一種藥物性耳聾的檢測引物組、其構(gòu)成的反應體系及應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領域，具體設及一種藥物性耳聾的檢測引物組、其構(gòu)成 的反應體系及應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物中毒性耳聾(簡稱藥物性耳聾），是指患者因使用或接觸某些耳毒性藥物而造 成的耳聾，運些藥物(包括氨基糖巧類抗菌素、非氨基糖巧類抗菌素、水楊酸鹽等)均對人類 聽覺神經(jīng)具有毒副作用，可破壞耳蝸，一般造成雙側(cè)、永久性耳聾，多不可逆。
[0003] 根據(jù)中國2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，聽力殘疾患者人數(shù)約2004 萬人，占全國8296萬殘疾人總數(shù)的24.16%，其中藥物致聾的人數(shù)多達800萬。其中，氨基糖 巧類抗生素的不恰當使用是造成藥物性耳聾發(fā)生的最常見因素，運類抗生素包括常見的鏈 霉素、慶大霉素等。另外有研究結(jié)果表明，人類線粒體基因突變的發(fā)生與藥物性耳聾密切相 關。在中國人群中，線粒體基因的A1555G、C1494T運兩個位點突變的發(fā)生頻率高達4%。 A1555G突變和C1494T突變會在12S rRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U- A1555堿基對。運些改變使得12S rRNA在二級結(jié)構(gòu)上與細菌的leSrRNA的相應區(qū)域的二級結(jié) 構(gòu)更加相似，導致糖巧類藥物與之發(fā)生"不應該"的結(jié)合，引起細胞膜上的化+，K+-ATP累功 能障礙，造成毛細胞損傷，導致藥物性聽力受損甚至耳聾。
[0004] 目前用于檢測運兩個位點突變的方法有很多種，如Sanger測序法，運種方法可W 很直觀得得到目的位點的突變情況，然而操作復雜，需要兩次PCR和大量的純化工作，并且 費用高昂，耗時較長，不適合大范圍推廣使用;等位基因特異性PCR法，運種方法通過設計突 變型和野生型特異的PCR引物，通過電泳比較野生型和突變型PCR產(chǎn)物的大小不同W判定檢 測樣本的突變狀況，優(yōu)點是費用低廉，然而大規(guī)模檢測時樣本量較大，同時進行大量的電泳 操作就會變得非常繁瑣，而且容易造成交叉污染;巧光定量PCR法靈敏度高，不需要人工檢 巧。，因此目前應用比較廣泛，然而它依然不能擺脫對昂貴的設備的依賴，同時，用于檢測的 探針也是一筆不小的支出。因此，非常有必要開發(fā)一種既能快速準確又能價格低廉的檢測 方法。
[0005] 環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)技術(shù)是日本科學家于2000年提出的一種等溫擴增技術(shù)， 其主要特點是針對祀基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需15-90分鐘即可產(chǎn)生109-l〇w數(shù)量級的產(chǎn)物。LAMP 反應對模板DNA的質(zhì)量要求遠沒有PCR反應嚴格，因此DM的粗提物就可W直接作為檢測模 板，比起WPCR為基礎的檢測方法具有更大的優(yōu)勢，可免去DNA提取的成本和繁瑣操作的步 驟，尤其是在大量樣本的檢測中，運種優(yōu)勢就更加明顯。同PCR反應一樣，LAMP的反應也需要 引物3端與模板的嚴格配對，具有敏感性高、特異性好、操作簡便、成本低廉且結(jié)果易于判定 的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了克服上述方法的缺陷，提供一種藥物性耳聾的檢測引物組、其構(gòu)成的 反應體系及應用，所述檢測體系具有敏感性高、特異性好和操作簡便等優(yōu)點。
[0007] 為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供一種藥物性耳聾的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物 組如下：
[0009] 正向外側(cè)引物F3C:沈Q ID N0:1:GGCAAGAAATGGGCTACA;
[0010] 反向外側(cè)引物B3C:沈Q ID N0:2:CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTC;
[00川正向內(nèi)側(cè)引物FIPC:SEQ id N ο : 3 : TGCTAAATCCACCTTCGACCTCTACCCCAGAAAACTACGAT；
[0012] 反向內(nèi)側(cè)引物 BIPC:SEQ id N ο : 4 ： TAAGAGTAGAGTGCTTAGTTGAACACTTTGAAGTATACTTGAGGATG；
[0013] 正向外側(cè)引物F3T:沈Q ID N0:5:AAACTTAAGGGTCGAAGGTGG;
[0014] 反向外側(cè)引物B3T:沈Q ID N0:6:CTGGTTCGTCCAAGTGCA;
[001引正向內(nèi)偵J引物FIPT:SEQ ID N Ο : 7 ： AGGGACGGGCGGTGTGTACGAGCAGTAAACTAAGAGTAGAGTGC;
[0016] 反向內(nèi)偵J 引 物 BIPT:SEQ id N ο : 8 ： AGGACATTTAACTAAAACCCCTACGCATCCAGTACACTTACCATGTTACG；
[0017] 正向外側(cè)引物F3A:沈Q ID N0:9:CGAAGGTGGATTTAGCAGTA;
[001 引反向外側(cè)引物B3A:沈Q ID N0:10:CCTAAGTGTAAGTTGGGTGC;
[0019] 正向內(nèi)偵J 引 物 FIPA:SEQ ID N Ο : 1 1 ： TGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGGGAGTAGAGTGCTTAGTTGAAC;
[0020] 反向內(nèi)偵J 引 物 BIPA:SEQ ID N 0 : 1 2 ： ACCAGTCGTAACATGGTAAGTGTACTTGTGTTAAGCTACACTCTGG；
[0021] 正向外側(cè)引物F3G:沈Q ID N0:13:TCAAGTATACTTCAAAGGACATT;
[0022] 反向外側(cè)引物B3G:沈Q ID N0:14:AGTAAGGTGGAGTGGGTT;
[002；3]正向內(nèi)偵J 引 物 FIPG:SEQ ID N 0 : 1 5 ： CCAAGTGCACTTTCCAGTACACCTACGCATTTATATAGAGGATGC；
[0024] 反向內(nèi)偵J 引 物 BIPG:SEQ ID N 0 : 1 6 ： GAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAGCTAGGTTTAGCTCAGAGCo
[0025] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO: 1-4所示的序列是用于檢測1494位點的C等位基因。
[0026] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO:5-8所示的序列是用于檢測1494位點的T等位基因。
[0027] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO:9-12所示的序列是用于檢測1555位點的A等位基因。
[0028] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO:13-16所示的序列是用于檢測1555位點的G等位基因。
[0029] 本發(fā)明根據(jù)LAMP的特點，針對線粒體12sRNA上1494和1555位點的不同突變堿基設 計特異性引物，既保留了 LAMP反應的優(yōu)勢，又具有非常高的特異性。外側(cè)引物記為正向外側(cè) 引物F3和反向外側(cè)引物B3,內(nèi)側(cè)引物記為正向內(nèi)側(cè)引物FIP和反向內(nèi)側(cè)引物BIP，其中FIP包 含了F1C和F2，BIP包含了B1C和B2，上述引物均由在線軟件PrimerExplorer V4設計。本發(fā)明 在普通LAMP的基礎上，針對1555和1494位點設計等位基因特異引物，特異性引物位于Flc或 Blc的5'端，在Flc或Blc的5'端第Ξ位再引進一個突變，進一步降低非特異性擴增的可能 性。
[0030] 第二方面，本發(fā)明提供一種檢測藥物性耳聾的反應體系，所述反應體系包括第一 方面所述的引物組，反應緩沖液，dNTPs，徑基糞酪藍，甜菜堿，Bst DNA聚合酶，待檢樣品基 因組DNA和去離子水。
[0031] 優(yōu)選地，所述反應緩沖液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0032] 優(yōu)選地，所述Tris-HCl 的濃度為 10-30mM，例如可 W是 10mM、llmM、12mM、13mM、 151111、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，優(yōu)選為15-251111，進一步優(yōu)選為 20mM〇
[0033] 優(yōu)選地，所述 KC1 的濃度為 10-60mM，例如可 W 是 1 OmM、1 ImM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、2 日mM、30mM、3 日mM、40mM、4 日1111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、5日1111或6〇1111，優(yōu)選為 50-55mM，進一步優(yōu)選為50mM。
[0034] 優(yōu)選地，所述(畑4) 2 S〇4 的濃度為 5-13mM，例如可 w 是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、1 OmM、 "mM、12mM或13mM，優(yōu)選為8-12mM，進一步優(yōu)選為1 OmM。
[0035] 優(yōu)選地，所述 MgS〇4 的濃度為 2-8mM，例如可 W 是 2111]\1、31111、41111、5111]\1、6111]\1、71111或81111， 優(yōu)選為2-6mM，進一步優(yōu)選為4mM。
[0036] 優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分數(shù)為0.1-1 %，例如可W是0 .!%、0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%、0.6%、0.7%