一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因b1型突變的引物及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物及應用， 屬于植物分子標記開發(fā)和作物分子輔助選擇技術領域。
【背景技術】
[0002] 大豆為人類提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的經(jīng)濟性狀。 商品大豆油主要包括大約11 %的軟脂酸（16:0)，4%的硬脂酸（18:0)，25%的油酸（18:1)， 52%的亞油酸（18:2)和4%的亞麻酸（18:3) (Fehr，2007)。中國各地區(qū)的氣候、土壤、水質(zhì) 等自然條件以及品種選育方向均存在差異，為大豆種質(zhì)資源品質(zhì)特性的豐富變異創(chuàng)造了條 件，有利于篩選優(yōu)異脂肪酸組成的大豆種質(zhì)（蓋均鎰等，2001)。不飽和脂肪酸為人體必需 脂肪酸，在人體新陳代謝中具
[0003] 有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中總膽固醇和有害膽固醇含量，營養(yǎng)學 家稱之為"安全脂肪酸"，亞油酸具有抑制癌癥，預防糖尿病和減少體內(nèi)脂肪，減少血液中膽 固醇量，防止動脈硬化的作用，亞麻酸具有溶血栓，降血壓防血小板凝集，健腦抗衰老等作 用（陳學珍，2004)。在大豆油脂中的不飽和脂肪酸具有重要的生理保健作用，不飽和脂肪 酸中油酸的穩(wěn)定性最好，提高其含量可以延長貯藏期，但由于亞油酸和亞麻酸分別含有2， 3個不飽和雙鍵，容易使油脂氧化變質(zhì)，造成豆油及其食品味道不佳，營養(yǎng)價值降低。另外， 由于飽和脂肪酸能量低，不易消化吸收，過多食用會導致肥胖病和心血管疾?。盍?， 2006)。因此，提高油酸含量，降低亞油酸含量是大豆品質(zhì)育種的重要目標之一。
[0004] 在油脂的合成途徑中，脂肪酸脫氫酶2 (FAD2)在油酸前體向亞油酸前體的轉變過 程中起到了至關重要的作用（Okuley等，1994 ;Schlueter等，2007)，在發(fā)育的大豆種子中， 2 個脂肪酸脫飽和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表達水平 最高，因此這2個基因被認為是控制大豆油酸含量的候選基因，并且越來越多的研宄者通 過改造這2個目標基因來培育高油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆品種?；蚬こ毯秃蜻x基因分子育種 策略被用來培育高于80%油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆（Buhr等，2002 ;H〇shin〇等，2010 ;Pham等， 2010)，這些研宄成果證明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突變程度越嚴重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同時油脂的穩(wěn)定性也越強。
[0005] 我國作為大豆的發(fā)源地，具有豐富的大豆種質(zhì)資源。目前，我國作物種質(zhì)資源庫己 保存的大豆種質(zhì)資源達3萬余份，居世界之首（汪越勝，2002)。然而利用傳統(tǒng)的油分鑒定 方法對數(shù)目龐大的大豆資源進行鑒定工作量大，周期長的問題，目前尚沒有一種能夠快速 并且準確地檢測控制大豆高油酸含量的B1型突變位點的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型 突變的引物，所采取的技術方案如下：
[0007] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變 的引物，該引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述引物快速檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成 基因B1型突變的方法，該方法以待測樣品的DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列為引物進行PCR擴增，在對所獲得的擴增產(chǎn)物進行酶切，最后利用電泳 鑒定酶切產(chǎn)物。
[0009] 所述方法的步驟如下：
[0010] 1)提取待測樣品的DNA，備用；
[0011] 2)以步驟1)所得DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列 為引物進行PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物；
[0012] 3)利用內(nèi)切酶對步驟2)所得PCR擴增產(chǎn)物進行酶切處理，獲得酶切產(chǎn)物；
[0013] 4)利用電泳鑒定步驟3)所得酶切產(chǎn)物。
[0014] 優(yōu)選地，步驟2)所述PCR擴增，擴增條件為：94°C預變性4min，94°C變性40s，52°C 退火30s，72°C延伸15s，共40個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。
[0015] 優(yōu)選地，步驟3)所述酶切處理，是利用Apal內(nèi)切酶，在37°C下酶切過夜。
[0016] 更優(yōu)選地，所述酶切，在10 y1酶切體系中Apal內(nèi)切酶的用量為0.2 y1。
[0017] 優(yōu)選地，步驟4)所述利用電泳進行鑒定，含有239bp條帶的樣品的大豆脂肪酸脫 氫酶合成基因發(fā)生B1突變。
[0018] 更優(yōu)選地，所述利用電泳進行鑒定，只含有239bp條帶的樣品為大豆脂肪酸脫氫 酶合成基因B1突變純合體，含有239bp和261bp條帶的樣品為大豆脂肪酸脫氫酶合成基因 B1突變雜合體。
[0019] 所述方法的具體步驟如下：
[0020] 1)提取待測樣品的DNA，備用；
[0021] 2)以步驟1)所得DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列 為引物進行PCR擴增，擴增條件為：94°C預變性4min，94°C變性40s，52°C退火30s，72°C延 伸15s，共40個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，獲得PCR擴增產(chǎn)物；
[0022] 3)利用Apal內(nèi)切酶對步驟2)所得PCR擴增產(chǎn)物在37°C下酶切過夜，獲得酶切產(chǎn) 物；
[0023] 4)利用電泳鑒定步驟3)所得酶切產(chǎn)物，含有239bp條帶的樣品的大豆脂肪酸脫氫 酶合成基因發(fā)生B1突變。
[0024] 所述任一方法用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變體。
[0025] 本發(fā)明有益效果：
[0026] 本發(fā)明是在克隆出的大豆脂肪酸脫氫酶合成基因GmFAD2-lB基礎上，通過比較高 油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列，首次發(fā)現(xiàn)了位于409bp處的 單堿基突變（C-G)，且該突變導致油酸含量變化。
[0027]本發(fā)明針對B1突變位點設計了 1套分子標記（上游引物FAD2-1B-F2D，下游引物 FAD2-1B-R2,如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示）進行包含突變位點的PCR擴增，并利用核 酸內(nèi)切酶Apal對擴增產(chǎn)物進行酶切反應，最后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行 片段分離，最終鑒定出B1突變位點。其中，本發(fā)明所涉及的引物和酶切鑒定反應能夠快速 并且準確地檢測控制大豆高油酸含量的B1型突變位點，本發(fā)明可以大大縮短高油酸大豆 材料的篩選周期，為高油酸大豆品種的培育提供了分子標記資源。
【附圖說明】
[0028] 圖1為GmFAD-2-lB(大豆脂肪酸脫氫酶合成基因）B1型突變位點。
[0029] 圖2為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定出B1突變位點；
[0030](其中鑒定到藍色箭頭所指片段包含B1突變位點，Lanel為A3XB1-1雜合個體；Lane2為A3XB1-2雜合個體，Lane3為A3XB1-3雜合個體；Lane4為A3XB1-4雜合個體； Lane5為A3XB1-5雜合個體；Lane6為A3XB1-6雜合個體；Lane7為A3XB2雜合個體； LanelO為A3XB1-7雜合個體；Lanel2為合豐XB2雜合個體；Lanel3為黑農(nóng)XB1雜合個 體；Lanel4為中黃XB2-1雜合個體；Lanel5為中黃XB2-2雜合個體；LaneBl為B1純合個 體；Lane34為He3e4e7 ;Lane合為合豐純