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轉(zhuǎn)基因玉米ga21品系的lamp檢測(cè)引物及方法

文檔序號(hào):415563閱讀:776來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:轉(zhuǎn)基因玉米ga21品系的lamp檢測(cè)引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物及方法。
背景技術(shù)
隨著全球轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的日益增多,以及越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因作物特異品系獲得商品化生產(chǎn),檢測(cè)特異性品系已成為國(guó)際上轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。目前,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因特異品系的方法主要有普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方 法。普通PCR方法,具有耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣,靈敏度不夠,容易產(chǎn)交叉污染,質(zhì)控復(fù)雜,假陽(yáng)性、假陰性比例偏高等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR方法則具有成本昂貴、技術(shù)要求高、需要大型的儀器設(shè)備等缺點(diǎn),均已經(jīng)不能滿足食品中轉(zhuǎn)基因成分的日常監(jiān)管和食品生產(chǎn)行業(yè)內(nèi)部質(zhì)控的需求。因此,目前急需建立能夠普遍適用于檢驗(yàn)檢疫一線的基層實(shí)驗(yàn)室的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因品系檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法,其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4飛條特異引物,利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件¢3 °C左右)保溫30 — 60分鐘,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物(焦磷酸鎂),形成乳白色沉淀,通過(guò)觀察濁度,或加入顯色液觀察顏色變化來(lái)判定結(jié)果。LAMP技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、特異、快速等優(yōu)點(diǎn),不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程,在靈敏度、特異性能媲美甚至優(yōu)于普通PCR技術(shù),不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè),檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。LAMP技術(shù)在食源性致病微生物的快速檢測(cè)中已得到廣泛應(yīng)用,但在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上的應(yīng)用研究很少。目前,國(guó)內(nèi)采用LAMP技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的研究尚處于起步階段,且主要應(yīng)用于啟動(dòng)子、外源基因的檢測(cè),極少應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因特異品系的檢測(cè)。目前未見(jiàn)轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)方法的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種普遍適用于基層實(shí)驗(yàn)室的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物及方法。本發(fā)明首先提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物,所述LAMP檢測(cè)引物如下
外引物 F3 :5,-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3’
外引物 B3 :5,-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3,
內(nèi)引物 FIP :5’-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3’內(nèi)引物BIP 5' -GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3’環(huán)引物 LF :5’-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3’
環(huán)引物 LB :5’ -CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3’。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)方法,利用所述的LAMP檢測(cè)引物,以fei DNA聚合酶大片段啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,通過(guò)觀察濁度,或加入顯色液觀察顏色變化來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件為63°C溫育lh,80°C保溫5min ;反應(yīng)體系為10XThermoPol 緩沖液 2. 5μ ,10 Mmol/L 外引物 F3 O. 5μ ,10 Mmol/L 外引物 Β3 O. 5μ ,40Mmol/L 環(huán)引物 LF 0. 5μ Α0 Mmol/L 環(huán)引物 LB O. 5μ Α0 Mmol/L 內(nèi)引物 FIP I. 0μ ,40Mmol/L 內(nèi)引物 BIP I. OM-L, 10 mmol/L dNTPs 3. 5M-L, 5 mol/L 甜菜喊 4. OM-L, 150 mmol/L硫酸鎂 I. 0μ ,8 υ/μ Bst DNA 聚合酶大片段 I. Ομ , 100 ng/μ DNA 模板 2. Ομ , ddH20 7μ 。本發(fā)明建立的LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)①快速、高效擴(kuò)增約I h即可完成,且產(chǎn)率高;②簡(jiǎn)便在核酸大量合成時(shí),從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀,通過(guò)觀察濁度或加入顯色液觀察顏色變化就可判定檢測(cè)結(jié)果,不需要特殊的、昂貴的儀器設(shè)備,操作非常簡(jiǎn)便;③高特異性采用六個(gè)區(qū)段、四條或六條引物,擴(kuò)增特異性高,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物及方法的報(bào)道,本發(fā)明首次 設(shè)計(jì)、篩選到了轉(zhuǎn)基因GA21品系的LAMP檢測(cè)引物,并建立了 LAMP檢測(cè)方法。


圖I為GA21品系外源基因的序列,加框部分是mepsps基因,陰影部分是linker基因,加下劃線部分是r-act基因。圖2為GA21品系在植物基因與外源基因組合連接處的序列。圖3為3套引物反應(yīng)溫度的測(cè)試結(jié)果,A. setl引物;B. set2引物;C. set3引物;Γ6.反應(yīng)溫度分別為60. 0°C、61. 2°C、61. 9°C >63. 3°C >64. 1°C、64. 8°C。圖4為3套引物在反應(yīng)溫度為63°C的特異性測(cè)定結(jié)果,A. setl引物;B. set2引物;C. set3引物;I. ddH20 ;2.非轉(zhuǎn)基因玉米;3.非轉(zhuǎn)基因小麥;4.非轉(zhuǎn)基因大豆;5.5% GA21標(biāo)準(zhǔn)品。圖5為L(zhǎng)AMP方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果,Al 7分別為ddH20、非轉(zhuǎn)基因大米、非轉(zhuǎn)基因小麥、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因番茄、非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯;Bfe分別為 轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034品系、轉(zhuǎn)基因玉米Tcl507品系、轉(zhuǎn)基因玉米Mir604品系、轉(zhuǎn)基因玉米Mon810品系、轉(zhuǎn)基因玉米Btll品系、5%GA21標(biāo)準(zhǔn)品。圖6為L(zhǎng)AMP法靈敏度測(cè)定實(shí)時(shí)監(jiān)控結(jié)果,I. 0. 1% GA21 ;2. 1% GA21 ;3. 5%GA21 ;4. 0. 5% GA21 ;5. 0. 05% GA21 ;6. 0. 01% GA21 ;7.非轉(zhuǎn)基因玉米。圖7為L(zhǎng)AMP法靈敏度測(cè)定結(jié)果,I.非轉(zhuǎn)基因玉米;2. 0. 01% GA21 ;3. 0. 05%GA21 ;4. 0. 1% GA21 ;5. 0. 5% GA21 ;6. 1% GA21 ;7. 5% GA21。圖8為送檢樣品中GA21品系的LAMP檢測(cè)結(jié)果,ΑΓ Ο分別為ddH20、非轉(zhuǎn)基因玉米、真空玉米棒、冷凍甜玉米、奶香味韓味玉米(進(jìn)口)、辣味韓味玉米、玉米淀粉、黃大豆、油豆腐、脫脂大豆10分別為香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白稞干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉;Cf 10分別為薯片、番茄醬、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米酒糟柏、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米I、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米2、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米3、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米4、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米5、0. 1% GA21、5% GA21。
具體實(shí)施方式
I試驗(yàn)材料
5%、1%、0. 1%GA21標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。非轉(zhuǎn)基因玉米、真空玉米棒、冷凍甜玉米、奶香味韓味玉米(進(jìn)口)、辣味韓味玉米、玉米淀粉、黃大豆、油豆腐、脫脂大豆、香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白稞干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉、薯片、番茄醬、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米酒糟柏、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米I、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米2、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米3、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米4、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米5由本實(shí)驗(yàn)室收集。采用CTAB法提取試驗(yàn)材料的DNA,_20°C保存?zhèn)溆谩?主要試劑、耗材
dNTPs溶液(每種核苷酸濃度10 mmol/L)購(gòu)自廈門泰京公司'Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μυ及l(fā)OXThermolPol緩沖液為美國(guó)NEB公司產(chǎn)品;甜菜堿(5mol/L)、硫酸鎂溶液(lmol/L)為Sigma公司產(chǎn)品;SYBR Green I熒光染料(10000X )為廈門百維信生物科技有 限公司產(chǎn)品;LAMP專用薄壁管、穩(wěn)定液購(gòu)自廣州華峰生物科技有限公司。3主要儀器與設(shè)備
冷凍混合研磨儀、渦旋儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、生物安全柜、梯度PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司的7500)。4 LAMP引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)GA21品系特異性序列(圖1),設(shè)計(jì)了 2套引物。根據(jù)GA21品系在植物基因與外源基因組合連接處(圖2)設(shè)計(jì)了 I套引物。所有引物(表I)由廣州迪澳生物科技有限公司設(shè)計(jì),委托上海生工公司合成。用ddH20將外引物稀釋至lOMmol/L,環(huán)引物、內(nèi)引物稀釋至40Mfflol/L。按外引物環(huán)引物內(nèi)引物體積比為I :1 2的比例混勻內(nèi)、外、環(huán)引物(配制第3套引物混合液時(shí),用ddH20代替另一條環(huán)引物),作為引物混合液,分別標(biāo)記為Setl、Set2和set30
表I LAMP引物
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物,其特征在于所述LAMP檢測(cè)引物如下外引物 F3 :5,-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3’外引物 B3 :5,-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3,內(nèi)引物 FIP :5’-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3’內(nèi)引物BIP :5,-GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3’環(huán)引物 LF :5’-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3’ 環(huán)引物 LB :5’ -CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3’。
2.—種轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)方法,其特征在于利用權(quán)利要求I所述的 LAMP檢測(cè)引物,以ifei DNA聚合酶大片段啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,通過(guò)觀察濁度,或加入顯色液觀察顏色變化來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)方法,其特征在于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件為63°C溫育lh,80°C保溫5min ;反應(yīng)體系為10 X ThermoPol緩沖液 2. 5μ ,10 Mmol/L 外引物 F3 O. 5μ ,10 Mmol/L 外引物 Β3 O. 5μ Α0 Mmol/L 環(huán)引物 LF.0.5μ Α0 Mmol/L 環(huán)引物 LB O. 5μ Α0 Mmol/L 內(nèi)引物 FIP I. 0μ ,40 Mmol/L 內(nèi)引物 BIP.1.Ομ , 10 mmol/L dNTPs 3. 5μ ,5 mol/L 甜菜堿 4· Ομ ,100 mmol/L 硫酸鎂 L Ομ ,8 υ/μ Bst DNA 聚合酶大片段 I. Ομ , 100 ng/μ DNA 模板 2· Ομ , ddH20 7μ 。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物及方法。所述LAMP檢測(cè)引物如SEQ ID NO1-6,利用所述的LAMP檢測(cè)引物,以BstDNA聚合酶大片段啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,通過(guò)觀察濁度,或加入顯色液觀察顏色變化來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提供的一種普遍適用于基層實(shí)驗(yàn)室的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系的LAMP檢測(cè)引物及方法,快速、高效、簡(jiǎn)便,擴(kuò)增特異性高,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102965445SQ20121053089
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者邵碧英, 陳文炳, 曾瑩, 繆婷玉, 彭娟 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
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