一種巨核祖細胞的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種巨核祖細胞的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨核細胞祖細胞（megakaryo巧teprogenitorcell)是一種使人們產(chǎn)生巨核細 胞的細胞，它是從骨髓祖（CFU-GEMM)而得，簡稱巨核祖細胞。巨核祖細胞存在于CD126/ Lin細胞群中，而CD34+細胞可分為兩個細胞亞群，表達比-6R和不表達比-6R，比-6R+細 胞能被刺激形成粒-巨隧細胞、淋己細胞和粒細胞，而IL-6R-細胞當被給予IL-6/SIL-6R 時可形成紅系及巨核系細胞。造血干細胞首先分化生成巨核系祖細胞，也稱巨核系集落形 成單位（colonyformingunit-megakaryo巧te,CFU-Meg)。巨核系祖細胞分化成為成熟的 巨核細胞后，其邊緣部分破裂脫落，形成血小板，每個巨核細胞能生成1000-6000個左右的 血小板；巨核細胞雖然在骨髓的造血細胞中為數(shù)最少，僅占骨髓有核細胞總數(shù)的0. 05%， 但其產(chǎn)生的血小板卻對機體的止血功能極為重要。
[0003] 如今惡性腫瘤嚴重危害人類健康的主要疾病之一，目前主要是通過手術(shù)治療并結(jié) 合放化療。當患者在接受高劑量放化療后，骨髓造血功能低下，常會出現(xiàn)血小板減少，嚴重 時會造成患者出血死亡。臨床上常采用輸注血小板，但血小板來源有限，存活期短，體外易 失活，且反復輸注血小板易導致輸注無效并增加輸血傳播疾病的危險。
[0004] 1997年，Bertolini等從外周血中分離CD34+，體外誘導擴增巨核細胞7天，用于 患者血小板恢復。結(jié)果顯示，體外誘導的巨核細胞可替代血小板輸入，或減少血小板輸入次 數(shù)。2000年，Paquette等將體外動員的外周血細胞經(jīng)體外誘導擴增巨核細胞9天后，用于改 善大劑量化療的乳腺癌病人中性粒細胞減少、血小板減少和貧血癥狀。VandenOudenrijn 等對外周血、骨髓、廝血來源的CD34+細胞體外擴增進行比較，發(fā)現(xiàn)廝血來源的CD34+具有 更強的巨核細胞擴增能力。由于廝血造血干細胞移植后血小板的恢復較外周血、骨髓慢，因 此采用體外誘導、擴增巨核祖細胞和巨核細胞，然后輸注患者體內(nèi)，進一步發(fā)育成血小板， 縮短血小板的恢復期。因此，分離巨核祖細胞將其用于惡性腫瘤的治療是目前的研究熱點。 陽0化]對于巨核祖細胞的分離，目前的方法主要有兩種，一種是通過體外分離造血干細 胞化SC)來獲得單核球細胞，再分選CD34+細胞，并對其進行直接誘導培養(yǎng)，得到巨核祖細 胞；另一種是通過體外分離造血干細胞化SC)來獲得單核球細胞，進行免疫磁珠篩選，去除 已確定分化方向的細胞，獲得Lin-細胞，再將獲得的Lin-細胞與IL-6受體的抗體解育，獲 得Lin-/CD126-細胞，經(jīng)過定向誘導分化得到巨核細胞。前者提供的方法相對簡單，但得率 低；后者得率相對較高，但提供的方法著重于得到巨核祖細胞，卻忽略了其前提條件，分離 單核球的數(shù)量直接影響到巨核祖細胞的得率，并且其方法分離過程所采用的甲基纖維素是 不能用于人體靜脈回輸?shù)?，所得的巨核祖細胞誘導所得的巨核細胞（CD41a+/CD61+細胞） 的比例低。
[0006] 因此，應當進一步開發(fā)得率高，誘導分化后得到高表達CD41a7CD6r的巨核細胞 的分離巨核祖細胞的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種巨核祖細胞的分離方法，即動 員擴增后分離CD126 /Lin細胞的方法。本發(fā)明提供的方法分離巨核祖細胞得率高，其定向 誘導分化后得到的巨核細胞高表達CD41a7CD6r，且可W用于人體靜脈回輸。 陽00引本發(fā)明提供的CD126 /Lin細胞的分離方法，包括W下步驟：
[0009] 步驟1 :分離獲得廝血中的單個核細胞，WriiG-CSF刺激培養(yǎng)；
[0010] 步驟2 :刺激培養(yǎng)獲得的細胞經(jīng)免疫磁珠分離篩選得到Lin-細胞；
[0011] 步驟3 :Lin-細胞經(jīng)免疫磁珠分離篩選得到CD126 /Lin細胞。
[0012] 在本發(fā)明的實施例中，rhG-CSF在刺激培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為50ng/mL~ lOOng/mL。
[0013] 在一些實施例中，rhG-CSF在刺激培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為10化g/mL。
[0014] 在本發(fā)明的實施例中，刺激培養(yǎng)的條件為5%C02、37°C;時間為3天~7天。
[0015] 在一些實施例中，刺激培養(yǎng)的時間為5天。
[0016]重組人粒細胞集落刺激因子（recombinanthumanGranuloc}fteColony StimulatingFactor,rhG-CSF)，可促進髓系造血祖細胞的增殖、分化和成熟，調(diào)節(jié)中性粒 細胞系的增殖與分化成熟；也可驅(qū)使中性粒細胞釋放至血流，使外周中性粒細胞數(shù)量增多。 本發(fā)明采用rhG-CSF對廝血中分離得到的單個核細胞進行刺激培養(yǎng)W增加其中巨核祖細 胞的含量。實驗表明，與未經(jīng)rhG-CSF刺激的直接用廝血分離單核球篩選得到的巨核祖細 胞相比，W濃度為50ng/ml~10化g/ml的rhG-CSF連續(xù)刺激培養(yǎng)單個核細胞3天~7天后， CD34+細胞的在培養(yǎng)所得細胞中的數(shù)量百分比提高了 10倍。從根本上提高了巨核祖細胞的 含量，從而提高分離巨核祖細胞的得率和向巨核細胞定向誘導分化后高表達CD41a7CD6r。 陽017] 在本發(fā)明的實施例中，刺激培養(yǎng)的培養(yǎng)基為StemSpanS陽Μ無血清培養(yǎng)基。
[0018] 在本發(fā)明的實施例中，刺激培養(yǎng)的單個核細胞的接種密度為1X1〇6個/mL。
[0019] 本發(fā)明采用免疫磁珠分離的方法從經(jīng)刺激培養(yǎng)的細胞中分離巨核祖細胞，首先采 用cocktail抗體混合物分離得到Lin-細胞，而后采用CD126抗體（抗白細胞介素6受體 抗體）篩選獲得CD126 /Lin細胞，即IL-6R細胞群。經(jīng)鑒定，篩選得到的IL-6R細胞群進 行體外定向誘導分化培養(yǎng)得到的巨核細胞高表達CD41a7CD6r，比例高達81 %。
[0020] 在本發(fā)明的實施例中，步驟2中免疫磁珠分離的抗體為CD2抗體、CD3抗體、CD5抗 體、CD14抗體、CD16抗體、CD19抗體、CD24抗體、CD41抗體、CD6化抗體及GlycophorinA抗 體的混合物。
[0021] 在本發(fā)明的實施例中，CD2抗體、CD3抗體、CD5抗體、CD14抗體、CD16抗 體、CD19抗體、CD24抗體、CD41抗體、CD6化抗體及GlycophorinA抗體的質(zhì)量比為 陽02引在本發(fā)明的實施例中，步驟2中免疫磁珠分離的溫度為4°C，時間為30min。
[002引具體的，步驟2中免疫磁珠分離的步驟包括：將經(jīng)刺激培養(yǎng)后的細胞W1~2mL PBS緩沖液重懸，向細胞懸液中添加免疫磁珠，然后添加CD2抗體、CD3抗體、CD5抗體、CD14 抗體、CD16抗體、CD19抗體、CD24抗體、CD41抗體、CD6化抗體及GlycophorinA抗體，4°C 解育30min，后分選得到Lin-細胞。
[0024] 在本發(fā)明的實施例中，步驟3中免疫磁珠分離的抗體為CD126抗體。
[00對在本發(fā)明的實施例中，步驟3中免疫磁珠分離的溫度為4°C，時間為30min。
[00%] 具體的，步驟3中免疫磁珠分離的步驟包括：將步驟2中分離得到的Lin-細胞與 免疫磁珠和CD126抗體混合，4°C解育30min，后分選得到Lin/CD126細胞。
[0027] 在本發(fā)明的實施例中，單個核細胞的制備方法包括：
[0028] 步驟1 :經(jīng)抗凝處理的廝血與徑乙基淀粉溶液混合，去除紅細胞，獲得上清液；
[0029] 步驟2 :上清液與淋己細胞分離液混合后，經(jīng)離屯、收集單個核細胞。
[0030] 在一些實施例中，徑乙基淀粉溶液中包括徑乙基淀粉和氯化鋼，其中徑乙基淀粉 的濃度為60g/L;氯化鋼的濃度為9g/L。
[0031] 在一些實施例中，經(jīng)抗凝處理的廝血與徑乙基淀粉溶液的體積比為（2~6) :1。
[0032] 在本發(fā)明的實施例中，廝血采集采用抗凝采血管采集。
[0033] 在本發(fā)明的實施例中，上清液與淋己細胞分離液混合的體積比為2:1。
[0034] 本發(fā)明提供了一種巨核祖細胞的分離方法，該方法將分離得到的單個核細胞W rhG-CSF刺激培養(yǎng)3~7天，從而增加細胞中巨核系細胞的含量，W免疫磁珠對經(jīng)刺激培養(yǎng) 的細胞進行篩選，獲得巨核祖細胞。采用本發(fā)明提供的方法對巨核祖細胞進行分離，得率較 高且向巨核細胞定向誘導分化后得到表型為CD41a7CD6r的細胞比例較高。實驗表明，對 20~100MJ齊血進行分離，獲得的巨核組細胞的數(shù)量可達2. 75X106個，顯著優(yōu)于不進行刺 激培養(yǎng)分離篩選的對照組。經(jīng)鑒定，所得細胞中巨核組細胞的數(shù)量百分比為5~15%，經(jīng)14 天定向誘導分化培養(yǎng)，巨核細胞的數(shù)量總數(shù)可擴增312. 5+21. 2倍，CD41a7CD6r細胞（巨 核細胞）的比例可達81%。且采用該方法分離獲得的細胞可直接用于人體回輸。
【具體實施方式】
[0035] 本發(fā)明提供了一種巨核祖細胞的分離方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容， 適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例 進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應用進 行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0036] 本發(fā)明采用的試劑和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0037] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明： 陽03引實施例1單個核細胞分離
[0039] 將采集的廝血50mL中加入25mL徑乙基淀粉注射液（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公 司）（廝血：徑乙基淀粉=2:l(v/v))，充分混勻，靜止15minW上，沉降紅細胞，吸取上清 液；
[0040] 將上清液加至裝有淋己細胞分離液的離屯、分離管中（上清：分離液=2:l(