體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是涉及體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]眼免疫炎癥性疾病，泛指一類發(fā)病機(jī)制以眼部免疫炎癥反應(yīng)為主的疾病。由于眼部結(jié)構(gòu)與生理功能的獨(dú)特性，臨床上多種眼病的發(fā)病機(jī)制以免疫反應(yīng)為主，包括了眼化學(xué)傷、角膜移植排斥、葡萄膜炎等。
[0003]隨著我國企業(yè)尤其是鑄造業(yè)和化學(xué)工業(yè)的迅速發(fā)展，熾熱物質(zhì)、酸或堿性化學(xué)物品等濺入眼部引起嚴(yán)重的眼化學(xué)傷事故日漸增多，目前我國300萬-350萬角膜盲病人中有30%以上是因酸性、堿性化學(xué)傷、熱燒傷及機(jī)械性外傷等眼表損傷引起。由于致傷物的直接損害及其引起的后續(xù)炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者最終都表現(xiàn)為角膜溶解、大量新生血管和假性胬肉形成、角膜失去透明性，使其致盲率高達(dá)57.4%，僅有32.2%的患眼視力能達(dá)到0.1以上。尤其令人遺憾的是眼表損傷常常累及雙眼，且以青壯年及兒童患者居多，已成為個(gè)人、家庭、社會(huì)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與精神負(fù)擔(dān)。目前眼化學(xué)傷的治療原則是恢復(fù)眼表的完整性和眼表上皮細(xì)胞的正常表型，傳統(tǒng)的角膜復(fù)明手術(shù)，如穿透性角膜移植對這類患者很難湊效。盡管目前有多種的改良的治療方式被應(yīng)用于眼化學(xué)傷，如羊膜移植、羊膜提取液、人工培養(yǎng)的角膜緣上皮移植術(shù)等，但仍無法控制眼化學(xué)傷所導(dǎo)致的角膜溶解穿孔、瞼球粘連、眼表干細(xì)胞衰竭、角膜新生血管等嚴(yán)重并發(fā)癥，使其致盲率仍高達(dá)57.4%。因此，尋找一種安全、有效的治療眼化學(xué)傷的方法刻不容緩。
[0004]角膜盲是我國第二大致盲眼病，角膜移植是治療角膜盲的最有效手段。目前，角膜移植面臨的最大挑戰(zhàn)仍是術(shù)后植片免疫排斥，尤其對于嚴(yán)重化學(xué)傷、感染等高危病例，其10年內(nèi)術(shù)后排斥率高達(dá)60% _90%，其后果直接導(dǎo)致植片溶解，手術(shù)失敗。對于術(shù)后角膜移植免疫排斥，現(xiàn)今常用的藥物有糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素A(CsA)、他克莫司(FK506)等。糖皮質(zhì)激素局部長期使用可導(dǎo)致青光眼、白內(nèi)障、切口愈合不良，全身使用的副作用更多；CsA分子量大，水溶性差，不易穿透角膜，藥物載體毒性大；FK506的免疫抑制作用強(qiáng)，但長期應(yīng)用可導(dǎo)致腎功能損害、糖耐量降低和神經(jīng)系統(tǒng)功能受損，而且價(jià)格昂貴。因此，目前臨床上尚無特異性強(qiáng)、副作用低的抗角膜移植排斥的新型藥物。
[0005]葡萄膜炎廣義上是指葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管及其玻璃體的炎癥，是一類常見的病因復(fù)雜、反復(fù)發(fā)作、難于治愈的眼病，所致盲多為不可治盲，故在致盲眼病中占有重要的地位。其發(fā)病率約為0.5%，在美國約占致盲眼病的10%，在非感染性致盲性眼病中占第3位。葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，一般認(rèn)為與自身免疫反應(yīng)有關(guān)，屬Thl細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。
[0006]目前葡萄膜炎的治療尚缺乏有效的措施，臨床多采用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療，力求迅速抑制炎癥，減少組織破壞。但這種缺乏特異針對性的治療手段，常導(dǎo)致許多嚴(yán)重的并發(fā)癥，使組織器官遭受不可逆的損傷。因此尋找一種療效好、副作用又少的方法是治療葡萄膜炎的重要策略。調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞(R-ΜΦ)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種巨噬細(xì)胞的亞型，屬于選擇性激活巨卩蜜細(xì)胞(alternatively activated macrophages, Aa ΜΦ or M2ΜΦ)中的一種。研究發(fā)現(xiàn)R-ΜΦ具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。R-ΜΦ能夠分泌大量營養(yǎng)因子、抗炎因子，抑制炎癥，促進(jìn)傷口愈合。最近的研究發(fā)現(xiàn)，R-ΜΦ能夠抑制Τ細(xì)胞激活和增殖，抑制Thl和Thl7分化和功能，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受。因此，應(yīng)用體外誘導(dǎo)的R-ΜΦ是一種新的有前景的治療炎癥性和免疫性疾病的方法，這其中也包括了各種眼免疫炎癥性疾病的治療。目前已公開的文獻(xiàn)中，體外誘導(dǎo)的R-ΜΦ采用IL-10, TGF-beta,糖皮質(zhì)激素以及免疫復(fù)合物聯(lián)合IL-1受體拮抗劑或者TLR誘導(dǎo)，但均存在不穩(wěn)定、容易向Ml型促炎巨噬細(xì)胞分化的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的制備方法，由該方法得到的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞，具有很好的穩(wěn)定性，且對于眼免疫炎癥性疾病治療具有很好的應(yīng)用前景。
[0008]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0009]—種體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟:
[0010](1)取大鼠骨髓細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中加入重組大鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子，得貼壁生長的巨噬細(xì)胞；
[0011](2)在培養(yǎng)基中，加入全反式維甲酸以及腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β (TGF-β)，繼續(xù)培養(yǎng)3天以上，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞。
[0012]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟⑵加入的全反式維甲酸在培養(yǎng)基中的濃度為80-120nmol/L,加入的腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β在培養(yǎng)基中的濃度為8_12ng/ml。
[0013]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟⑵加入的全反式維甲酸在培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L，加入的腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β在培養(yǎng)基中的濃度為10ng/ml。
[0014]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)的培養(yǎng)時(shí)間至少為三天以上，5天效果最佳，6天后效果沒有增加，優(yōu)選為3-6天。
[0015]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)為:取大鼠骨髓細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)加入重組大鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子，于37°C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9d，每隔2天半量換液，得貼壁生長的巨噬細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明的另一目的是提供上述制備方法得到的體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞。
[0017]本發(fā)明的另一目的是提供一種上述體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的應(yīng)用。
[0018]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0019]體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞在制備治療眼免疫性炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0020]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述眼免疫性炎癥疾病為眼化學(xué)傷。
[0021]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述眼免疫性炎癥疾病為角膜移植排斥。
[0022]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述眼免疫性炎癥疾病為葡萄膜炎。
[0023]本發(fā)明采用全反式維甲酸以及TGF-beta體外誘導(dǎo)R-ΜΦ，可避免現(xiàn)有技術(shù)不穩(wěn)定、容易向Ml型促炎巨噬細(xì)胞分化的缺點(diǎn)，可很好地保持R-ΜΦ的穩(wěn)定，并有效地保持R-ΜΦ抗炎以及免疫調(diào)節(jié)功能的穩(wěn)定性。
[0024]本發(fā)明得到的體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞，對眼免疫性疾病具有很好的治療作用，特別是針對眼化學(xué)傷、角膜移植排斥、葡萄膜炎等眼免疫性疾病具有很好的療效。
[0025]本發(fā)明體外誘導(dǎo)ATR-ΜΦ可用于抗角膜移植排斥的新型藥物，是臨床上治療抗角膜移植排斥的很好的選擇。
[0026]本發(fā)明體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞(ATR-ΜΦ)可上調(diào)多種抗炎因子，對葡萄膜炎起到了有效的免疫抗炎作用且副作用少，將會(huì)是未來臨床上非常有發(fā)展前景的一種治療手段。
【附圖說明】
[0027]圖1:ΜΦ和ATR-ΜΦ的鑒定。其中，Α:ΜΦ免疫熒光法(400X)和流式細(xì)胞儀檢測ΜΦ標(biāo)記⑶lib的表達(dá)；B:ATR-M<i)抑制T細(xì)胞的通過細(xì)胞數(shù)量依賴的方式；(^PD:ELISA檢測LPS激活后ΜΦ和ATR-ΜΦ分泌的促炎癥因子TNF- a、IL-6和抗炎因子TGF- β、IL-10 ；Ε:流式細(xì)胞儀檢測R-ΜΦ的標(biāo)記物⑶163和⑶206的表達(dá)。
[0028]圖2.ATR-ΜΦ的穩(wěn)定性優(yōu)于R-ΜΦ。A:促炎因子IFN- γ處理后，ATR-ΜΦ抑制Τ細(xì)胞增殖的作用明顯優(yōu)于R-ΜΦ處理后，ATR-ΜΦ產(chǎn)生的促炎因子TNF-α、IL-6明顯少于R-ΜΦ，而ATR-ΜΦ產(chǎn)生的抗炎因子TGF-β、IL_10明顯多于R-ΜΦ ；D:IFN-y處理后，ATR-ΜΦ表達(dá)⑶163和⑶206的比例明顯多于R-ΜΦ。
[0029]圖3:ATR-M(i)促進(jìn)大鼠角膜化學(xué)傷傷口愈合。㈧:已建立適度的角膜化學(xué)傷大鼠模型，a:角膜上皮缺損，熒光染色圖片；b:角膜傷口愈合，上皮完整；c:角膜潰瘍形成；d:角膜穿孔；(B):局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯縮短角膜化學(xué)傷傷口愈合時(shí)間；(C)局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯減少角膜潰瘍和穿孔的發(fā)生率。
[0030]圖4:ATR-M(i)延長大鼠角膜移植后植片的生存時(shí)間。㈧:已建立大鼠移植模型，a:角膜移植術(shù)后；b:角膜移植術(shù)后第3天，角膜植片透明；c:角膜移植術(shù)后第6天，角膜植片開始水腫；d:角膜移植術(shù)后第9天，角膜植片排斥；(B):局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯延長角膜角膜移植排斥的發(fā)生時(shí)間，減少角膜移植排斥的發(fā)生率；(C)局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯延長角膜植片的生存時(shí)間。
[0031]圖5:ATR-ΜΦ減輕大鼠葡萄膜炎炎癥。(A):已建立大鼠葡萄膜炎模型，a:正常大鼠眼前段山:自身免疫性大鼠葡萄膜炎眼前段(白色尖頭:瞳孔纖維素滲出導(dǎo)致瞳孔膜閉)；(B):靜脈注射ATR-ΜΦ明顯減輕大鼠葡萄膜炎的癥狀。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0033]實(shí)施例1
[0034]本實(shí)施例體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟:
[0035](1)大鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的分離與純化
[0036]取大鼠骨髓細(xì)胞用含10%胎牛血清(Gibco，Grand Island, NY, USA) U00U/ml盤尼西林、100yg/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、20 μΜβ -巰基乙醇(以上試劑均購自Sigma, St.Louis, MO, USA)的RPMI 1640 (Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入重組大鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF ；PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA，終濃度50ng/ml)于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2X 10~6/mL。于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，隔2d半量換液，得貼壁細(xì)胞。
[0037](2)全反式維甲酸(all trans-retinoic acid, atRA)聯(lián)合腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β (TGF- β )
[0038]誘導(dǎo)巨.細(xì)胞極化為調(diào)節(jié)性巨卩蜜細(xì)胞(Regulatory macrophages)(簡稱ATR-ΜΦ):
[0039]加入(100nmol/L)全反式維甲酸(Sigma,St.Louis, M0)以及 lOng/ml TGF-β (R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)于培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)胞5天，得到ATR-ΜΦ。
[0040](