合個(gè)體；Lane中為中黃純合個(gè)體）。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0032] 以下實(shí)施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 1)首先克隆出高油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列 (NCBIID為100805777,大豆基因組數(shù)據(jù)庫序列編號(hào)為：Glyma20g24530)，利用DNAstar 軟件進(jìn)行序列比對(duì)首次發(fā)現(xiàn)了單堿基突變（序列比對(duì)結(jié)果見附圖1)，該突變位點(diǎn)發(fā)生在 GmFAD-2-lB的409bp處，SNP突變?yōu)橐吧虰AY的C變成A3型的G。同時(shí)提供待測(cè)樣品的 DNA〇
[0035] 2)根據(jù)步驟1)中突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAPS標(biāo)記的上游引物FAD2-1B-F2D，下游引物 FAD2-1B-R2 (如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示），利用以待鑒定材料的基因組DNA作為模 板進(jìn)行GmFAD2-lB突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，所采用的PCR反應(yīng)體系（表1)及擴(kuò)增程序如下：
[0036] 表1PCR反應(yīng)體系
[0037]
[0038]PCR擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，52°C退火30s，72°C延伸15s，共 40個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。
[0039] 3)對(duì)步驟2)中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物為模板，分別加入lyl NEB4#buffer，0. 2y1Apal內(nèi)切酶，最后用3. 8y1超純水補(bǔ)齊至總反應(yīng)體積101y1，37°C 過夜酶切。
[0040] 4)取步驟3)中的酶切產(chǎn)物5y1，加入1y1 6Xloadingbuffer，點(diǎn)樣于制備好的 聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳。
[0041] 其中，電泳所需試劑及具體反應(yīng)流程如下。
[0042] 實(shí)驗(yàn)試劑：30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液（37. 5:1)避光保存；1. 5MTris-HClbuffer(pH 8.8) ;0.5MTris-HClbuffer(pH6.8) ;10%APS(過硫酸銨）；TEMED;1XTris-glycine電 泳緩沖液。
[0043] 配制分尚膠：根據(jù)具體膠板容量的大小配制相應(yīng)體積的分尚膠，以l〇ml12% 分離膠為例，依次加入雙蒸水3. 43ml;30%丙稀酰胺4ml;1.5MTris-HClbuffer(pH 8. 8)2. 5ml;10%APS60y1;TEMED13y1。灌膠之后在膠面上加入lml水保證膠面的平整。
[0044] 配制濃縮膠膠：以5ml12%濃縮膠為例依次加入雙蒸水3ml;30%丙烯酰胺 700y1 ;1. 5MTris-HClbuffer(pH8. 8) 1. 25ml;10%APS25y1;TEMED20y1。灌膠之后 立即插入梳子。
[0045] 待濃縮膠凝固好后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳， 電泳條件為230V電泳2~3小時(shí)（具體時(shí)間根據(jù)目標(biāo)片段大?。?，電泳結(jié)束后將膠置于EB 溶液中染色15分鐘，用蒸餾水洗去殘留的EB，于DNA凝膠成像系統(tǒng)中成像并統(tǒng)計(jì)帶型。
[0046] 5)根據(jù)步驟4)中的凝膠成像結(jié)果檢測(cè)出B1突變位點(diǎn)，如附圖2所示，鑒定出箭 頭所指的239bp條帶的個(gè)體包含有B1突變位點(diǎn)。純合的B1突變個(gè)體為239bp的單一條帶 (箭頭所指示的條帶），包含有B1突變位點(diǎn)的雜合個(gè)體具有雙條帶（239bp和261bp)。
[0047] 雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動(dòng)與修飾，因此，本發(fā)明的保 護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因BI型突變的引物，其特征在于，核苷酸序 列如 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2 所示。2. -種利用權(quán)利要求1所述引物快速檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因Bl型突變的方 法，其特征在于，以待測(cè)樣品的DNA為模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示的核苷酸 序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在對(duì)所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后利用電泳鑒定酶切產(chǎn)物。3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 提取待測(cè)樣品的DNA，備用； 2) 以步驟1)所得DNA為模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列為引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 3) 利用內(nèi)切酶對(duì)步驟2)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理，獲得酶切產(chǎn)物； 4) 利用電泳鑒定步驟3)所得酶切產(chǎn)物。4. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟2)所述PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性 4min，94°C變性40s，52°C退火30s，72°C延伸15s，共40個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。5. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)所述酶切處理，是利用ApaI內(nèi)切酶，在 37 °C下酶切過夜。6. 權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述酶切，在10 y 1酶切體系中ApaI內(nèi)切酶的用 量為0? 2 y 1。7. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟4)所述利用電泳進(jìn)行鑒定，含有239bp條帶 的樣品的大豆脂肪酸脫氫酶合成基因發(fā)生Bl突變。8. 權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述利用電泳進(jìn)行鑒定，只含有239bp條帶的樣 品為大豆脂肪酸脫氫酶合成基因Bl突變純合體，含有239bp和261bp條帶的樣品為大豆脂 肪酸脫氫酶合成基因Bl突變的雜合體。9. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 提取待測(cè)樣品的DNA，備用； 2) 以步驟1)所得DNA為模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列為 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，52°C退火30s，72°C延伸 15s，共40個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 3) 利用ApaI內(nèi)切酶對(duì)步驟2)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在37°C下酶切過夜，獲得酶切產(chǎn)物； 4) 利用電泳鑒定步驟3)所得酶切產(chǎn)物，含有239bp條帶的樣品的大豆脂肪酸脫氫酶合 成基因發(fā)生Bl突變。10. 權(quán)利要求2-9所述任一方法，其特征在于，用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氫酶合成 基因Bl型突變體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物及應(yīng)用，屬于植物分子標(biāo)記開發(fā)和作物分子輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種利用該引物快速檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變位點(diǎn)的方法，該方法是以待測(cè)樣品的DNA為模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在對(duì)所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后利用電泳鑒定酶切產(chǎn)物。本發(fā)明所涉及的引物和酶切鑒定反應(yīng)能夠快速并且準(zhǔn)確地檢測(cè)控制大豆高油酸含量的B1型突變位點(diǎn)，本發(fā)明可以大大縮短高油酸大豆材料的篩選周期，為高油酸大豆品種的培育提供了分子標(biāo)記資源。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN104962632
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510386751
【發(fā)明人】任航, 南海洋, 張倩
【申請(qǐng)人】黑龍江富航農(nóng)業(yè)科技有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年6月30日