一種轉(zhuǎn)基因玉米品系mir162檢測的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的引物和方法，所述引物由正向引物193F和反向引物751R組成，其核苷酸序列見SEQIDNo：1和SEQIDNo：2。本發(fā)明還保護了含有該引物的試劑盒。本發(fā)明的檢測方法具有特異性好、檢測方法快速簡便、準確性高、靈敏度高的特點，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理和檢驗檢疫工作中具有實際應用價值，尤其適用于基層實驗室的推廣和應用。
【專利說明】—種轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的引物和方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體的涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的引物和方法。
【背景技術】
[0002]轉(zhuǎn)基因作物近年來發(fā)展迅猛，世界各國批準商業(yè)化種植的各類轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品越來越多。國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織(ISAAA)最新的研究報告稱，2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到1.703億公頃，較2011年增長了 6%，較1996年(170萬公頃)增長了 100倍。其中，轉(zhuǎn)基因玉米是僅次于轉(zhuǎn)基因大豆的世界第二大轉(zhuǎn)基因作物。在所有商品化的轉(zhuǎn)基因作物中，轉(zhuǎn)基因玉米品系最多，共有65個轉(zhuǎn)化事件。
[0003]但是由于轉(zhuǎn)基因技術可能產(chǎn)生新毒素和過敏原、導致抗性基因的基因漂移等原因，國際社會對轉(zhuǎn)基因食品的安全性仍有相當大的爭議。包括我國在內(nèi)的世界許多國家都出臺了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理法規(guī)，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行檢測、標識和管理。
[0004]自2009年以來，我國進口玉米大幅增長，2012年全年玉米進口 520.74萬噸，同比增長197%，主要進口來源地為美國。然而，我國許可進口的轉(zhuǎn)基因玉米品系只有13個。根據(jù)我國法律法規(guī)，必須對入境玉米進行轉(zhuǎn)基因檢測以排除未批準品系進境。
[0005]MIR162是由先正達公司開發(fā)的抗鱗翅目昆蟲的轉(zhuǎn)基因玉米，已通過了美國、加拿大、阿根廷、巴西、日本和俄羅斯等國的種植許可，但中國農(nóng)業(yè)部并未批準該轉(zhuǎn)基因玉米品系進口。為防止非法轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品在國內(nèi)種植和銷售，對這種轉(zhuǎn)基因玉米品系的檢測十分重要。
[0006]轉(zhuǎn)基因成分的檢測主要采`用TaqMan實時熒光PCR方法和普通PCR方法。TaqMan實時熒光PCR檢測方法靈敏度高，特異性好，但需要熒光PCR儀，設備和試劑成本昂貴。普通PCR方法也具有較高的靈敏度，然而成本較低、操作簡便，是目前國際上最常用的作物轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，更能滿足基層一線實驗室的普遍要求。
[0007]根據(jù)PCR的擴增目的片段，轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法又分為外源基因特異性檢測方法、結(jié)構(gòu)特異性檢測方法和品系特異性檢測方法。
[0008]目前，國外轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測標準方法是歐盟官方方法“QuantitativePCR method for detection of maize event MIR162 (Charles Delobel et al., 2011)”，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測標準方法是SN/T 1196-2012。這2個標準均采用實時熒光PCR方法，前者為品系特異性檢測方法，后者為結(jié)構(gòu)特異性檢測方法。
[0009]其他研究包括:(1)鄧婷婷等2012年發(fā)表了 “轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系的實時PCR及可視芯片檢測方法研究”(植物檢疫，2012，26(5)，14-18)，采用熒光PCR方法。(2) Jae-Hwan Kim等2009年發(fā)表了利用多重PCR檢測四個轉(zhuǎn)基因玉米品系(3272、LY038、MIR162 和 M0N88017)的方法(J.Korean Soc.Appl.Biol.Chem.2009，52(1)，105-107)。該方法經(jīng)證實在14個轉(zhuǎn)基因品系中不能特異性檢測出MIR162品系(見圖1)。
(3)路興波等申請了專利“用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物、探針及其應用”(CN201210053592)和“用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物及熒光標記探針及其應用”(CN201210052534)。這兩個專利申請公開了檢測MIR162的普通PCR方法和熒光PCR方法。但兩個專利中普通PCR引物對的擴增產(chǎn)物分別只有94bp和98bp，過小的靶序列較易導致假陽性結(jié)果發(fā)生。此外，其中的專利申請CN201210053592檢測方法中的引物序列在Genbank中的Blast結(jié)果表明，其目的片段并非玉米植物基因組和外源DNA片段的邊界序列，因此該方法不是MIR162品系特異性檢測方法。專利申請CN201210052534檢測方法的PCR擴增目的基因為Vip3Aa20，該基因是來自蘇云金芽孢桿菌的抗鱗翅類昆蟲的特異性抗蟲基因，因此該檢測方法為外源基因特異性檢測方法。雖然目前只有MIR162轉(zhuǎn)入了 Vip3Aa基因，但如果有其他植物品系也轉(zhuǎn)入了該外源基因，則用該方法也能得到陽性結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、檢測方法快速簡便、準確性高、靈敏度高，適用基層一線實驗室應用的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系特異性檢測方法。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的引物，由正向引物193F和反向引物751R組成，所述正向引物193F的堿基序列為SEQ ID No:l，所述反向引物75IR的堿基序列為SEQ ID No:2。
[0012]本發(fā)明還保護一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的試劑盒，其特征在于:含有上述引物。
[0013]本發(fā)明還保護一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測方法，其特征在于:包括使用所述引物或者所述試劑盒的步驟。
[0014]所述方法以樣品基因組DNA為模板，利用所述引物或者所述試劑盒進行PCR擴增，反應結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果判定。
[0015]所述PCR擴增中的反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入12.5μ L2XPCR 預混液，10 ymol/L 的 193F I μ L, 10 μ mol/L 的 751R I μ L, I μ L 基因組 DNA，
9.5 μ L 超純水；PCR 反應條件為:94 °C，5 min ；94 °C 30 s，62 °C 40 s，72 °C I min，共35個循環(huán)；72 V延伸7 min。
[0016]所述結(jié)果判定是當電泳出現(xiàn)559 bp的特異性PCR擴增條帶即作為檢出轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162。
[0017]本發(fā)明中檢測方法的目的片段是MIR162品系特異的玉米植物基因組和外源DNA片段的邊界序列，發(fā)明人針對該序列設計了 MIR162品系特異的寡核苷酸引物對，通過PCR技術建立了轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的品系特異性檢測方法，擴增靶序列為559bp，PCR反應結(jié)束后根據(jù)特異性擴增DNA片段的位置判定實驗樣品是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162成分。
[0018]為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是:
一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的特異性寡核苷酸引物對，本發(fā)明通過分析轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162基因序列(HI203349)設計，由正向引物193F和反向引物751R組成，所述正向引物的堿基序列SEQ ID No:1和所述反向引物的堿基序列SEQ ID No:2如下。使用本發(fā)明的引物對，能夠特異、靈敏地擴增出目的片段。
[0019]SEQ ID No:1:5’ - gagtcccgcaattatacat _3’
SEQ ID No:2:5’ - ggtttgggcaaaatctcaaac -3’。[0020]一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的PCR檢測試劑盒，含有權(quán)利要求1所述引物對的試劑盒。
[0021]一種用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的PCR檢測方法，包括如下步驟:
(1)根據(jù)上述引物的核苷酸序列信息合成引物193F和751R，將上述引物分別配制成濃度為10 Mmol/L的溶液作為試劑盒，備用；
(2)提取轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162基因組DNA溶液備用；
(3)以樣品基因組DNA為模板，利用所述的特異性寡核苷酸引物193F和751R進行PCR擴增，反應結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否出現(xiàn)559 bp的特異性PCR擴增條帶判
定結(jié)果。
[0022]所述的PCR反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入PCR反應體系為25 yL，即在 0.2 mL 的 PCR 反應管中加入 12.5yL 2XPCR 預混液，I μ L 193FC10 μ mol/L), I μ L 751R (10 μ mol/L), I yL 基因組 DNA，9.5 yL 超純水。
[0023]所述的PCR 反應條件為:94 °C, 5 min ；94 °C 30 s，62 °C 40 s，72 °C I min，共35個循環(huán)；72 V延伸7 min。
[0024]所述的判定結(jié)果是根據(jù)電泳出現(xiàn)559 bp的特異性PCR擴增條帶作為檢出轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的結(jié)論。
[0025]本申請中的檢測方法為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的品系特異性普通PCR檢測方法，特異性好、靈敏度高。目的 基因片段為559bp，電泳檢測時不易導致假陽性發(fā)生。是一種適合基層實驗室應用的檢測方法。
[0026]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162基因序列設計品系特異性寡核苷酸引物對，利用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162 ;本發(fā)明檢測方法能夠快速準確地判斷樣品是否有轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162，具有特異性好、檢測方法快速簡便、準確性高、靈敏度高的特點，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理和檢驗檢疫實際工作中具有廣闊的應用價值與市場前景，尤其適用于基層一線實驗室的推廣和應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是Jae-Hwan Kim等(2009)檢測方法檢測14種轉(zhuǎn)基因玉米品系和非轉(zhuǎn)基因玉米的試驗結(jié)果圖。
[0028]圖2是本發(fā)明PCR檢測MIR162和其他13種植物物種的試驗結(jié)果圖。
[0029]圖3是本發(fā)明PCR檢測14種轉(zhuǎn)基因玉米品系和非轉(zhuǎn)基因玉米的試驗結(jié)果圖。
[0030]圖4是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的PCR檢測方法靈敏度試驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0031]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0032]本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因玉米標準品 Bt 176、BtlU M0N810、GA21、NK603、M0N863、1507、3272、MIR604、59122、98140和轉(zhuǎn)基因大豆標準品GTS40-3-2購自IRMM (歐洲標準物質(zhì)研究所)；轉(zhuǎn)基因玉米標準品MIR162、M0N89034、M0N88017和轉(zhuǎn)基因油菜GT73購自AOCS (美國油類化學家學會);轉(zhuǎn)基因水稻BT63和科豐6號來自中國檢驗檢疫科學研究院；其他植物樣品均為非轉(zhuǎn)基因樣品，購自市場。2 X PCR預混液購自廣東東盛生物科技有限公司，其組分為 100 mM KCl,20 mM Tris_Cl、3 mM MgCl2,400 mM dNTP 混合物、0.1 U/ μ LTaq DNA 聚合酶和溴酚藍等。
[0033]實施例1:玉米樣品的檢測
1.引物設計與合成:
根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162基因序列(Genbank序列號ΗΙ203349)，設計引物，引物由正向引物193F和反向引物751R組成，其中正向引物193F的序列SEQ ID No:1和反向引物751R的序列SEQ ID No:2的具體序列如下:
SEQ ID No:1:5’ - gagtcccgcaattatacat _3’
SEQ ID No:2:5’ - ggtttgggcaaaatctcaaac -3’。
[0034]上述引物由TAKARA公司。分別配制成濃度為10 Mmol/L的溶液作為試劑盒，備用。
[0035]基因組DNA的提取:
DNA提取方法參見《分子克隆實 驗指南第三版》(薩姆布魯克D.W拉塞爾著.科學出版社2002 [美]J.黃培堂等譯)。
[0036]擴增:
3.1 PCR反應體系和反應條件
以上述提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應。
[0037]PCR反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入12.5 μ L 2XPCR預混液，I μ L 193F (10 μ mol/L), I μ L 751R (10 μ mol/L), I μ L 基因組 DNA (10 ng ~50ng)，9.5 μ L 超純水。
[0038]將樣品管放入PTC-200 PCR儀(美國Bio-Rad公司)，設置反應條件為:94 °C，5min ；94 °C 30 S，62 °C 40 S，72 °C I min，共 35 個循環(huán)；72 °C 延伸 7 min。
[0039]擴增產(chǎn)物的電泳檢測
用IXTAE電泳緩沖液制備f 1.5 %的瓊脂糖凝膠。取10 μ L PCR擴增產(chǎn)物在凝膠板上的孔中點樣。用100 bp的DNA Marker (TAKARA公司)做分子量標記。設置電壓(3V/cnT5V/cm),電泳時間為50 min~60 min。用凝膠成像儀(Alpha Imager EP)拍照記錄。
[0040]采用上述正向引物193F和反向引物75IR特異性PCR擴增的轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162特異性基因片段長度為559bp，根據(jù)樣品是否產(chǎn)生559bp的PCR擴增條帶判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162。
[0041]實施例2:用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的PCR方法的特異性確定
取其他植物物種的種子或果實13份、不同轉(zhuǎn)基因玉米品系標準品14份，非轉(zhuǎn)基因玉米1份，按上述方法分別提取基因組DNA，并進行PCR擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果。結(jié)果顯示只有轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162特異性產(chǎn)生559 bp的擴增條帶，檢測結(jié)果如圖2和圖3所示。
[0042]所用引物和方法見實施例1。
[0043]圖2是應用本發(fā)明的引物和檢測方法檢測MIR162和其他13種植物物種的實驗結(jié)果圖；泳道I 一 14依次為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162 (10%)、非轉(zhuǎn)基因大豆、大米、土豆、豌豆、綠豆、小麥、胡蘿卜種子、番茄、木瓜、轉(zhuǎn)基因水稻BT63、科豐6號、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和轉(zhuǎn)基因油菜GT73。從圖中可以看出，只有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162產(chǎn)生559bp條帶(泳道1)，其他樣品均未見擴增條帶。
[0044]圖3是應用本發(fā)明的引物和檢測方法檢測14種轉(zhuǎn)基因玉米品系和非轉(zhuǎn)基因玉米的實驗結(jié)果圖；其中，泳道I 一 15依次為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米59122(10%)、轉(zhuǎn)基因玉米Btll (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米NK603 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米Bt_176 (5%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 (5%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034 (100%)、轉(zhuǎn)基因玉米1507 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米98140 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米3272(100%)、轉(zhuǎn)基因玉米GA21 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863 (10%)和非轉(zhuǎn)基因玉米。從結(jié)果可以看出，只有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162產(chǎn)生559bp條帶(泳道I )，其他樣品均未見擴增條帶。
[0045]從圖2和3的結(jié)果可以看出，其他植物物種、其他轉(zhuǎn)基因玉米品系和非轉(zhuǎn)基因玉米均未產(chǎn)生559 bp的擴增條帶。表明建立的PCR方法具有良好的特異性，可用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測。
[0046]實施例3:用于轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測的PCR方法的靈敏度確定
將轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162標準品與非轉(zhuǎn)基因玉米種子混合，配制成轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162 相對百分含量(w/w)為 10 %、5 %、1%、0.5 %、0.I %、0.05%、0.01 % 的玉米種子樣品，按上述實施例方法分別提取基因組DNA，再進行PCR擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果。檢測結(jié)果如圖4所示。圖4是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的PCR檢測方法靈敏度試驗結(jié)果圖。泳道I 一 8依次為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162含量分別為10 %、5 %、1 %、0.5 %、0.I %、0.05%、
0.01%的玉米種子樣品和非轉(zhuǎn)基因玉米種子的PCR檢測結(jié)果。
[0047]所用引物和方法見實施例1。`
[0048]實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為0.1 %的樣品擴增條帶清晰，轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為0.05 %的樣品也有微弱條帶；說明建立的PCR方法至少可從轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為0.1 %的樣品中成功檢測出轉(zhuǎn)基因玉米MIR162，具有較高的靈敏度，符合檢測的要求。
[0049]實施例4 Jae-Hwan Kim等(2009)檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米
按照文獻(Jae-Hwan Kim等,2009)公開的引物和檢測方法檢測14種轉(zhuǎn)基因玉米品系和非轉(zhuǎn)基因玉米，試驗結(jié)果見圖1:泳道I 一 15依次為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162(10%)、轉(zhuǎn)基因玉米59122 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米Btll (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米NK603 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米Bt_176(5%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 (5%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034 (100%)、轉(zhuǎn)基因玉米1507 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米98140 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米3272 (100%)、轉(zhuǎn)基因玉米GA21 (10%)、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863 (10%)和非轉(zhuǎn)基因玉米。從圖中可以看出，除泳道15的非轉(zhuǎn)基因玉米未見擴增條帶外，其他轉(zhuǎn)基因玉米均產(chǎn)生140bp擴增條帶。說明文獻(Jae-Hwan Kim等，2009)公開的方法不適合檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162。
[0050]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的引物，由正向引物193F和反向引物751R組成，所述正向引物193F的堿基序列為SEQ ID No:1，所述反向引物751R的堿基序列為SEQID No:2。
2.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述引物。
3.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測方法，其特征在于，包括使用權(quán)利要求1所述引物或者權(quán)利要求2所述試劑盒的步驟。
4.權(quán)利要求3所述檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測方法，其特征在于，以樣品基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述引物或者權(quán)利要求2所述試劑盒進行PCR擴增，反應結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果判定。
5.權(quán)利要求4所述檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增中的反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入12.5μ L 2XPCR預混液，10ymol/L 的 193F I μ L, 10 ymol/L 的 751R I μ L, I yL 基因組DNA，9.5 μ L超純水；PCR反應條件為:94 °C, 5 min ；94 V 30 S，62 V 40 S，72 V I min，共 35 個循環(huán)；72 V 延伸 7 min。
6.權(quán)利要求3所述檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測方法，其特征在于，所述結(jié)果判定是當電泳出現(xiàn)559 bp的特異`性PCR擴增條帶即作為檢出轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484554SQ201310475423
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】陳雙雅, 王嘉鶴, 許秋貝, 張永祥 申請人:陳雙雅