本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是關(guān)于一種針對(duì)外周血CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)。

背景技術(shù)：

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T－Cell Immunotherapy，CAR－T)是近年來(lái)迅速發(fā)展的腫瘤過(guò)繼免疫治療方法。CAR-T治療已成為治療惡性腫瘤的一種新策略，特別是在血液腫瘤方面的貢獻(xiàn)，主要涉及急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。CAR-T療法主要分4步：一是從腫瘤患者上分離免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞；二是利用基因工程技術(shù)給T細(xì)胞加入一個(gè)能識(shí)別腫瘤細(xì)胞、同時(shí)激活T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的嵌合體，成為CAR-T細(xì)胞；三是在體外選擇、激活和大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞(一般一個(gè)病人需要幾十億乃至上百億個(gè)CAR-T細(xì)胞)；四是給腫瘤患者輸注CAR-T細(xì)胞，發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

CAR-T細(xì)胞發(fā)揮殺傷腫瘤效應(yīng)取決于患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞的數(shù)量和存活時(shí)間。而CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和存活受到諸多因素的影響，如最初輸注的CAR-T細(xì)胞數(shù)量、輸注前是否進(jìn)行“淋巴細(xì)胞清除”以及病人的輸注后的個(gè)體治療等。相關(guān)研究報(bào)道新一代的CAR-T細(xì)胞能夠在患者體內(nèi)擴(kuò)增超過(guò)1000倍，并能夠到達(dá)骨髓，在體內(nèi)保持較高的CAR功能達(dá)6個(gè)月。但外周血中CAR-T細(xì)胞數(shù)，在患者個(gè)體間的差異大，CAR-T細(xì)胞數(shù)量成為臨床預(yù)后預(yù)測(cè)，療效評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要的參數(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新的外周血CAR-T細(xì)胞檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供一種檢測(cè)外周血CAR-T細(xì)胞的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括序列分別如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的上游引物、下游引物及探針。

一種TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒在外周血CAR-T細(xì)胞檢測(cè)上的應(yīng)用，所述試劑盒包括序列分別如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的上游引物、下游引物及探針。最低的有效檢測(cè)濃度為1.2×10¹copies/μL。

本發(fā)明的有益效果是：該TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒具有取材量小、操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，能夠用于外周血CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1是GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2是CAR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3是不同樣本的擴(kuò)增曲線圖，其中，A-G分別為濃度1.2×10⁷-1.2×10¹copies/μL樣本，即濃度分別為1.2×10⁷copies/μL、1.2×10⁶copies/μL、1.2×10⁵copies/μL、1.2×10⁴copies/μL、1.2×10³copies/μL、1.2×10²copies/μL和1.2×10¹copies/μL；H：1.2copies/μL樣本；I：ddH2O樣本；

圖4是反映兩例患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的變化情況圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

1材料和方法

1.1樣本、試劑及儀器

樣本：選取2015年1月至2016年6月深圳市第二人民醫(yī)院血液內(nèi)科收治的進(jìn)行CAR-T治療的淋巴系統(tǒng)腫瘤患者，另隨機(jī)選擇來(lái)深圳市第二人民醫(yī)院健康體檢者的血液樣本為對(duì)照組。

試劑：血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，PCR Master試劑(TaKaRa公司)，TaqMan Gene Expression Master Mix試劑(ABI公司)，TaqMan Gene Expression Assay(Hs02758991_g1)試劑(ABI公司)。

儀器：ABI7500熒光定量PCR檢測(cè)儀(ABI公司)，Proflex PCR儀(ABI公司)，NanoDrop2000c微量核酸蛋白分析儀(THERMO公司)。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，采用Primer5軟件完成引物設(shè)計(jì)，引物委托華大基因生物公司合成。采用Oligo7軟件完成CAR基因探針設(shè)計(jì)，委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。其中GAPDH基因探針及引物直接購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

表1 PCR引物序列

1.2.2常規(guī)PCR產(chǎn)物回收及鑒定

參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作用血液基因組DNA提取試劑盒提取CAR-T細(xì)胞的基因組DNA。

普通PCR方法擴(kuò)增CAR基因(上下游引物序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示)和內(nèi)參GAPDH基因(上下游引物序列分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:4所示)，分別制備標(biāo)準(zhǔn)品。引物序列如表1所示。反應(yīng)體系：EmeraLdAmp pcr Master Mix(2×Premix)25μL，模板DNA 5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，加入ddH₂O至總反應(yīng)體積50μL。進(jìn)行以下擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30S，52℃退火60S(GAPDH基因?yàn)?6℃退火60S)，72℃延伸1min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃反應(yīng)5min，4℃保存。

所獲得擴(kuò)增產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化回收試劑盒回收，送英濰捷基公司測(cè)序驗(yàn)證，得到CAR基因和GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)品用ddH₂O以10倍濃度梯度稀釋作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，以ddH₂O作為陰性對(duì)照，進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

CAR基因檢測(cè)：引物和探針序列如表1(序列如SEQ ID NO：5～7所示)，總反應(yīng)體系20μL：TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)10μL、探針(10μmol/L)2μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 4μL，ddH₂O 2μL。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?0℃2min；第二步，95℃10min；第三步，變性95℃15s，退火59℃30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

GAPDH基因檢測(cè)：引物和探針混于TaqMan Gene Expression Assay中?？偡磻?yīng)體系20μL：TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)10μl、TaqMan Gene Expression Assay(20×)2μL，DNA模板4μL，ddH₂O 4μL。反應(yīng)程序?yàn)?第一步，50℃2min；第二步，95℃10min；第三步，變性95℃15s，退火60℃60s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.4制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)公式DNA拷貝數(shù)Y molecules/μL＝[(DNA ng/μL)×10^-9/基因堿基長(zhǎng)度bp×660]×6.022×10²³，算出兩基因拷貝數(shù)為1.2×10¹⁰copies/μL(CAR基因)和1.5×10¹⁰copies/μL(GAPDH基因)。以DNA拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。為提高擴(kuò)增效率與靈敏度，CAR基因產(chǎn)物選擇稀釋倍數(shù)10⁵～10⁹；GAPDH基因產(chǎn)物則取10²～10⁶濃度的產(chǎn)物(如表2所示)。

表2 兩基因濃度表

1.2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用最優(yōu)體系，以DNA濃度稀釋10⁵、10⁷、10⁹倍的樣本進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)5次。測(cè)得的CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以變異系數(shù)情況確定該反應(yīng)的重復(fù)性。

1.2.6靈敏度實(shí)驗(yàn)

選擇各個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和ddH₂O作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以CT值與水為模板有顯著差別且出現(xiàn)較好S型增長(zhǎng)曲線的最低濃度，為最低檢測(cè)靈敏度。

1.2.7臨床樣本檢測(cè)

用真空管(含EDTA抗凝劑)采集4名健康人以及2名CAR-T治療的腫瘤患者各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的外周血2mL。血液樣本均由專業(yè)人員采集，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。每次200μL外周血提取基因組DNA，操作按血液基因組DNA提取試劑盒的步驟。利用已優(yōu)化的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系分別檢測(cè)樣本中的CAR基因和GAPDH基因。

2結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

熒光定量PCR結(jié)果顯示隨著標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度被連續(xù)稀釋而等比下降，所獲取的熒光信號(hào)也近乎成比例地降低。GAPDH基因的回歸方程y＝-3.4349x+44.439，R²＝0.999，擴(kuò)增效率為95％(如圖1所示)。CAR基因的回歸方程分別為：y＝-3.3682x+38.594，R²＝0.999，擴(kuò)增效率為98％(如圖2所示)。

2.2重復(fù)性

重復(fù)性結(jié)果采用變異系數(shù)CV(％)評(píng)價(jià)，3個(gè)濃度的樣本的5次CT結(jié)果都較為接近，變異系數(shù)CV均小于4％，說(shuō)明本方法結(jié)果穩(wěn)定，有良好的重復(fù)性(表3)。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3靈敏度

結(jié)果顯示濃度為1.2copies/μL樣本和水對(duì)應(yīng)的曲線沒(méi)有顯著差別，兩者CT值之差小于1。而1.2×10⁷-1.2×10¹copies/μL的樣本擴(kuò)增曲線的CT值在36以內(nèi)，且具有良好的線性關(guān)系(如圖3所示)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)最低有效檢測(cè)濃度為1.2×10¹copies/μL，設(shè)定檢測(cè)結(jié)果CT值大于36的樣本為陰性樣本。

2.4樣本檢測(cè)結(jié)果及拷貝數(shù)分析

2名患者共13例樣本，其中12例樣本都檢測(cè)到CAR基因，只有一例沒(méi)有檢測(cè)到，懷疑跟輸注時(shí)間相隔6個(gè)多月體內(nèi)CAR-T細(xì)胞已衰耗有關(guān)；而4名健康人都未檢測(cè)到CAR(如表4所示)。GAPDH基因是表達(dá)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的管家基因，幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，且一般保持恒定。理論上CAR基因和GAPDH基因一樣在細(xì)胞內(nèi)都以單拷貝形式存在，1個(gè)拷貝數(shù)代表1個(gè)細(xì)胞。CAR拷貝數(shù)代表CAR-T細(xì)胞數(shù)，GAPDH拷貝數(shù)代表外周血中的有核細(xì)胞總數(shù)。則CAR拷貝數(shù)與GAPDH拷貝數(shù)的比值，代表外周血中CAR-T細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例。

表4 樣本檢測(cè)結(jié)果表

此外，以輸注時(shí)間與標(biāo)本時(shí)間的相隔天數(shù)為橫坐標(biāo)，以CAR-T細(xì)胞占外周血有核細(xì)胞比例(1/10⁸)為縱坐標(biāo)，作趨勢(shì)圖(如圖4所示)。反映兩例患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的變化情況。

3結(jié)論

目前常用的檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的方法包括免疫印跡法(Western blot)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)法等，但都存在不同程度的不足。比如Western blot無(wú)法測(cè)定具體的細(xì)胞量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)法是一種相對(duì)定量的方法，得到的結(jié)果是相對(duì)于總細(xì)胞的相對(duì)比例；而PCR檢測(cè)法則相對(duì)敏感度低且難以定量。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是在普通PCR的基礎(chǔ)上另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，具有高度的特異性。

本實(shí)驗(yàn)方法血液樣本的檢測(cè)靈敏度為每4μLDNA溶液12個(gè)基因組拷貝，敏感度比其它方法高10-1000倍，檢測(cè)樣本用量少，能在盡量減少對(duì)患者傷害的情況下，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量?？赏麘?yīng)用于臨床上CAR-T治療患者的治療指導(dǎo)、療效評(píng)估、病情預(yù)測(cè)等方面。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民醫(yī)院

<120> 檢測(cè)外周血CAR-T細(xì)胞的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒

<130> 16I23205

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> CAR上游引物

<400> 1

catcctccct gtctgcctct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> CAR下游引物

<400> 2

gcctccgcca tcttatcttt 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> GAPDH上游引物

<400> 3

tgcattcgcc ctcttaa 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> GAPDH下游引物

<400> 4

catcacgcca cagtttcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> CAR熒光定量上游引物

<400> 5

ggattcgcca gcctccac 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> CAR熒光定量下游引物

<400> 6

aaacttggct cttggagttg t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> CAR熒光定量探針

<400> 7

tcccagccac tccagaccct t 21