轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量pcr精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法。本發(fā)明采用設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列、下游引物序列、熒光探針序列、98140品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明主要建立了一種高擴(kuò)增效率、高準(zhǔn)確度的Taqman定量PCR檢測(cè)技術(shù)，適用于國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)、進(jìn)出境口岸轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢驗(yàn)、企業(yè)內(nèi)部進(jìn)口原材料含轉(zhuǎn)基因98140構(gòu)建結(jié)構(gòu)的生物成分檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的定量的分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002]國(guó)際上很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國(guó)尚無(wú)具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值。為了打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時(shí)彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系，更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法已成為必要。
[0003]目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米98140的檢測(cè)技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法和標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)關(guān)于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米98140及產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特異性某特定位點(diǎn)(基因序列)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米98140及產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針:
上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’ ；
下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’ ；
熒光探針序列，zm-P:5’-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’。實(shí)現(xiàn)對(duì) pin II 終止子與zm-hra gene相連位置核酸片段的檢測(cè)。
[0006]轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針:
上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’ ；
下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’ ；
熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’。實(shí)現(xiàn)對(duì)Gate4621gene與pin II終止子相接處核酸片段的檢測(cè)。
[0007]上述轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，包括以下步驟:當(dāng)檢測(cè)pin II終止子與zm-hra gene相連位置核酸片段時(shí),具體步驟如下:
(al)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’
下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’
熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’ ；
(a2)制備98140品系的DNA稀釋液；
(a3)配制PCR反應(yīng)體系；
(a4)定量PCR檢測(cè)。
[0008]當(dāng)檢測(cè)Gate4621gene與pin II終止子相接處核酸片段時(shí),具體步驟如下:
(bl)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’
下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’
熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’ ；
(b2)制備98140品系的DNA稀釋液；
(b3)配制PCR反應(yīng)體系；
(b4)定量PCR檢測(cè)。
[0009]進(jìn)一步地,步驟(al)和(bl)中合成的引物及突光探針的濃度均為10Mmol/l,步驟(a2)和(b2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
[0010]再進(jìn)一步地，步驟(a3)和(b3)中所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將DNA稀釋液加入到2θμL反應(yīng)體系中，所述2θμL的反應(yīng)體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物 ιμL
下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液3.ΟμL
50 ROX0.4μ1
水4.?μL。
[0011]另外，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，57°C退火60s, 45個(gè)循環(huán)。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
(1)本發(fā)明打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘；
(2)本發(fā)明彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系；
(3)本發(fā)明提供的檢測(cè)技術(shù)可更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)；
(4)本發(fā)明擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明-實(shí)施例1對(duì)非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0014]圖2為本發(fā)明-實(shí)施例2對(duì)非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。
[0016]實(shí)施例1
轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，在檢測(cè)pin II終止子與zm-hragene相連位置核酸片段時(shí)，步驟如下:
(al)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’
下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’
熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’。
[0017]本實(shí)施例引物及熒光探針的合成濃度均為10Mmol/l。
[0018]以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米98140及產(chǎn)品的構(gòu)建結(jié)構(gòu)中pinll終止子與zm-hra gene相連位點(diǎn)的特定位點(diǎn)設(shè)計(jì)；通過(guò)該設(shè)計(jì)就可以精準(zhǔn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中98140的結(jié)構(gòu)特異片段。
[0019](2)制備98140品系的DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米98140中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。
[0020](3)配制PCR反應(yīng)體系；即將制備好的DNA稀釋液加入20μ1反應(yīng)體系中即可。
[0021]以上20μ1反應(yīng)體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL
下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液3.ΟμL
50 ROX0.4μ1
水4.?μL。
[0022](4)定量 PCR 檢測(cè)。
[0023]根據(jù)上述PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，57°C退火60s，45個(gè)循環(huán)。本實(shí)施例中采用的是ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀器。
[0024]采用本發(fā)明的方法對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個(gè)其他玉米轉(zhuǎn)化體，5個(gè)水稻轉(zhuǎn)化體，5個(gè)大豆轉(zhuǎn)化體，3個(gè)棉花轉(zhuǎn)化體，3個(gè)油菜轉(zhuǎn)化體和I個(gè)甜菜轉(zhuǎn)化體進(jìn)行特異性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從圖1可看出本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)以上非轉(zhuǎn)基因作物及除98140玉米外的其他轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體均沒(méi)有非特異擴(kuò)增，另外圖1中Δ Rn代表熒光原始信號(hào)減去背景信號(hào)的值。
[0025]同時(shí)，采用本發(fā)明的方法對(duì)0.5%的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特性片段進(jìn)行定量檢測(cè)，連續(xù)重復(fù)做15個(gè)平行樣品的檢測(cè)，數(shù)據(jù)見表1。
[0026]表1

【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針，其特征在于， 用于檢測(cè)pin II終止子與zm-hra gene相連位置的引物和探針如下: 上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’ ； 下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’ ； 熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’ ； 用于檢測(cè)Gate4621gene與pin II終止子相接處的引物和探針如下: 上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’ ； 下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’ ； 熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’。
2.轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:檢測(cè)pin II終止子與zm-hra gene相連位置: (al)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’ 下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’ 熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’ ； (a2)制備98140品系的DNA稀釋液； (a3)配制PCR反應(yīng)體系； (a4)定量PCR檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)Gate4621gene與pin II終止子相接處: (bl)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’ 下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’ 熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’ ； (b2)制備98140品系的DNA稀釋液； (b3)配制PCR反應(yīng)體系； (b4)定量PCR檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(al)和(bl)中合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(a2)和(b2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a3)和(b3)中所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將DNA稀釋液加入到20μ1反應(yīng)體系中，所述2θμL的反應(yīng)體系包括以下組分: Taqman Master mix (2X )10M-1上游引物1μL下游引物1μL 熒光探針0.5μ1 DNA稀釋液3.0μL .50 ROX0.4μ1水4.?μL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，57°C退火60s, 4 5個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104131106SQ201410394511
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】張富麗, 宋君, 尹全, 常麗娟, 劉文娟, 王東, 雷紹榮 申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心