一套金銀花種質(zhì)鑒定引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物品種鑒定領(lǐng)域，涉及一套金銀花種質(zhì)鑒定引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR)或者微衛(wèi)星序列（Microsatelite， MS)是指基于真核生物基因組DNA中存在簡單重復(fù)序列且重復(fù)序列的數(shù)目變化很大而產(chǎn)生 的，重復(fù)序列的側(cè)翼為十分保守的單拷貝序列，因此SSR具有很強(qiáng)的多態(tài)性。SSR標(biāo)記相比 于其他分子標(biāo)記的優(yōu)勢在于具有共顯性標(biāo)記（鑒別雜合子、純合子）且重復(fù)性好的特點(diǎn)。劣 勢在于其引物設(shè)計(jì)必須依賴于簡單重復(fù)序列。SSR分子標(biāo)記目前已應(yīng)用于種質(zhì)資源親緣關(guān) 系、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性等研究。
[0003] 目前，SSR標(biāo)記已在藥用植物育種、指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、品種鑒定及種子純度方面 得到了廣泛的應(yīng)用。Szewc-McFadden等利用SSR序列篩選甘藍(lán)型油菜基因組文庫，獲得的 17對(duì)SSR引物皆能在蕓薹（AA)、甘藍(lán)（CC)及甘藍(lán)型油菜（AACC)材料中擴(kuò)增出產(chǎn)物，其中 13對(duì)SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性。Marion等利用該技術(shù)從含有A、B、D 3個(gè)染色體組 的六倍體小麥基因組中開發(fā)出230對(duì)SSR引物，其中大多數(shù)引物都是基因組特異性的，小麥 主要有 AG-SSR、CA-SSR、TA-SSR、TC-SSR、GT-SSR。Kresovieh 等通過構(gòu)建油菜含 15000 份 克隆的小片段基因組文庫，獲得了豐富的油菜SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其中GA重復(fù)單位的數(shù)量是CA 和GATA的4-5倍。Uzunova等在篩選白菜基因組文庫SSR序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)每100kb就有1個(gè) GA/TC重復(fù)序列，而CA/TG的豐度只是GA/TC的1/4。因此，SSR標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性，可 有效的分析栽培金銀花種質(zhì)資源的遺傳多樣性。
[0004] DNA指紋圖譜（DNA finger print)是以DNA標(biāo)記為基礎(chǔ)的，能將品種之間彼此區(qū) 分開的電泳圖譜，構(gòu)建的指紋圖譜在不同種質(zhì)間具有特異性，能夠快速的、準(zhǔn)確的鑒別品種 或品系，為良種選育和品種純度鑒定提供便利。目前，SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建在遺傳多樣 性分析、比較基因組研究等方面有廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì)的成套引物對(duì) 組。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì)的成套引物對(duì)組，具體由如下7 個(gè)引物對(duì)組成：由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)1 ;由序 列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)2 ;由序列表中序列5和序 列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)3 ;由序列表中序列7和序列8所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對(duì)4 ;由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA分子組成的 引物對(duì)5 ;由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)6 ;由序列 表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)7。
[0007] 其中，所述引物對(duì)組中的各引物對(duì)分別單獨(dú)包裝。組成各引物對(duì)的兩條單鏈DNA 分子既可以分別單獨(dú)包裝，也可以以摩爾比為1:1的比例混合包裝（4°C以下保存）。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì)的成套PCR試 劑。
[0009] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì)的成套PCR試劑，具體由如下7 種PCR試劑組成：由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)1、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑1 ;由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)2、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑2 ;由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)3、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑3 ;由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)4、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑4 ;由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)5、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑5 ;由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)6、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑6 ;由所述引物對(duì)組中的引物對(duì)7、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑7。
[0010] 其中，所述成套PCR試劑中的各PCR試劑分別單獨(dú)包裝。各PCR試劑的組分既可以 分別單獨(dú)包裝，也可以是組成如下的混合液：每24 y L PCR試劑中含有19. 8 y L水，2. 5 y L 10父？0?擴(kuò)增緩沖液（含15111111〇1/1]\%(：12)，11^2.5111111〇1/1(1犯1 38，1(^111〇1/1上下游引物 各 0? 25 y L，2. 5U DNA 聚合酶 0? 2 y L。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì)的試劑盒。
[0012] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì)的試劑盒，含有所述的引物對(duì)組 或所述成套試劑。
[0013] 以上所述金銀花種質(zhì)均可選自如下53個(gè)金銀花種質(zhì)中的任一種：河北紅銀花、河 北九豐一號(hào)、河北小雞爪花、河北小線花、河北葉里齊、河北山花子、河北一線紅、河北大麻 花、河北大毛花、河北四季花、河北大站花、河北大線花、河北大雞爪花、河北金豐一號(hào)、河北 巨花一號(hào)、河南野生1、河南大毛花、河南野生大毛花、河南野生2、河南小毛花、河南線花、 江蘇亞特、江蘇大毛花、江蘇九豐一號(hào)、江蘇雞爪花、江蘇-河南引種、江蘇紅、江蘇巨花一 號(hào)、江蘇四季花、山東大毛花、山東四季花、山東雞爪花、山東紅金、山東中花一號(hào)、山東野生 3、山東亞特紅蕾、山東亞特立本、山東亞特青蕾、山東亞特良種、山東-美國引種、山東-意 大利引種、廣西-山東引種、云南亞特、湖南九豐一號(hào)、重慶-山東引種、湖北-河北引種、安 徽-山西引種、陜西金花3號(hào)、河南尖山大毛花、河南封丘大毛花、寧夏-山東引種、甘肅亞 特、北京亞特立本。
[0014] 制備所述引物對(duì)組的方法和制備所述成套PCR試劑的方法也均屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0015] 其中，制備所述引物對(duì)組的方法具體可包括將所述引物對(duì)組中的所述7個(gè)引物對(duì) 分別單獨(dú)包裝的步驟。制備所述成套PCR試劑的方法具體可包括將所述成套PCR試劑中的 所述7種PCR試劑分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0016] 所述引物對(duì)組或所述成套PCR試劑或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定金銀花種質(zhì) 中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述金銀花種質(zhì)為以上所述53個(gè)金銀花種質(zhì)中任一 種。
[0017] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否屬于所述53個(gè) 金銀花種質(zhì)中的任一種的方法。
[0018] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否屬于所述53個(gè)金銀花種質(zhì)中的 任一種的方法，具體可包括：
[0019] (1)以所述53個(gè)金銀花種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)組或所述成套 PCR試劑或所述試劑盒中的7個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，所述53個(gè)金 銀花種質(zhì)中的每個(gè)種質(zhì)均獲得對(duì)應(yīng)于所述7個(gè)引物對(duì)的7種含有特異性條帶的電泳圖譜；
[0020] 以待測金銀花的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)組或所述成套PCR試劑或所 述試劑盒中的7個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，得到對(duì)應(yīng)于所述7個(gè)引物 對(duì)的所述待測金銀花的7種電泳圖譜；
[0021] 同一引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所述53個(gè)金銀花種質(zhì)的電 泳圖譜相對(duì)應(yīng)；
[0022] (2)將所述7個(gè)引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所 述53個(gè)金銀花種質(zhì)的對(duì)應(yīng)電泳圖譜分別進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果按照如下確定所述待測 金銀花是否屬于所述53個(gè)金銀花種質(zhì)：
[0023] 若所述7個(gè)引物對(duì)中全部引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的條帶 均與所述53個(gè)金銀花種質(zhì)中的某一金銀花種質(zhì)的對(duì)應(yīng)電泳圖譜中的特異性條帶一致，則 所述待測金銀花屬于或候選屬于該金銀花種質(zhì)；
[0024] 若所述7個(gè)引物對(duì)中至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的 條帶與所述53個(gè)金銀花種質(zhì)中的某一金銀花種質(zhì)的對(duì)應(yīng)電泳圖譜中的特異性條帶不一 致，則所述待測金銀花不屬于或候選不屬于該金銀花種質(zhì)。
[0025] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否與對(duì)照金銀花 屬于同一種質(zhì)的方法。
[0026] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否與對(duì)照金銀花屬于同一種質(zhì)的 方法，具體可包括：
[0027] (1)以對(duì)照金銀花的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)組或所述成套PCR試劑或 所述試劑盒中的7個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，得到對(duì)應(yīng)于所述7個(gè)引 物對(duì)的所述對(duì)照金銀花的7種電泳圖譜；
[0028] 以待測金銀花的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)組或所述成套PCR試劑或所 述試劑盒中的7個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，得到對(duì)應(yīng)于所述7個(gè)引物 對(duì)的所述待測金銀花的7種電泳圖譜；
[0029] 同一引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所述對(duì)照金銀花的電泳圖 譜相對(duì)應(yīng)；
[0030] (2)將所述7個(gè)引物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所 述對(duì)照金銀花的對(duì)應(yīng)電泳圖譜分別進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果按照如下確定所述待測金銀花 與所述對(duì)照金銀花是否為同一種質(zhì)：
[0031] 若所述7個(gè)引物對(duì)中全部引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的條帶 均與所述對(duì)照金銀花的對(duì)應(yīng)電泳圖譜中的特異性條帶一致，則所述待測金銀花與所述對(duì)照 金銀花為或候選為同一種質(zhì)；
[0032] 若所述7個(gè)引物對(duì)中至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的 條帶與所述對(duì)照金銀花的對(duì)應(yīng)電泳圖譜中的特異性條帶不一致，則所述待測金銀花與所述 對(duì)照金銀花不為或候選不為同一種質(zhì)；
[0033] 所述對(duì)照金銀花具體可為以上所述53個(gè)金銀花種質(zhì)中任一種。
[0034] 在以上各方法中，采用所述7個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增得到的所述53個(gè)金銀花種質(zhì)的電泳圖 譜中的特異性條帶如表3所示。
[0035] 在以上各方法中，所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度具體可為46-51 °C。所述7個(gè)引 物對(duì)中每個(gè)引物對(duì)的PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度具體參見表2。
[0036] 進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件具體為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，46~ 51°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,35個(gè)循環(huán)；72°(：延伸7111111。
[0037] 進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體為：19. 8 y L ddH20,2. 5 y L 10XPCR擴(kuò)增緩 沖液，lyL 2.5mmol/L dNTPs，10ymol/L 上下游引物各 0.25yL，2.5U rTaq酶（寶生物工 程（大連）有限公司）〇? 2 y L，1 y L DNA模板。
[0038] 在前述四種方法中，所述電泳具體可為聚丙烯酰胺凝膠電泳；所述聚丙烯酰胺凝 膠電泳中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度可為8% (質(zhì)量百分含量）。在本發(fā)明中，所述聚丙 烯酰胺凝膠電泳具體為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0039] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明篩選出7對(duì)核心SSR引物，這些引物的組合，可以準(zhǔn)確的將53個(gè) 金銀花種質(zhì)區(qū)分開來，由這些引物組成的指紋圖譜，能更加真實(shí)地反映試驗(yàn)品種的真實(shí)遺 傳身份，避免因盲目引種導(dǎo)致的種質(zhì)混亂。
【附圖說明】
[0040] 圖1為引物SSR9118060和SSR9412929的部分供試金銀花種質(zhì)的擴(kuò)增帶型。其中， A為引物SSR9118060的擴(kuò)增結(jié)果；B為引物SSR9412929的擴(kuò)增結(jié)果。圖中，M為Marker(DL 500DNA Marker)，2~46為種質(zhì)編號(hào)（與表1中的編號(hào)相對(duì)應(yīng)）。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實(shí)施例中涉及的53個(gè)金銀花種質(zhì)（表1)記載于"張山山，袁媛，黃璐琦 等.栽培金銀花非腺毛性狀特征研究.中國中藥雜志，2015年第40卷第3期"和"張山 山，黃璐琦，袁媛等.栽培金銀花農(nóng)藝性狀的數(shù)量分類學(xué)研究.中國中藥雜志，2014年第 39卷第8期"中。公眾可以從申請(qǐng)人處獲得用于重復(fù)本發(fā)明相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
[0044] 金銀花種質(zhì)材料"河南牛店大毛花"記載于"張山山，袁媛，黃璐琦等.栽培金銀 花非腺毛性狀特征研究.中國中藥雜志，2015年第40卷第3期"中。公眾可以從申請(qǐng)人處 獲得用于重復(fù)本發(fā)明相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
[0045] 表1金銀花53份種質(zhì)材料
[0046]
[0047]
[0048]
[0049] 實(shí)施例1、用于鑒定金銀花種質(zhì)的SSR引物的篩選
[0050] 本發(fā)明對(duì)金銀花品種大毛花和雞爪花的花蕾材料進(jìn)行了基因組測序，去除冗余并 經(jīng)過拼接，分別獲得4792546和3177510條contig序列，拼接長度分別為417594598bp和 248899172bp。利用生物信息學(xué)方法篩選SSR標(biāo)記。通過ssr. pi程序（http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索已獲得的大毛花和雞爪花基因組序列，識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)為：二、 三、四、五、六核苷酸重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)分別為10、9、8、7、6、5、4、3次。然后通過131 &^~篩 選大毛花和雞爪花的基因組序列，共獲得13083對(duì)同源序列對(duì)，其中具有差異的SSR為1697 對(duì)，從中篩選出分布平均的22對(duì)引物用于PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳，SSR引物信息 見表2。
[0051] 表2 22對(duì)SSR引物信息
[0052]
[0053]
[0054]
[0055] 注：表2中的擴(kuò)增產(chǎn)物是指引物設(shè)計(jì)時(shí)上下游引物所擴(kuò)增的序列片段，來源于固 定的一條具有合適SSR的contig序列，是所有忍冬都能擴(kuò)增出來的那段序列，也是最主要 的擴(kuò)增數(shù)量最多的序列，而不同的金銀花種質(zhì)在這段序列上存在重復(fù)基序或者重復(fù)次數(shù)的 變異，因而可以擴(kuò)增出不同片段長度的條帶，這也是SSR多態(tài)性的主要來源。
[0056] 用所選取的22對(duì)SSR引物（表2)在53個(gè)金銀花栽培種質(zhì)（表1)上進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，均可得到有效的PCR產(chǎn)物，從中篩選出多態(tài)性較強(qiáng)、擴(kuò)增帶型穩(wěn)定、重復(fù)性較好的7對(duì)核 心 SSR 引物（SSR9008219, SSR9118060, SSR9122370, SSR9308616, SSR9412929, SSR9553121， SSR9562432)，占所用引物的31. 8%，共檢測到68個(gè)等位基因擴(kuò)增出來的片段，片段大小為 100~700bp之間。
[0057] 實(shí)施例2、用于鑒定金銀花種質(zhì)的SSR引物的應(yīng)用
[0058] 供試金銀花種質(zhì)材料為表1中所示的58份種質(zhì)材料。
[0059] 一、總 DNA 提取
[0060] 用改良CTAB法提取總DNA，具體操作步驟如下：將2XCTAB提取液放在65°C水浴 鍋里預(yù)熱，取適量的供試金銀花樣品（干燥的花蕾或葉片）（約0. lg)，裝入2mL離心管中， 每個(gè)管都加入一顆經(jīng)無水乙醇點(diǎn)燃灼熱滅菌的鋼珠，用混合型球磨機(jī)打磨1分鐘；將鋼珠 倒出，每管加入900 y L預(yù)熱的2 X CTAB提取液，用振蕩器將樣品搖勻，加入10 y L巰基乙醇 (通風(fēng)櫥內(nèi)加入）和少量PVP，混勾，置于65°C水浴鍋中溫浴1. 5小時(shí)，每隔20min翻勻兩 次；停止水浴，取出材料，室溫下冷卻，加入900 y L氯仿-異戊醇（體積比24:1)溶液，溫和 搖勾5~lOmin，使之成乳池液，用離心機(jī)離心10min(12000轉(zhuǎn)/分鐘）；將上清液750 yL 左右轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24:1)溶液，用力搖勻 5min，使之充分混勻，離心10min(12000轉(zhuǎn)/分鐘）；將上清液500 y L左右轉(zhuǎn)移到新的1. 5mL 離心管中，加入330 y L異丙醇（約占上清液的2/3)，混勻，-20°C冰箱里靜置30min ;4°C冷 凍離心機(jī)中離心10min(12000轉(zhuǎn)/分鐘），棄上清，用500 yL 70%乙醇洗兩次，每次離心 5min (12000轉(zhuǎn)/分鐘），再用無水乙醇洗兩次，每次離心5min (12000轉(zhuǎn)/分鐘），最后用吸 水紙吸干，放在37°C烘箱中烘20~30分鐘，使乙醇揮發(fā)徹底，加入適量滅菌蒸餾水（50~ 100 y L)，使之溶解，測量0D值并經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，放置于-20°C或4°C冰箱中保 存?zhèn)溆谩?br>[0061] 二、采用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0062] 以步驟一得到的各個(gè)供試樣本的基因組DNA為模板，分別用表2中的7對(duì)核心 SSR 引物對(duì)（SSR9008219, SSR9118060, SSR912