一種定點突變改造的n-糖酰胺酶d及其制備方法和應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，設及一種定點突變改造的N-糖酷胺酶D及其制備方法 和應用，具體設及活性位點突變的N-糖酷胺酶D重組蛋白及其在分離、純化糖蛋白中的應 用。
【背景技術】：
[0002] 糖蛋白是一類由糖類與多膚或蛋白質W共價鍵連接而形成的結合蛋白，是生物體 內重要的一類大分子，種類繁多，分布廣泛，具有多種重要功能。但天然糖蛋白一般含量較 低，目前尚無成熟的、簡單快捷的糖蛋白分離純化方法。分離純化方法的選擇要根據糖蛋白 的具體性質和研究目的來確定。
[0003] 常用的糖蛋白分離純化方法是:先將糖蛋白粗提取物分級處理，然后應用陰離子 交換柱層析、凝膠柱層析、親和柱層析或其他方法進行進一步分離純化。其他用于糖蛋白分 離純化的方法還有超濾法、超離屯、法、區(qū)帶電泳法、金屬絡合法等。但運些方法都存在一定 的局限性，如造成樣品的變性、損失或者引入其他雜質等。
[0004] 因此，尋找一種簡單、便捷的方法分離和純化糖蛋白十分有必要。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種定點突變改造的N-糖酷胺酶D，該重組蛋白不具有N-糖酷胺酶的酶解能力，但可W特異性的識別、結合糖蛋白，從而達到分離、純化糖蛋白的目 的。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述定點突變改造的N-糖酷胺酶D的編碼基因。
[0007] 本發(fā)明的又一目的在于提供上述定點突變改造的N-糖酷胺酶D的制備方法。
[000引本發(fā)明通過利用已經非常成熟的基因工程技術，通過基因定點突變，重組表達和 生化特性研究等獲得了兩種新型N-糖酷胺酶。其不具有酶解N-鏈寡糖的能力，但可W特異 性的識別結合糖蛋白，從而達到分離純化糖蛋白的目的。
[0009]本發(fā)明的目的可W通過W下技術方案實現：
[0010] -種定點突變改造的N-糖酷胺酶D，它是由氨基酸序列為沈Q ID NO. 1的野生型N-糖酷胺酶D在102位或236位氨基酸定點突變而產生的。
[0011] 上述的定點突變改造的N-糖酷胺酶D，其中，102位氨基酸定點突變改造的N-糖酷 胺酶D的氨基酸序列為SEQ ID NO.2,236位氨基酸定點突變改造的N-糖酷胺酶D的氨基酸序 列為沈Q ID NO.3。
[0012] 上述的定點突變改造的N-糖酷胺酶D的編碼基因，其在于:該編碼基因具有下述核 巧酸序列之一：
[0013] (1)序列表中沈Q ID NO.5和沈Q ID NO.6所示的核巧酸序列，其中沈Q ID NO.5為 編碼102位氨基酸定點突變改造的N-糖酷胺酶D的核巧酸序列，SEQ ID NO.6為編碼236位氨 基酸定點突變改造的N-糖酷胺酶D的核巧酸序列；
[0014] (2)編碼序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多核巧酸。
[0015] 含有上述的定點突變改造的N-糖酷胺酶D的編碼基因的表達載體、轉基因細胞系 和轉基因重組菌。
[0016] 上述的定點突變改造的N-糖酷胺酶D的制備方法，包括W下步驟制備：
[0017] 1)設計含有突變位點的特異性引物；
[001引2)提取野生型N-糖酷胺酶D表達質粒；
[0019] 3) W野生型N-糖酷胺酶D表達質粒為模板，在步驟(1)所述特異性引物的作用下進 行PCR反應，獲得含有定點突變的N-糖酷胺酶D重組基因的質粒；
[0020] 4)使用化nl進行酶切，除去野生型N-糖酷胺酶D表達質粒，保留含有定點突變的N-糖酷胺酶D重組基因的質粒；
[0021] 5)將步驟4)所得質粒轉入大腸桿菌ToplO,過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆子測序;測序 正確后轉入化(DE21)，誘導其表達，得到目的蛋白。
[0022] 步驟（1)中所述的含有突變位點的特異性引物為用于102位定點突變的引物或用 于236位定點突變的引物：
[0023] 用于102位定點突變的引物：
[0024] 上游引物：CTGGTCGTCAGTACgccCGTACCGCTACCC
[0025] 下游引物:GGGTAGCGGTACGggcGTACTGACGACCAG [00%]用于236位定點突變的引物：
[0027]上游引物：TCAGGGTGGTgacgcaTTTTGGTACAC [002引下游引物:GTGTACCAAAAtgcgtcACCACCCTGA
[0029] 上述的定點突變改造的N-糖酷胺酶D在特異性結合糖蛋白中的應用。
[0030] 上述的定點突變改造的N-糖酷胺酶D在分離、純化糖蛋白中的應用。
[0031] 從保藏號為DSM-16301的菌株中提取野生型N-糖酷胺酶D表達質粒。
[0032] 本發(fā)明提供的兩種定點突變的N-糖酷胺酶DjD102和DjE236,由野生型N-糖酷胺酶 D的氨基酸序列定點突變所得。優(yōu)選的，所述重組蛋白酶由野生型N-糖酷胺酶D的102和236 位氨基酸突變獲得。該重組蛋白酶不具有野生型N-糖酷胺酶D的活性，但可W特異性結合糖 蛋白。
[0033] 本發(fā)明的有益效果：
[0034] 本技術方案可W通過基因工程技術得到兩種突變的N-糖酷胺酶DjD102和DjE236， 其雖不具有酶解N-鏈寡糖的活力，但可W特異性識別、結合變性或者不變性的糖蛋白，為分 離、純化糖蛋白提供了一種新的途徑。
【附圖說明】
[0035] 圖1不同N-糖酷胺酶酶解辣根過氧化物酶N-鏈寡糖的檢測
[0036] 圖2不同N-糖酷胺酶結合辣根過氧化物酶能力的顏色反應
【具體實施方式】
[0037] 結合W下具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明，本發(fā)明的保護內容不局限于 W下實例。
[0038] 實驗材料和試劑
[0039] 1、菌株和載體：
[0040] 常規(guī)菌種Dyella japonica購自德國微生物菌種保藏中屯、（DSMZ)，保藏號：051-16301。大腸桿菌Top 10、化21 (DE3)級表達載體pRSF購自No vagen公司。
[0041] 2、酶類及其他生化試劑：
[0042] 限制性內切酶、DNA MarkerJrotein Marker購自TaKaRa公司；A巧Prep質粒提取 試劑盒為Axygen公司產品。其他常規(guī)試劑為上海生工或南京壽德公司。
[0043] 3、本發(fā)明中所使用的生物化學技術均為本領域中的常規(guī)技術：
[0044] 在W下實施例中，除非特殊說明，所有實驗操作均按照W下實驗手冊或文獻中的 部分進行，包括：[美]J.沙姆布魯克等，分子克隆實驗指南;趙永芳等，生物化學技術原理及 其應用(第二版）；朱檢等，生物化學實驗[M]。
[0045] 實施例1定點突變N-糖酷胺酶DjD102和DjE236基因的獲得
[0046] 1)來源于梗稻(Dyella japonica)中的野生型N-糖酷胺酶D的菌株購自德國微生 物菌種保藏中屯、(DSMZ)，保藏號:DSM-16301。從菌株DSM-16301中提取野生型N-糖酷胺酶D 的表達質粒，并W此為模板進行定點突變。
[0047] 2)根據所需定點突變的位點，設計引物，具體如下表所述：
[0048] _
[0049] 3)分別使用設計的DjD102和DjE236的上游引物和下游引物進行PCR，反應體系如 下： 5xPS緩沖液 1〇μΙ_ dNTPs(2.5mM) 化 L primel 1μ1_ prime2 ΙμL
[(Κ)加] Primer 5ΤΑΚ{2.5υ/μL) 0.5μΙ Template 0.5 μL ddH?_0 33μL Το 枯 I 50μΙ_
[0051 ] 4)PCR反應條件如下： (1) 預變性： 98T Imin (2) 變性： 98。〔 日化
[0052] (3)退火、延伸 日8T 8min (.2) - (3)循環(huán)化欲 (4)終延伸： 魄。C 5min
[0053] 5)化nl酶切反應，37°C，反應3小時。反應體系如下： Green buffer 5.1μΙ_ Dpnl 1μ1_
[00日4] PCR 產物 SOyL To 拉 I 56.1μΙ_
[0055] 6)轉入大腸桿菌ToplO細胞中，過夜培養(yǎng)，挑斑測序。測序結果正確，得到定點突變 DjD102和DjE236。
[0化6] 實施例2定點突變N-糖酷胺酶DjD102和DjE236基因在化(DE21)中的表達
[0057]將實施例1中得到的帶有定點突變質粒的大腸桿菌ToplO細胞中的質粒抽提出來， 轉化到制備好的感受態(tài)細胞化21 (DE3)中。挑取重組大腸桿菌菌株化21 (DE3巧Ij5ml含卡納 抗生素的LB液體培養(yǎng)基中37°C，250rpm振蕩過夜培養(yǎng)。按1%接種量(v/v)轉接到新鮮LB (400ml)培養(yǎng)液中，37°C，200巧m振蕩培養(yǎng)至0〇6日日-0.6-0.8，加入誘導劑IPTG至終濃度 1 .〇11^，18°(3,20化91]1振蕩過夜培養(yǎng)。
[0化引實施例3定點突