一種燕窩制品實(shí)時(shí)熒光pcr鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及燕窩的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]燕窩是中國(guó)自明代以來(lái)開(kāi)始被食用的傳統(tǒng)名貴食品之一，是指雨燕目雨燕科金絲燕屬的幾種金絲燕攝食的昆蟲(chóng)、海藻、銀魚(yú)等物經(jīng)消化后，分泌出來(lái)的唾液與絨羽等混合筑成的巢窩。燕巢呈半月形，，直徑6?7厘米，基底厚，廓壁薄，重約5?15克。燕巢外圍整齊，內(nèi)部粗糙，有如絲瓜網(wǎng)絡(luò)。主要產(chǎn)自印尼、馬來(lái)西亞、泰國(guó)和越南等東南亞國(guó)家。
[0003]中醫(yī)認(rèn)為燕窩:〃養(yǎng)陰潤(rùn)燥、益氣補(bǔ)中、治虛損、咳痰喘、咯血、久痢”，適宜于體質(zhì)虛弱，營(yíng)養(yǎng)不良，久痢久瘧，痰多咳嗽，老年慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺氣腫、肺結(jié)核、咯血吐血和胃痛病人食用。研究發(fā)現(xiàn)燕窩含有豐富的活性蛋白質(zhì)，以及鈣、磷、鐵等微量元素。其含有的表皮生長(zhǎng)因子和水溶性物質(zhì)能夠刺激細(xì)胞分裂、再生和組織重建，促進(jìn)人體康復(fù)。同時(shí)能增強(qiáng)人體免疫力，抵抗病毒和感冒。由于燕窩具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，市場(chǎng)對(duì)燕窩制品的需求量日益增加。一些商販以銀耳、豬皮、瓊脂、果膠等原料偽造燕窩制品，危害了消費(fèi)者的利益。
[0004]目前燕窩真?zhèn)舞b定方法主要是經(jīng)驗(yàn)鑒別法、顯微鑒別法和儀器鑒別法(包括凝膠電泳法、紅外光譜法、氣相色譜法等)。這些方法中有的準(zhǔn)確性不高，靈敏度低；有的提取純化程序冗長(zhǎng)，重現(xiàn)性不好；有的鑒別成本高昂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種燕窩制品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法，解決以上技術(shù)問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題可以采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0007]一種燕窩制品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008]步驟一，待檢燕窩制品DNA的提??；
[0009]步驟二，金絲燕成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；
[0010]首先，在PCR反應(yīng)管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各
0.5-1 μ L，Taqman 探針 0.5-1 μ L，50ng/μ L 待檢燕窩制品 DNA1-2 μ L，補(bǔ)充雙蒸水至 25 μ L，混勻；
[0011]其次，將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:
[0012]a.94-95 °C 5min，I 個(gè)循環(huán)，預(yù)變性；
[0013]b.94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，40 個(gè)循環(huán)，PCR 擴(kuò)增；
[0014]步驟三，使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀分析軟件分析擴(kuò)增結(jié)果。
[0015]本發(fā)明的主要原理是燕窩主要來(lái)自金絲燕的唾液，里面含有金絲燕的DNA，通過(guò)檢測(cè)燕窩中的金絲燕12S rRNA基因來(lái)鑒別燕窩的真假。如果燕窩制品中能檢出金絲燕特異性12S rRNA基因，則待檢燕窩制品為真燕窩；如果未檢出金絲燕特異性12S rRNA基因，說(shuō)明待檢燕窩制品為假冒燕窩。
[0016]本發(fā)明特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，簡(jiǎn)單快速，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需要3?4小時(shí)。
[0017]步驟一中，待檢燕窩制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。
[0018]在步驟二與步驟三之間，進(jìn)行DNA濃度的測(cè)定，將DNA濃度調(diào)整為50ng/ μ L，首先使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取待檢燕窩制品DNA的吸光值A(chǔ)260和A280，其A260/A280比值在1.7?2.0之間，按以下公式計(jì)算DNA濃度:
[0019]C = A*N*50 ;
[0020]其中C— DNA濃度，單位為ng/ μ L ;
[0021]A — 260nm處的吸光值；
[0022]N — DNA稀釋倍數(shù)；
[0023]將DNA濃度稀釋到50ng/ μ L0
[0024]步驟二中，通過(guò)對(duì)金絲燕特異性12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。
[0025]通過(guò)特異性擴(kuò)增金絲燕的12S rRNA基因序列對(duì)燕窩進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增的DNA片段大小為144bp。
[0026]步驟二中，擴(kuò)增金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan探針的序列如下:
[0027]上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’
[0028]下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’ ；
[0029]TaqMan 探針序列:
[0030]5，-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3，，
[0031]其中5’端標(biāo)記FAM報(bào)告熒光集團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。
[0032]在應(yīng)用中，上游引物、下游引物、TaqMan探針的濃度為lOymol/L。
[0033]本發(fā)明根據(jù)金絲燕的12S rRNA基因特異性序列設(shè)計(jì)一對(duì)組引物(上游引物SffT-F:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’ 和下游引物 SWT_R:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3 ’)和一條 Taqman 探針(探針 SWT-P 序列為:5 ’ -FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’)。進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)，模板DNA經(jīng)加熱至94?95°C—定時(shí)間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性結(jié)合。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告熒光集團(tuán)，3端有淬滅熒光集團(tuán)，當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告集團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅集團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中，遇到與模板結(jié)合的探針時(shí)，其3’ 一5’外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告集團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨著PCR循環(huán)的增加，目的片段成指數(shù)增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也同步增強(qiáng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱直接反應(yīng)模板數(shù)量。
[0034]本發(fā)明對(duì)待檢燕窩制品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每個(gè)待檢燕窩制品同時(shí)做兩個(gè)平行。
[0035]步驟二中，對(duì)金絲燕成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)立三個(gè)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照(金絲燕基因組DNA)、陰性對(duì)照(非金絲燕基因組DNA)、空白對(duì)照(不含DNA模板，可以水代替)；
[0036]并且，同時(shí)擴(kuò)增真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因。
[0037]步驟二中，同時(shí)檢測(cè)真核生物18S rRNA基因以判斷是否從待檢燕窩制品中提取適宜進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的DNA或提取的DNA中是否存在PCR反應(yīng)抑制因子；
[0038]步驟二中，分別配置真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探針。
[0039]本發(fā)明涉及的真核生物18S rRNA基因引物和探針序列參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T25165-2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》:
[0040](I)上游引物 18S-F:5’ -CCTGAGAAACGGCTACCAC-3，；
[0041](2)下游引物 18S-R:5’ -CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’ ；
[0042](3) TaqMan 探針 18S-P:5’ -TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’，其 5’ 端標(biāo)記 FAM 報(bào)告熒光集團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。
[0043]步驟三，分析擴(kuò)增結(jié)果時(shí)，應(yīng)設(shè)置的各種對(duì)照實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)全部符合以下情況，否則應(yīng)重做實(shí)驗(yàn):
[0044]a.陽(yáng)性對(duì)照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值小于30 ;
[0045]b.陰性對(duì)照的真核生物18S rRNA基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值小于30，金絲燕12SrRNA基因未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值彡40 ；
[0046]c.空白對(duì)照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值Ct值彡40。
[0047]此外，待檢燕窩制品的真核生物18S rRNA基因?qū)崟r(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果Ct值應(yīng)小于30，否則重新提取DNA。
[0048]只有在滿足以上兩種情況下，判斷待檢燕窩制品是否含有燕窩成品，判斷方法如下:
[0049]a.如待檢燕窩制品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且Ct值小于或等于35，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果都成立(即陽(yáng)性待檢燕窩制品出現(xiàn)典型陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，陰性待檢燕窩制品盒空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增)，則可判定該待檢燕窩制品檢測(cè)出燕窩成分；