從外周血中產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性t細(xì)胞富集群的方法
【專利說明】從外周血中產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞富集群的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本專利申請(qǐng)要求2013年3月1日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/771,251號(hào)的權(quán) 益，將其通過引用的方式整體并入本文。 陽00引發(fā)明背景
[0004] 使用腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的過繼性細(xì)胞療法（ACT)在一些癌癥患者中產(chǎn)生了積極的 臨床反應(yīng)。然而，在將ACT成功地用于癌癥或其它疾病的治療中仍然存在一些障礙。例如， 從外周血中分離到的T細(xì)胞可能表現(xiàn)不出足夠的腫瘤特異的反應(yīng)性。因此，需要從外周血 中獲得腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞群的改進(jìn)方法。 陽00引發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明的實(shí)施方案提供了獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述方法 包括：(a)從外周血樣本中獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs)的混合群；化）從混合群中特異 地選擇還表達(dá)PD-1和/或TIM-3的CD8+T細(xì)胞；和（C)將化）中選擇的細(xì)胞與未被選擇的 細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0007] 本發(fā)明另一實(shí)施方案提供了向哺乳動(dòng)物施用富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的 方法，所述方法包括：(a)從外周血樣本中獲得PBMCs的混合群；化）從混合群中特異地選 擇還表達(dá)PD-1和/或TIM-3的CD8+T細(xì)胞；（C)將化）中選擇的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分 離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群；和（d)向哺乳動(dòng)物施用所述富集腫瘤反應(yīng)性T 細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0008] 本發(fā)明另一實(shí)施方案提供了獲得包含富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的藥物組 合物的方法，所述方法包括：(a)從外周血樣本中獲得PBMCs的混合群；化）從混合群中特 異地選擇還表達(dá)PD-1和/或TIM-3的CD8+T細(xì)胞；（C)將化）中選擇的細(xì)胞與未被選擇的 細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群；和（d)將所述富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的 細(xì)胞群與藥學(xué)上可接受的載體組合，W獲得包含富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的藥物組 合物。
[0009] 本發(fā)明另外的實(shí)施方案提供了相關(guān)的細(xì)胞群W及治療或預(yù)防癌癥的方法。
[0010] 附圖中幾個(gè)視圖的簡要描述 W11]圖1A-1B是顯示與自體腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)的細(xì)胞的干擾素（IFN)-丫的分泌（pg/ml)(黑色柱）W及表達(dá)4-1BB的CD8+細(xì)胞的百分比（灰色柱）的圖，所述細(xì)胞從黑素瘤患 者1913(A)或黑素瘤患者3713度）的外周血中分離，并通過巧光激活細(xì)胞分選術(shù)（FAC巧基 于CD8、PD-1或TIM-3的表達(dá)或者PD-1或TIM-3的不表達(dá)進(jìn)行分選，且在體外進(jìn)行了擴(kuò)增。 陽01引圖1C是顯示與自體腫瘤共培養(yǎng)的細(xì)胞的IFN-丫的分泌（pg/mU(黑色柱）化及 表達(dá)4-1BB的CD8+細(xì)胞（的百分比（灰色柱）的圖，所述細(xì)胞從黑素瘤患者3289的外周 血中分離，并通過FACS基于CD8、PD-l、LAG-3或TIM-3的表達(dá)或者PD-1或TIM-3的不表達(dá) 進(jìn)行了分選。
[0013]圖2A-2C是顯示效應(yīng)細(xì)胞對(duì)目標(biāo)自體腫瘤細(xì)胞系TC1913(A)、同種異體（Alio.)腫瘤細(xì)胞系TC3289度）或匹配HLA-A0201的腫瘤細(xì)胞系TC2448(C)特異性溶解的百分比的 圖，所述效應(yīng)細(xì)胞從患者1913的外周血中分離得到，并基于下述表達(dá)進(jìn)行分選：CD8+(空屯、 圓）、PD-r(黑色圓）、PD-1 (灰色圓）、TIM-3+(黑色菱形）或TIM-3 (灰色菱形），且將其 在體外進(jìn)行了擴(kuò)增。
[0014]圖2D-2F是顯示效應(yīng)細(xì)胞對(duì)目標(biāo)自體腫瘤細(xì)胞系TC3289值）、同種異體腫瘤細(xì)胞 系TC1913巧）或同種異體腫瘤細(xì)胞系TC624(巧特異性溶解的百分比的圖，所述效應(yīng)細(xì)胞從 患者3289的外周血中分離得到值-F)，并基于下述表達(dá)進(jìn)行分選：CD8+(空屯、圓）、PD-r(黑 色圓）、PD-1 (灰色圓）、TIM-3+(黑色菱形）或TIM-3 (灰色菱形）。顯示了體外擴(kuò)增之后 祀細(xì)胞的溶解。 陽〇1引發(fā)明詳述
[0016] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)選擇還表達(dá)程序性細(xì)胞死亡蛋白1 (PD-1 ;CD279)和/或T細(xì)胞免疫球蛋 白W及粘蛋白結(jié)構(gòu)域3(TIM-3)生物標(biāo)志物的CD8+細(xì)胞富集存在于外周血中的腫瘤反應(yīng)性 T細(xì)胞。與不表達(dá)PD-1和/或TIM-3的CD8+細(xì)胞相比，選擇的還表達(dá)運(yùn)些標(biāo)志物的CD8 +細(xì) 胞有利地富集更多數(shù)量的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。
[0017] 在運(yùn)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的方 法，所述方法包括：(a)從外周血樣本中獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（(PBMCs)的混合群；化）從 混合群中特異地選擇還表達(dá)PD-1和/或TIM-3的CD8+T細(xì)胞；和（C)將化）中選擇的細(xì)胞 與未被選擇的細(xì)胞分離W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明方法有利地使縮短 體外培養(yǎng)時(shí)間W及在不必進(jìn)行自體腫瘤識(shí)別篩選的情況下選擇腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞成為可 能。
[0018] 方法可W包括通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，從外周血樣本中獲得PBMCs的 混合群。獲得PBMCs混合群的合適的方法可包括，但不限于抽血和/或白細(xì)胞分離術(shù)。從 腫瘤樣本中獲得的PBMCs混合群可包含T細(xì)胞，包括腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。
[0019] 可從任何哺乳動(dòng)物中獲得外周血。除非另有說明，本文使用的術(shù)語"哺乳動(dòng)物"指 任何哺乳動(dòng)物，其包括，但不限于：兔形目的哺乳動(dòng)物，如兔；食肉目的哺乳動(dòng)物，包括貓科 動(dòng)物（貓）和犬科動(dòng)物（狗）；偶蹄目的哺乳動(dòng)物，包括?？苿?dòng)物（（牛）和豬科動(dòng)物（（豬）； 或者奇蹄目的哺乳動(dòng)物，包括馬科動(dòng)物（（馬）。哺乳動(dòng)物優(yōu)選非人類的靈長類，例如靈長 目、猿（Ceboids)目或猴（Simoids)目（猴），或者優(yōu)選類人猿亞目（人和類人猿）。在一 些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物可W是曬齒目的哺乳動(dòng)物，如小鼠和倉鼠。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物為非 人類的靈長類或者人類。特別優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。
[0020] 方法可W包括從混合群中特異地選擇還表達(dá)PD-1和/或TIM-3的CD8+T細(xì)胞。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括選擇還表達(dá)CD3的細(xì)胞。該方法可W包括W任何合適的方 式特異地選擇細(xì)胞。優(yōu)選地，用流式細(xì)胞術(shù)來選擇?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法 來實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)可W使用任何合適的抗體和染色劑。例如，可分別使用抗 CD3、抗CD8、抗TIM-3、或抗PD-1的抗體來特異地選擇CD3、CD8、TIM-3或PD-1。優(yōu)選地，選 擇抗體，W使其特異地識(shí)別被選擇的特定生物標(biāo)志物并與之結(jié)合?？蓪⒁环N或多種抗體與 珠（例如磁珠）或者巧光染料結(jié)合。優(yōu)選地，流式細(xì)胞術(shù)為巧光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，特異地選擇可W包括特異地選擇對(duì)于表達(dá)TIM-3和PD-1 之一或者TIM-3和PD-1兩者為陽性的CD8+T細(xì)胞。在運(yùn)方面，特異地選擇可W包括特異地 選擇表達(dá)TIM-3或PD-1的單陽性T細(xì)胞或者同時(shí)共表達(dá)TIM-3和PD-1的雙陽性T細(xì)胞。 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，方法包括從混合群中特異地選擇表達(dá)TIM-3的CD8+T細(xì)胞。在本 發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括從混合群中特異地選擇表達(dá)PD-1的CD8+T細(xì)胞。本發(fā) 明另一個(gè)實(shí)施方案包括從混合群中特異地選擇為（i)TIM-37PD-r、（ii)TIM-3 /PD-r，或 (iii)TIM-37PD-l的CD8叮細(xì)胞。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的任何方法還可W包括選擇還表達(dá)CD3+的細(xì)胞。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，特異地選擇可包括特異地選擇表達(dá)本文所述的任何標(biāo)志 物的CD8+細(xì)胞的組合。在運(yùn)方面，本發(fā)明方法可產(chǎn)生富集腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的細(xì)胞群，所述 細(xì)胞群包含表達(dá)本文所述的生物標(biāo)志物中的任何兩種的細(xì)胞的混合物。在本發(fā)明的實(shí)施方 案中，特異地選擇包括特異地選擇PD-r細(xì)胞和TIM-3 +細(xì)胞的組合。在本發(fā)明另一實(shí)施方 案中，本文所述的任何方法還可W包括選擇還表達(dá)CD8+和/或CD3 +的細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明方法可W包括將選擇的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng) 性T細(xì)胞的細(xì)胞群。在運(yùn)方面，可將選擇的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞物理分離?？赏ㄟ^任何 合適的方法將選擇的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分離