軛代謝物的摩爾消光系數(shù)是幾乎相同的(Howie等，1977b)。為了沉淀血漿和尿液中的蛋白，樣品用冰冷的甲醇分別進(jìn)行1:2，1:2，1:3稀釋，在4°C 4000 χ g離心30分鐘。收集得到的上清，在HPLC分析前稀釋于流動相1:3 (尿液)或1:2 (血漿)中。圖4顯示APAP施用后1小時，血漿中APAP及其主要代謝物的濃度。表1中顯示的是平均數(shù)和中位數(shù)的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種診斷人類肝臟疾病的方法，其包括(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自所述受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中所述受試人處于肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)；(b)將所述血漿樣品和所述尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和(c)如果所述血漿樣品或所述尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則鑒定受試人患有肝臟疾病。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述處于肝臟疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試人患有一種或多種代謝綜合征、肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和糖尿病。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試人處于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的風(fēng)險(xiǎn)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述處于NASH風(fēng)險(xiǎn)的受試人患有一種或多種非酒精性脂肪肝病、代謝綜合征、肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和糖尿病。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試人處于肝纖維變性的風(fēng)險(xiǎn)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述受試人患有或以前患有選自下列的一種或多種病癥 α r抗胰蛋白酶缺乏癥、威爾森氏病、果糖血癥、半乳糖血癥、III、IV、VI、IX和X型糖元貯積癥、血色病、戈謝病、澤爾韋格氏綜合征、酪氨酸血癥、細(xì)菌感染、病毒感染、寄生蟲感染、 布加氏綜合征、酒精中毒、藥物成癮、心力衰竭、肝靜脈閉塞病和門靜脈栓塞。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試人處于肝炎的風(fēng)險(xiǎn)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述受試人患有或以前患有選自下列的一種或多種疾病 酒精中毒、藥物成癮、細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染、蠕蟲感染、螺旋體感染、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。
9.權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在血漿樣品中測量，并且其中測量在施用APAP后1分鐘到180分鐘之間進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在尿液樣品中測量， 并且其中測量在施用APAP后120分鐘到480分鐘之間進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)的方法，其中對所述受試人施用250mg到1000 mg之間的 APAP。
12.一種鑒定受試人處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自所述受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)的量，其中所述受試人需要治療性藥物的治療；(b)將所述血漿樣品和所述尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和(c)如果所述血漿樣品或所述尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則鑒定所述受試人處于藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
13.一種確定受試人治療性藥物的合適劑量的方法，其包括(a)對受試人施用對乙酰氨基酚(APAP)后，測定獲自所述受試人的血漿樣品和/或尿液樣品中對乙酰氨基酚(APAP)的量，其中所述受試人需要治療性藥物的治療；(b)將所述血漿樣品和所述尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量與對照比較；和(c)如果所述血漿樣品和所述尿液樣品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相對于對照升高，則確定受試人應(yīng)該接受非標(biāo)準(zhǔn)劑量的藥物。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述受試人需要選自下列的一種或多種治療性藥物的治療阿霉素、順氯氨鉬、依托泊甙、氨甲蝶呤、葡糖苷酸化的共軛藥物、谷胱甘肽共軛藥物和硫酸共軛藥物。
15.權(quán)利要求12-14任意一項(xiàng)的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在血漿樣品中測量，并且其中測量在施用APAP后1分鐘到180分鐘之間進(jìn)行。
16.權(quán)利要求12-15任意一項(xiàng)的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在尿液樣品中測量，并且其中測量在施用APAP后120分鐘到480分鐘之間進(jìn)行。
17.權(quán)利要求12-16任意一項(xiàng)的方法，其中對所述受試人施用250mg到1000 mg之間的 APAP。
18.權(quán)利要求1-17任意一項(xiàng)的方法，其中所述測量、比較和鑒定的步驟是自動的。
19.一種可讀存儲介質(zhì)，其包含用于使代謝物測量裝置執(zhí)行權(quán)利要求1-18中的任意一項(xiàng)測量、比較和鑒定步驟的一組指令。
全文摘要
本發(fā)明提供了診斷人類肝臟疾病例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、鑒定受試人處于不良藥物反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)和確定對受試人合適的治療性藥物劑量的方法。標(biāo)記是來自人受試人血漿樣品或尿液樣品中的對乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的增加的水平。
文檔編號G01N33/94GK102227641SQ200980147904
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月1日
發(fā)明者N.徹林頓 申請人:亞利桑那大學(xué)評議會