用于檢測(cè)藥物性耳聾易感基因突變位點(diǎn)的試劑盒及引物對(duì)組的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種采用熒光PCR對(duì)藥物性耳聾易感基因突 變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒和專用引物對(duì)組。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基糖甙類抗生素（鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、西索米星、妥布霉素等）通過(guò)直 接與細(xì)菌核糖體中30S亞單位的16SrRNA結(jié)合，導(dǎo)致蛋白翻譯錯(cuò)誤或者蛋白合成提前終止 而產(chǎn)生抗菌效果。并因其高效廣譜的抗菌作用而被臨床上廣泛用于革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌感 染的治療，但該類藥物具有嚴(yán)重的耳毒性副作用，使用時(shí)可造成聽(tīng)力不可逆的損傷，甚至是 "一針致聾"。
[0003] 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，這種易感性通常表現(xiàn)為母系遺傳，并與線粒體DNA12SrRNA基因高度 保守的解碼區(qū)的A1555G和C1494T同質(zhì)性突變相關(guān)。在人類的12SrRNA上，1494C和1555A 兩位點(diǎn)堿基位置相對(duì)，彼此間并不配對(duì)。而當(dāng)1494位點(diǎn)的C突變?yōu)門或者1555位點(diǎn)的A突 變?yōu)镚，則兩位點(diǎn)之間會(huì)形成堿基配對(duì)，使得12SrRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)多出一個(gè)配對(duì)堿基，從形 態(tài)上更類似于細(xì)菌的16SrRNA。這類由突變而成的G-C或者A-U的堿基配對(duì)在12SrRNA 上形成了一個(gè)氨基糖甙類抗生素的結(jié)合位點(diǎn)，促使該類藥物更容易結(jié)合到12SrRNA上，導(dǎo) 致藥物在內(nèi)耳淋巴液中蓄積，對(duì)人的第8對(duì)神經(jīng)-聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)有毒副作用，損害內(nèi)耳毛細(xì)胞， 破壞了感知聲音最重要又最脆弱的部位-耳蝸，最終導(dǎo)致不可逆的聽(tīng)力損傷。因此對(duì)這兩 個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于預(yù)防氨基糖甙類抗生素中毒性耳聾有著重要的臨床意義。
[0004] 目前對(duì)上述藥物性耳聾相關(guān)的兩個(gè)位點(diǎn)突變的檢測(cè)技術(shù)主要有直接測(cè)序法、基因 芯片法、酶切法、熒光探針?lè)?，然而上述檢測(cè)方法存在檢測(cè)過(guò)程繁瑣，周期過(guò)長(zhǎng)，成本較高， 判讀復(fù)雜或者易引起交叉污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性以及靈敏度低、僅對(duì)單一位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)等缺 點(diǎn)。
[0005] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格低廉且易于判讀的試劑盒和檢 測(cè)方法，在PCR體系中即可完成兩個(gè)位點(diǎn)突變基因型的檢測(cè)，無(wú)需開(kāi)管操作，減少了PCR產(chǎn) 物污染的可能性，便于臨床檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種新的、無(wú)需探針、成本低廉、能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)線粒體上 兩個(gè)藥物性耳聾易感基因突變位點(diǎn)的產(chǎn)品。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供了一種用于檢測(cè)藥物性耳聾易感基因 突變位點(diǎn)的的引物對(duì)組，所述引物對(duì)組包括：
[0008] 1494位點(diǎn)特異性上游引物A，所述引物A具有序列表中的SEQIDNO: 1所示的核 苷酸序列；
[0009] 1555位點(diǎn)特異性上游引物B，所述引物B具有序列表中的SEQIDN0:2所示的核 苷酸序列；
[0010] 通用下游引物C，所述引物C具有序列表中的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述引物對(duì)組還包括由引物D和引物E組成的內(nèi)標(biāo)引物對(duì)，所述引物D具 有序列表中的SEQIDN0:4所示的核苷酸序列，所述引物E具有序列表中的SEQIDNO:5 所示的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明另一方面提供了一種用于檢測(cè)藥物性耳聾易感基因突變位點(diǎn)的的試劑盒， 所述試劑盒包括本發(fā)明上述引物對(duì)組。
[0013] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述試劑盒還包括PCR緩沖液和熒光染料。
[0014] 其中，在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明試劑盒中PCR緩沖液可含有Mg2+。
[0015] 在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明所述熒光染料包括SYBRGreenI染料，SYBR GreenII染料，SYBRSafe染料，SYBRGold染料，DAPI染料，SYTO染料，Hoechst染料， EvaGreen染料，Cy3/5染料，溴化乙錠染料等。
[0016] 本發(fā)明針對(duì)每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物對(duì)，突變位點(diǎn)引物的3'端末端堿基與突 變型堿基匹配，與野生型堿基錯(cuò)配，并通過(guò)人為引入突變堿基，以增加反應(yīng)的特異性。此外， 本發(fā)明還設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)標(biāo)引物，每對(duì)引物的PCR產(chǎn)物之間的Tm值相差2°C以上，經(jīng)熒光PCR擴(kuò) 增后，通過(guò)熔解曲線中特定熔解峰的有無(wú)來(lái)判斷核酸上是否存在相應(yīng)的突變型。
[0017] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還可包括陰性對(duì)照。
[0018] 在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，所述陰性對(duì)照為水。
[0019] 本發(fā)明所述試劑盒還可包括陰性質(zhì)控品和/或陽(yáng)性質(zhì)控品，所述陰性質(zhì)控品為 帶有野生型人線粒體DNA片段的質(zhì)粒載體，所述陽(yáng)性質(zhì)控品包括帶有C1494T突變和/或 A1555G突變的人線粒體DNA片段的質(zhì)粒載體。
[0020] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還可包括提取樣本基因組DNA的試劑；所述試劑按W:V 比包含 5 ~10%Chelex100〇
[0021] 其中，本發(fā)明所述的Chelex-100是一種由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成的化學(xué)螯 合樹(shù)脂，含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子。
[0022] 本發(fā)明還一方面提供了一種用于檢測(cè)藥物性耳聾易感基因突變位點(diǎn)的PCR試劑， 所述PCR試劑由本發(fā)明所述的引物對(duì)組和PCR緩沖液組成。
[0023] 在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，所述引物對(duì)組中各引物在PCR試劑中的濃度為： 引物A、引物B或引物C的終濃度為0. 27-0. 36yM;和/或，引物D或引物E的終濃度為 0. 07-0. 13yM。
[0024] 在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，所述PCR試劑還可包括Taq酶、dNTP、熒光染料等。本 發(fā)明PCR試劑中Taq酶、dNTP、熒光染料的濃度的確定對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可以根據(jù)所 掌握的普通技術(shù)知識(shí)確認(rèn)，本發(fā)明對(duì)此不作限定。
[0025] 此外，本發(fā)明還提供一種本發(fā)明所述引物對(duì)組、試劑盒或PCR試劑在制備用于檢 測(cè)藥物性耳聾易感基因突變位點(diǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明還一方面提供了一種檢測(cè)藥物性耳聾易感基因突變位點(diǎn)的方法，包括如下 步驟：
[0027] (1)針對(duì)待檢測(cè)藥物性耳聾易感基因兩個(gè)或兩個(gè)以上的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變型引物 對(duì)組，使PCR擴(kuò)增得到的兩個(gè)或兩個(gè)以上的產(chǎn)物的Tm值相差2°C以上，所述突變型引物對(duì) 組的3'末端堿基與待檢測(cè)突變位點(diǎn)的突變型堿基匹配，與待檢測(cè)突變位點(diǎn)的野生型堿基錯(cuò) 配；
[0028] (2)加入待測(cè)樣本和步驟（1)獲得的引物對(duì)組進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)PCR產(chǎn)物 的目的基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行熔解曲線分析，通過(guò)有無(wú)特定的熔解峰來(lái)判斷是否存在基因突 變。
[0029] 具體的，本發(fā)明實(shí)施方式中兩個(gè)或兩個(gè)以上的突變位點(diǎn)為人線粒體12SrRNA基因 中C1494T位點(diǎn)和A1555G位點(diǎn)。
[0030] 優(yōu)選的，本發(fā)明涉及的突變型引物對(duì)組包括：
[0031] 1494位點(diǎn)特異性上游引物A，所述引物A具有序列表中的SEQIDNO: 1所示的核 苷酸序列；
[0032] 1555位點(diǎn)特異性上游引物B，所述引物B具有序列表中的SEQIDN0:2所示的核 苷酸序列；
[0033] 通用下游引物C，所述引物C具有序列表中的SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。
[0034] 優(yōu)選的，所述引物對(duì)組還包括由引物D和引物E組成的內(nèi)標(biāo)引物對(duì)，所述引物D具 有序列表中的SEQIDN0:4所示的核苷酸序列，所述引物E具有序列表中的SEQIDN0:5 所示的核苷酸序列。
[0035] 其中，本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：37°Cl_10min，90~95°C15min;然后 95°〇10~208,50~60°〇10~208,72°〇208,30~40個(gè)循環(huán)。
[0036] 優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：37°C5min，95°C15min;然后95°C15s， 54°〇2〇8,72°〇2〇8,40個(gè)循環(huán)。
[0037] 所述熔解曲線分析的條件為：95°C30s，72°C30s，95°C10s。
[0038] 本發(fā)明有益效果：
[0039] 與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：
[0040] 1.本發(fā)明采用特異性引物擴(kuò)增，針對(duì)檢測(cè)的突變型核酸設(shè)計(jì)一種新的引物對(duì)組， 能夠?qū)崿F(xiàn)特異性擴(kuò)增，當(dāng)有突變型核酸存在時(shí)引物得到延伸產(chǎn)生特定的PCR產(chǎn)物，采用熔 解曲線分析產(chǎn)生的熔解峰，通過(guò)特定熔解峰的有無(wú)來(lái)判斷核酸上是否存在相應(yīng)的突變型， 特異性高。
[0041] 2.本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測(cè)引物與熒光染料價(jià)格低廉，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只需單管 單通道就可完成C1494T和A1555G兩個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，儀器要求低、操作簡(jiǎn)單。
[0042] 3.本發(fā)明技術(shù)方案不需進(jìn)行PCR產(chǎn)物的后續(xù)分析，既節(jié)約檢測(cè)成本，又縮短了檢 測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還降低了PCR產(chǎn)物污染引起的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1熒光PCR熔解曲線檢測(cè)線粒體C1494T突變陽(yáng)性樣本的熔解曲線；
[0044] 圖2熒光PCR熔解曲線檢測(cè)線粒體A1555G突變陽(yáng)性樣本的熔解曲線；
[0045] 圖3熒光PCR熔解曲線檢測(cè)線粒體野生型樣本的熔解曲線；
[0046] 圖4未包含基因組模板的熒光PCR熔解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合如下具 體實(shí)施例（但非限制）并配合附圖進(jìn)行說(shuō)明，所述實(shí)施例闡述本發(fā)明幾個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案， 本發(fā)明的其它實(shí)施例在不背離本發(fā)明的核心的前提下為本領(lǐng)域技術(shù)人員所預(yù)見(jiàn)。
[0048] 實(shí)施例1人線粒體基團(tuán)組12S rRNA基因兩突變位點(diǎn)的檢測(cè)
[0049] 1、引物設(shè)計(jì)
[0050] 根據(jù)位點(diǎn)特異性引物設(shè)計(jì)原理，將突變位點(diǎn)設(shè)為引物的3'端，并在3'端附近引入 突變位點(diǎn)突變以提高特異性，采用primer5. 0軟件分別針對(duì)C1494T和A1555G突變位點(diǎn)設(shè) 計(jì)引物。引物的設(shè)計(jì)需保證在一定的擴(kuò)增系統(tǒng)中僅能擴(kuò)增突變模板，而對(duì)正常模板不擴(kuò)增； 并且確保C1494T、A1555G突變模板的PCR產(chǎn)物的Tm值能夠在熔解曲線分析時(shí)分離（例如 Tm差別在2°C以上）；同時(shí)避