一種定點(diǎn)突變改造的基因工程l-天冬酰胺酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-天冬醜胺酶（L-asparaginaseamidohydrolase，E.C. 3. 5. 1. 1)能夠?qū)-天冬 酰胺水解脫氨基形成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶具有抗腫瘤活性，目前已應(yīng)用于治療 急性淋巴細(xì)胞白血病及霍金森病等，近年來研究發(fā)現(xiàn)L-天冬酰胺酶還可以減少油炸食品 中丙烯酰胺的生成。L-天冬酰胺酶大小、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)因來源不同而有所不同。L-天冬酰胺 酶來源比較廣泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都發(fā)現(xiàn)含有L-天冬酰胺酶。
[0003] 本發(fā)明采用單點(diǎn)突變技術(shù)，基于同源建模方法，通過選擇特定氨基酸優(yōu)化枯草芽 孢桿菌（Bacillussubtilis168)的L-天冬酰胺酶分子結(jié)構(gòu)、提高酶活。
[0004] 異源表達(dá)L-天冬酰胺酶突出的問題是，蛋白表達(dá)量低、L-天冬酰胺酶酶活低。因 此，定點(diǎn)突變改造L-天冬酰胺酶，提高胞外酶活，對(duì)于提高L-天冬酰胺酶工業(yè)化應(yīng)用前景 具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體及其構(gòu)建 方法。
[0006] 本發(fā)明提供一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨 基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0007] 所述突變體的核苷酸序列是SEQIDN0. 3所示的序列。
[0008] 所述突變體是在如序列SEQIDN0.2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將166位氨基酸由 絲氨酸突變成丙氨酸。
[0009] 前期研究工作中，本研究團(tuán)隊(duì)已獲得一種產(chǎn)L-天冬酰胺酶的枯草芽孢桿菌工程 菌，該枯草芽孢桿菌表達(dá)核苷酸序列如SEQIDN0. 4所示的L-天冬酰胺酶。
[0010] 所述編碼SEQIDN0. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDN0. 4所示的序列。
[0011] 本發(fā)明還提供一種表達(dá)所述L-天冬酰胺酶突變體的基因工程菌。
[0012] 所述基因工程菌的制備方法，是在SEQIDN0. 4所示序列的基礎(chǔ)上，將第166位的 絲氨酸突變成了丙氨酸，得到重組基因，將重組基因連接到表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主菌中即得到枯草芽孢桿菌基因工程菌。
[0013] 所述表達(dá)載體是pMA5。
[0014] 所述的制備方法，具體是：
[0015] (1)以SEQIDN0. 4所示核苷酸序列為模板，F(xiàn)lprimer(序列如SEQIDN0. 5所 示），Rlprimer(序列如SEQIDNO. 6所示）為引物，進(jìn)行PCR即得到SEQIDNO. 3所示的 重組基因S166A。
[0016] (2)將上一步得到的重組基因序列，連接到PMA5表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒 PMA5-S166A，重組質(zhì)?；D(zhuǎn)化B.subtilis168,獲得重組枯草芽孢桿菌工程菌株，命名為 PMA5-S166A/B.subtilis168〇
[0017] 本發(fā)明在天然L-天冬酰胺酶的基礎(chǔ)上，通過定點(diǎn)突變生物技術(shù)改造L-天冬酰胺 酶分子結(jié)構(gòu)，得到一株酶活提高的L-天冬酰胺酶工程菌，比酶活較原始酶提高25%。突變 體酶S166Aansz的底物親和力較原始酶降低20%，而催化效率提高8. 4%。本發(fā)明表明166 位氨基酸殘基對(duì)酶的催化作用有較大影響，對(duì)該酶的催化機(jī)理的研究提供了一定的基礎(chǔ)， 并提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1含L-天冬酰胺酶突變體的重組載體的構(gòu)建
[0019] (1)S166A突變體的獲得：以SEQIDN0. 4所示核苷酸序列為模板，F(xiàn)primer(序列 如SEQIDN0. 5所示），Rprimer(序列如SEQIDN0.6所示）為引物，進(jìn)行PCR即得到SEQ IDN0. 3所示的重組基因。
[0020] (2)將重組基因與pMA5分別用BamHI、MluI雙酶切，純化后用T4DNA連接酶16°C 過夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素（50mg/L)LB 平板，提取質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為PMA5-S166A。測(cè)序工作由上海生工完 成。
[0021 ] 實(shí)施例2產(chǎn)L-天冬酰胺酶枯草芽孢桿菌工程菌構(gòu)建
[0022] 將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pMA5-S166A化學(xué)法轉(zhuǎn)化入B.subtilis168感受態(tài)細(xì) 胞，具體方法如下：
[0023] (1)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所需溶液如下（g/L):
[0024]Sp-A:(NH4)2S044,K2HP0428,檸檬酸鈉 12Sp-B:MgS04 ? 7H200?4
[0025] 100XCAYE:Casaminoacid20,酵母粉 100SpI培養(yǎng)基：Sp-A49%，Sp-B49%， 50% 葡萄糖 2%，100XCAYE2%SpII培養(yǎng)基：SpI培養(yǎng)基 98%，50mmol/LCaCl2l%， 250mmol/LMgCl2l%。115°C濕熱滅菌。
[0026] (2)將B.Subtilis168的單菌落接種至2mLSpI培養(yǎng)基中（50mL離心管），37°C、 200r/min培養(yǎng)過夜；
[0027] (3)取100yL培養(yǎng)液至5mLSpI培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（0D600 值為1左右），約4~5h;
[0028] (4)取200yL培養(yǎng)液至2mLSpII培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)90min，取出后 加入20yL10mmol/LEGTA，于37°C、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)10min，然后分裝成500yL每管， 加入5yL重組質(zhì)粒pMA5-S166A，混勻，37°C、200r/min培養(yǎng)90min，取菌液涂布抗性平板。 37°C培養(yǎng)12h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。得到重組菌pMA5-S166A/B.subtilis168。
[0029] 實(shí)施例3:重組菌pMA5-S166A/B.subtilis168L-天冬酞胺酶高效表達(dá)及酶活測(cè) 定。
[0030] (1)將實(shí)施例2構(gòu)建的重組菌pMA5-S166A/B.subtilis168與原始菌株 pMA5-ansz/B.subtilis168分別接種于10mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng) 過夜，次日按4%的接種量轉(zhuǎn)接于枯草芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液于 4°C，lOOOOr/min離心lOmin，上清為胞外粗酶液，細(xì)胞破碎上清液為胞內(nèi)粗酶液，用于酶活 力的測(cè)定。
[0031] (2)枯草芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/L，K2HP042. 3g/L，KH2P041. 7g/L， 玉米衆(zhòng)158凡，尿素38凡，葡萄糖4(^凡，]\%3040 . 758凡，似(]158凡。調(diào)節(jié)口116.8-7.0。
[0032] (3)酶活定義：在40°C，pH7. 5反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酞胺轉(zhuǎn)化為 lymolNH3所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。
[0033] (4) L-天冬酰胺酶酶活測(cè)定方法：以L-天冬酰胺為底物，通過測(cè)定在催化反應(yīng)中 釋放的見13的量來測(cè)定酶活。反應(yīng)混合物（lmL)組成為：400 yL 25mM L-天冬酰胺（溶解于 50mM pH 7.5Tris-HCl) ;400 yL50mM pH 7.5Tris-HCl ;100yL適當(dāng)濃度的酶溶液。反應(yīng)混 合物在40°C，pH7. 5條件下，反應(yīng)15min后，加入100yL 15%(W/V% )三氯乙酸溶液終止 反應(yīng)。以酶反應(yīng)前加入三氯乙酸終止反應(yīng)的反應(yīng)液作為空白對(duì)照。反應(yīng)混合物在20000g條 件下離心l〇min，取200uL上清液加入到4. 8mL的去離子水中。向上述體系中加入200yL 的奈斯勒試劑，測(cè)定在450nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，通過顯色反應(yīng)測(cè)酶反應(yīng)所釋放的NH3的量。
[0034] (5)結(jié)果表明重組菌pMA5-S166A/B.subtilis168表達(dá)的L-天冬酰胺酶酶活為 657.lU/mL,比原始菌株pMA5_ansz/.subtilis168 (534. 2U/mL)L-天冬酰胺酶酶活提高 23%〇
[0035] (6)分析純化后的重組L-天冬酰胺酶S166AansJ|學(xué)性質(zhì)，如表1，底物親和力較 原始酶降低20%，催化效率提高8. 4%，同時(shí)比酶活提高25%。由于催化效率的提高，增加 了S166Aansz的比酶活。
[0036] 表1S166AanszS應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0037]
[0038] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示的序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體是在如序列SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第166位絲氨酸突變成丙氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體的核苷酸序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變體，其特征在于，所述編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列 的核苷酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。5. -種含有權(quán)利要求1所述突變體的重組表達(dá)載體。6. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述L-天冬酰胺酶突變體的基因工程菌。7. -種權(quán)利要求6所述基因工程菌的制備方法，是在SEQ ID NO. 4所示序列的基礎(chǔ)上， 將第166位絲氨酸突變成丙氨酸，得到重組基因，將重組基因連到表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒， 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主菌中即得到枯草芽孢桿菌基因工程菌。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述方法具體是：（1)以SEQ ID NO. 4 所示核酸序列為模板，序列如SEQ ID NO. 5所示的Fprimer、序列如SEQ ID NO. 6所示的 Rprimer為引物，進(jìn)行PCR，即得到編碼的166位氨基酸由絲氨酸突變成丙氨酸S166A突變 體基因序列；⑵將上一步得到的重組基因序列，連接到 PMA5表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒 PMA5-S166A，重組質(zhì)?；D(zhuǎn)化B. Subtilis，獲得重組枯草芽孢桿菌基因工程菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明的突變體是在SEQ？ID？N0.2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第166位絲氨酸突變成丙氨酸。本發(fā)明得到的突變體在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，搖瓶發(fā)酵24h后酶活為657.1U/mL，突變酶活提高了23％，底物親和力較原始酶降低20％，催化效率提高8.4％，同時(shí)比酶活提高25％。本發(fā)明表明166位氨基酸殘基對(duì)酶的催化作用有較大影響，對(duì)該酶的催化機(jī)理的研究提供了一定的基礎(chǔ)，并提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。
【IPC分類】C12N15/75, C12N1/21, C12R1/125, C12N9/82
【公開號(hào)】CN105062998
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510528335
【發(fā)明人】饒志明, 龍水清, 張顯, 楊套偉, 徐美娟
【申請(qǐng)人】江南大學(xué), 江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所, 如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月25日