專利名稱：降解高濃度甲苯的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種能夠降解高濃度甲苯，并利用甲苯作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲苯是一種重要的有機(jī)溶劑和應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)化工原料，工業(yè)上被大量生產(chǎn)和使用。由于泄漏和處置不當(dāng)，甲苯成為許多工業(yè)點(diǎn)源廣泛排放的重要污染物，并成為空氣、水體等環(huán)境中存在的主要污染物之一。甲苯具有揮發(fā)性，但甲苯很難從水環(huán)境中完全除去，并可能長(zhǎng)時(shí)間存在。甲苯具有很強(qiáng)的毒性，暴露于一定濃度的甲苯會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，甲苯的主要毒害作用是對(duì)人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，中毒嚴(yán)重可致死。例如，甲苯濃度達(dá)到或超過(guò)lmg/L可能損害神經(jīng)系統(tǒng)、腎和肝臟。由于其對(duì)人體的毒性，甲苯已經(jīng)被美國(guó)和中國(guó)等很多國(guó)家列入優(yōu)先控制污染物黑名單。有些國(guó)家還制定了人體接觸甲苯等苯系物的極限容許濃度。甲苯的毒害主要是由于其所具有的辛醇_水分配系數(shù)和較高的水溶性。有機(jī)溶劑的毒性與其在辛醇和水中分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值(log Pow)相關(guān)，log 介于1.5-4.0之間的有機(jī)溶劑對(duì)生物體細(xì)胞具有極強(qiáng)的毒性，因?yàn)樗鼈儠?huì)選擇性地分配到細(xì)胞質(zhì)膜中，破壞其結(jié)構(gòu)和功能。甲苯的log P。W(2.73，25°C )恰在此范圍內(nèi)。同時(shí)，甲苯的溶解度(532mg/L， 25°C )較高，在污染水體中具有較大的擴(kuò)散傾向。甲苯污染治理包括采用物理、化學(xué)和生物等方法，其中，生物方法利用微生物對(duì)甲苯的降解和代謝能力，可以完全去除甲苯。生物方法設(shè)備簡(jiǎn)單，運(yùn)行費(fèi)用低，二次污染小，具有經(jīng)濟(jì)、節(jié)能、環(huán)境友好等潛在優(yōu)勢(shì)，是治理甲苯等苯系物污染的重要技術(shù)之一。目前，已報(bào)道的能夠好氧降解甲苯的微生物主要包括Pseudomonas (假單胞菌) 屬、Alcaligenes 屬、Acinetobacter 屬、Rhodococcus 屬禾口 Nocardia 屬的某些種的細(xì)菌。其中，某些 Pseudomonas 屬細(xì)菌，如 Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa 禾口 Pseudomonas fluorescens,因其在多種芳香族化合物降解方面的出色表現(xiàn)而成為廣為研究的菌種。不過(guò)，這些Pseudomonas屬細(xì)菌能夠降解的甲苯液相濃度往往低于200_300mg/ L。用于甲苯污染治理的生物方法，對(duì)高污染物濃度是十分敏感的，高甲苯濃度可能導(dǎo)致污染處理系統(tǒng)因微生物降解和耐受能力的局限而完全失效。因此，分離對(duì)高濃度甲苯具有強(qiáng)降解和強(qiáng)耐受能力的微生物菌株對(duì)污染環(huán)境的生物修復(fù)具有重要的意義。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一種嚴(yán)格的非發(fā)酵型需氧的革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于水、土壤、植物根系、人和動(dòng)物的體表與消化道中。關(guān)于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌降解甲苯的報(bào)道僅見(jiàn)一例。Lee等(J. Air & Waste Manage. Assoc. 2002， 52 400-406)從生物濾床中分離得到1株S. maltophilia T3_c，這株菌能夠降解甲苯，但其降解和耐受甲苯的能力十分有限，報(bào)道中加入甲苯總量的最大值僅為70μπιΟ1，根據(jù)其采用的培養(yǎng)條件進(jìn)行計(jì)算，其培養(yǎng)初始時(shí)最大甲苯液相濃度僅為30. lmg/L。這遠(yuǎn)不能滿足高濃度甲苯污染條件下生物修復(fù)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株能夠降解高濃度甲苯和利用甲苯作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用。該菌株是利用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，以0. (ν/ν)甲苯作為選擇壓力，從北京市高碑店污水處理廠活性污泥樣品中，經(jīng)多周期馴化、富集和分離得到的。根據(jù)其16S rRNA基因序列測(cè)定數(shù)據(jù)，以及細(xì)胞形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定，該菌種為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。將該菌株命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，已于 2011 年 5 月 10 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4839。本發(fā)明的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839可用來(lái)降解甲苯。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解甲苯的方法。本發(fā)明所提供的降解甲苯的方法，是利用嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCCNo. 4839降解甲苯。其中，具體包括如下步驟，將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839接種到含有甲苯濃度為182. 4-401. 3mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中30_37°C振蕩培養(yǎng)降解甲苯。該方法還可包括預(yù)培養(yǎng)步驟。所述預(yù)培養(yǎng)為在濃度182. 4-401. 3mg/L含甲苯的豐富培養(yǎng)基或無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中 30-37°C振蕩預(yù)培養(yǎng)。所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150_200rpm。所述接種后嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839的OD6tltl為0. 15-0. 50。所述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基組成可包括Na2HPO4 5. 65g/L, KH2PO4 5. 44g/L, (NH4)2SO4 1. 00g/L,氨三乙酸 0. 2g/L, MgSO4O. 29g/L, CaCl2 · 2H20 0. 07g/L, (NH4) 6Mo7024 · 4H20 0. 19g/ L, FeSO4 · 7H20 8. 3mg/L,乙二胺四乙酸二鈉 3. lmg/L, ZnSO4 · 7H20 13. 7mg/L, MnSO4 · 7H20 1. 9mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 5mg/L, Co(NO3)2 · 6H20 0. 3mg/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 2mg/L。本發(fā)明的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839能夠在高甲苯濃度下降解甲苯，并利用甲苯作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCCNo. 4839對(duì)甲苯具有極強(qiáng)的降解、利用和耐受能力，這使其在甲苯污染環(huán)境的生物修復(fù)以及生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有重要的優(yōu)勢(shì)和潛在的應(yīng)用前景。


圖1嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在LB瓊脂平板上的菌落；圖2嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中在不同甲苯濃度下生長(zhǎng)的特征；圖3嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中在不同甲苯濃度下生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率；圖4嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在不同溫度條件下生長(zhǎng)的特征；圖5嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在不同pH條件下生長(zhǎng)的特征；
圖6嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在不同供氧條件下生長(zhǎng)的特征；圖7嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在不同預(yù)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的特征；圖8嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839在LB培養(yǎng)基中對(duì)甲苯的耐受性；圖9嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839分別以苯、乙苯和二甲苯為唯一碳源的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)描述。實(shí)施例1、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的分離在250ml血清瓶中，加入50ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成包括Na2HP045. 65g/L， ΚΗ2Ρ045· 44g/L, (NH4)2SO4L OOg/L,氨三乙酸 0. 2g/L, MgSO4O. 29g/L, CaCl2 · 2H20 0. 07g/ L，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 19g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 8. 3mg/L，乙二胺四乙酸二鈉 3. lmg/L， ZnSO4 · 7H20 13. 7mg/L, MnSO4 · 7H20 1. 9mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 5mg/L, Co (NO3)2 · 6H20 0. 3mg/ L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 2mg/L。在121°C條件下將培養(yǎng)基滅菌20分鐘。通過(guò)無(wú)菌操作，向血清瓶中加入0. 1% (ν/ν)甲苯。取高碑店污水處理廠好氧活性污泥2ml，無(wú)菌加入到上述250ml血清瓶中。用含膠墊的瓶蓋封閉血清瓶，并進(jìn)一步用Parafilm薄膜密閉培養(yǎng)系統(tǒng)。將血清瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C和150rpm。培養(yǎng)5d后，從中取2ml培養(yǎng)液，無(wú)菌加入到內(nèi)含0. 1 % (ν/ ν)甲苯和50ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的250ml血清瓶中，在30°C和150rpm條件下培養(yǎng)5d。然后， 重復(fù)此過(guò)程，共5-6個(gè)周期。培養(yǎng)結(jié)束后，取培養(yǎng)液在LB瓊脂平板(蛋白胨10g/L，酵母膏 5g/L, NaCl 10g/L，瓊脂15g/L)上稀釋涂布，分離得到可以降解甲苯的菌株。該菌株在LB瓊脂平板上菌落呈黃色，圓形，中央隆起(圖1)。菌株的生理生化特征參見(jiàn)表1。表1嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4839。
2.如權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在降解甲苯中的應(yīng)用。
3.一種降解甲苯的方法，是利用嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839降解甲苯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步驟，將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 CGMCC No. 4839接種到含有甲苯濃度為182. 4-401. 3mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中30_37°C振蕩培養(yǎng)降解甲苯。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于還包括預(yù)培養(yǎng)步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述預(yù)培養(yǎng)為在含甲苯濃度 182. 4-401. 3mg/L的豐富培養(yǎng)基或無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中30_37°C振蕩預(yù)培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150-200rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述接種后嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No. 4839 的 0D_ 為 0. 15-0. 50。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基組成包括Na2HPO45. 65g/ L, KH2PO4 5. 44g/L, (NH4)2SO4 1. 00g/L,氨三乙酸 0. 2g/L, MgSO4 0. 29g/L, CaCl2 · 2H20 0. 07g/L，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 19g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 8. 3mg/L，乙二胺四乙酸二鈉 3. lmg/L， ZnSO4 · 7H20 13. 7mg/L, MnSO4 · 7H20 1. 9mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 5mg/L, Co (NO3)2 · 6H20 0. 3mg/ L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 2mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種降解高濃度甲苯的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌命名為，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4839。本發(fā)明還公開(kāi)了一種降解甲苯的方法，是利用嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No.4839降解甲苯。本發(fā)明的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No.4839能夠在高甲苯濃度下降解甲苯，并利用甲苯作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC No.4839對(duì)甲苯具有極強(qiáng)的降解、利用和耐受能力。
文檔編號(hào)A62D101/20GK102250788SQ20111014139
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者喻國(guó)策, 王建龍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)