一種大量人外周血pbmc快速分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：將人外周血轉(zhuǎn)入離心管中離心；吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋；將得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。本發(fā)明對于大量人外周血PBMC分離，不僅可減少操作步驟，且節(jié)約了操作時(shí)間、試劑耗材及試劑用量，有利于PBMC的分離和細(xì)胞的活率。
【專利說明】
一種大量人外周血PBMC快速分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及外周血PBMC分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大量人外周血PBMC快速分離 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自體免疫T細(xì)胞技術(shù)，是指從患者的外周血中分離出T細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、 制劑，回輸患者體內(nèi)，誘導(dǎo)人體自身產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前T細(xì)胞的獲得主要來源于人外周血 PBMC，主要的分離方法是將人外周血直接與PBS等量混合，然后加入淋巴分離液進(jìn)行梯度分 離，最后獲得PBMC。這種方法對血量少的樣本來說尚可操作，但是對于大量的血量時(shí)（> 100ML)，分離方法繁瑣，操作時(shí)間較長，不利于PBMC的分離和細(xì)胞的活率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提出了一種大量人外周血TOMC快速分離方法，對于大量人外周血PBMC分 離，不僅可減少操作步驟，且節(jié)約了操作時(shí)間、試劑耗材及試劑用量，有利于PBMC的分離和 細(xì)胞的活率。
[0004] 本發(fā)明提出的一種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0005] S1、將人外周血轉(zhuǎn)入離心管中離心；
[0006] S2、吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋；
[0007] S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位 于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0008] S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。
[0009] 優(yōu)選地，離心速度為1200-1800rpm，離心時(shí)間為10_20min。
[0010] 優(yōu)選地，在S1中，將30-200ml人外周血轉(zhuǎn)入離心管中離心。
[0011] 優(yōu)選地，在S1中，將40ml人外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中離心。
[0012] 優(yōu)選地，在S2中，除去上層血漿后，繼續(xù)吸取灰黃層，向灰黃層中加入生理鹽水稀 釋。
[0013] 優(yōu)選地，在S2中，吸取5-8ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至體積為 25ml 〇
[0014] 優(yōu)選地，在S3中，吸取20-30ml S2得到的產(chǎn)物，加入到含有15-30ml淋巴細(xì)胞分離 液的離心管中。
[0015] 優(yōu)選地，在S3中，吸取25ml S2得到的產(chǎn)物，加入到含有20ml淋巴細(xì)胞分離液的離 心管中。
[0016] 優(yōu)選地，離心速度為1500-1800rpm，離心時(shí)間為10_30min。
[0017] 本發(fā)明中，可快速獲取大量血量TOMC中T細(xì)胞，操作簡便;通過將大量人外周血離 心后，只吸取血漿和紅細(xì)胞之間的一層灰黃層細(xì)胞，然后用生理鹽水稀釋，最后進(jìn)行密度梯 度分離，不僅可減少操作步驟，且節(jié)約了操作時(shí)間、試劑耗材及試劑用量。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 一種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0021] S1、將人外周血送入離心管中離心；
[0022] S2、吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋；
[0023] S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位 于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0024] S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] 一種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0027] S1、將30ml人外周血送入離心管中離心，離心速度為1800rpm，離心時(shí)間為lOmin;
[0028] S2、除去上層血漿后，吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋；
[0029] S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位 于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0030] S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 一種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0033] S1、將180ml人外周血送入離心管中離心，離心速度為1800rpm，離心時(shí)間為lOmin;
[0034] S2、除去上層血漿后，吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋；
[0035] S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位 于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0036] S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。
[0037] 實(shí)施例4
[0038] 一種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0039] S1、將200ml人外周血轉(zhuǎn)入離心管中離心，離心速度為1200rpm，離心時(shí)間為20min;
[0040] S2、除去上層血漿后，吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋；
[0041 ] S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位 于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0042] S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。
[0043] 實(shí)施例5
[0044] -種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0045] S1、將40ml人外周血送入50ml離心管中離心，離心速度為1500rpm，離心時(shí)間為 16min；
[0046] S2、吸取5ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至體積為25ml;
[0047] S3、將30ml S2得到的產(chǎn)物送入含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到 的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0048] S4、離心分離，離心速度為1500rpm，離心時(shí)間為30min，吸取中間白膜層，洗滌，離 心棄上清，得到PBMC。
[0049] 實(shí)施例6
[0050] -種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0051 ] S1、將40ml人外周血送入50ml離心管中離心，離心速度為1600rpm，離心時(shí)間為 14min；
[0052] S2、吸取8ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至體積為25ml，剩余灰黃 層按上述步驟稀釋處理；
[0053] S3、將20ml S2得到的產(chǎn)物送入含有30ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到 的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0054] S4、離心分離，離心速度為1800rpm，離心時(shí)間為lOmin，吸取中間白膜層，洗滌，離 心棄上清，得到PBMC。
[0055] 實(shí)施例7
[0056] -種大量人外周血PBMC快速分離方法，包括如下步驟：
[0057] S1、將40ml人外周血送入50ml離心管中離心，離心速度為1500rpm，離心時(shí)間為 15min；
[0058] S2、吸取6ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至體積為25ml，剩余灰黃 層按上述步驟稀釋處理；
[0059] S3、將25ml S2得到的產(chǎn)物送入含有20ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到 的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
[0060] S4、離心分離，離心速度為1600rpm，離心時(shí)間為20min，剩余S2得到的產(chǎn)物按上述 步驟離心處理;吸取中間白膜層至50ml離心管中，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。
[0061] 將采用實(shí)施例7的方法與普通方法對比，其中普通方法為將人外周血直接與PBS等 量混合，然后加入淋巴分離液進(jìn)行梯度分離，最后獲得PBMC。
[0062] 將兩者使用的淋巴分離液的使用量、移液管數(shù)量、離心管數(shù)量、操作時(shí)間進(jìn)行對 比，測試結(jié)果如下表1所示：
[0063] 表1本發(fā)明方法與普通方法測試結(jié)果對比表
[0064]
[0065]本發(fā)明可節(jié)約大量的淋巴分離液，用本方法只需要60ml的淋巴分離液，而傳統(tǒng)的 方法卻需要近280mL淋巴分離液;節(jié)約近2/3的耗材，如離心管、吸管等；相比傳統(tǒng)的方法節(jié) 約大量的時(shí)間。
[0066]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 將人外周血轉(zhuǎn)入離心管中離心； 52、 吸取灰黃層，向其中加入生理鹽水稀釋； 53、 將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋 巴細(xì)胞分離液上層； 54、 離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到PBMC。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，離心速度為 1200-1800rpm，離心時(shí)間為 10-20min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，在S1中，將30-200ml人外周血轉(zhuǎn)入離心管中離心。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，在S1中，將 40ml人外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中離心。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，在S2中，除去 上層血漿后，吸取灰黃層，向灰黃層中加入生理鹽水稀釋。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，在S2中，吸取 5_8ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至體積為25ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，在S3中，吸取 20-30ml S2得到的產(chǎn)物，加入到含有15-30ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，在S3中，吸取 25ml S2得到的產(chǎn)物，加入到含有20ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大量人外周血PBMC快速分離方法，其特征在于，離心速度為 1500_1800rpm，離心時(shí)間為10_30min。
【文檔編號】C12N5/078GK106085954SQ201610483118
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】錢鵬, 趙依妮, 許國貞, 劉振云
【申請人】安徽未名細(xì)胞治療有限公司