一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因b1型突變的引物組及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組及應(yīng) 用，屬于植物分子標(biāo)記開發(fā)和作物分子輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆為人類提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的經(jīng)濟(jì)性狀。 商品大豆油主要包括大約11 %的軟脂酸（16:0)，4%的硬脂酸（18:0)，25%的油酸（18:1)， 52%的亞油酸（18:2)和4%的亞麻酸（18:3) (Fehr，2007)。中國各地區(qū)的氣候、土壤、水質(zhì) 等自然條件以及品種選育方向均存在差異，為大豆種質(zhì)資源品質(zhì)特性的豐富變異創(chuàng)造了條 件，有利于篩選優(yōu)異脂肪酸組成的大豆種質(zhì)（蓋均鎰等，2001)。不飽和脂肪酸為人體必需 脂肪酸，在人體新陳代謝中具有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中總膽固醇和有害 膽固醇含量，營養(yǎng)學(xué)家稱之為"安全脂肪酸"，亞油酸具有抑制癌癥，預(yù)防糖尿病和減少體內(nèi) 脂肪，減少血液中膽固醇量，防止動脈硬化的作用，亞麻酸具有溶血栓，降血壓防血小板凝 集，健腦抗衰老等作用（陳學(xué)珍，2004)。在大豆油脂中的不飽和脂肪酸具有重要的生理保 健作用，不飽和脂肪酸中油酸的穩(wěn)定性最好，提高其含量可以延長貯藏期，但由于亞油酸和 亞麻酸分別含有2, 3個不飽和雙鍵，容易使油脂氧化變質(zhì)，造成豆油及其食品味道不佳，營 養(yǎng)價值降低。另外，由于飽和脂肪酸能量低，不易消化吸收，過多食用會導(dǎo)致肥胖病和心血 管疾病（楊柳等，2006)。因此，提高油酸含量，降亞油酸含量是大豆品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之 〇
[0003] 在油脂的合成途徑中，脂肪酸脫氫酶2 (FAD2)在油酸前體向亞油酸前體的轉(zhuǎn)變過 程中起到了至關(guān)重要的作用（Okuley等，1994 ;Schlueter等，2007)，在發(fā)育的大豆種子中， 2 個脂肪酸脫飽和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表達(dá)水平 最高，因此這2個基因被認(rèn)為是控制大豆油酸含量的候選基因，并且越來越多的研宄者通 過改造這2個目標(biāo)基因來培育高油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆品種?；蚬こ毯秃蜻x基因分子育種 策略被用來培育高于80%油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆（Buhr等，2002 ;H〇shin〇等，2010 ;Pham等， 2010)，這些研宄成果證明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突變程度越嚴(yán)重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同時油脂的穩(wěn)定性也越強(qiáng)。
[0004] 我國作為大豆的發(fā)源地，具有豐富的大豆種質(zhì)資源。目前，我國作物種質(zhì)資源庫己 保存的大豆種質(zhì)資源達(dá)3萬余份，居世界之首（汪越勝，2002)。然而利用傳統(tǒng)的油分鑒定 方法對數(shù)目龐大的大豆資源進(jìn)行鑒定工作量大，周期長，目前尚沒有一種能夠快速并且準(zhǔn) 確地檢測控制大豆高油酸含量的B1型突變位點(diǎn)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型 突變的引物組，所采取的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變 的引物組，該引物組的核苷酸如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 5所示。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述引物組快檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成 基因B1型突變的方法，該方法是以待測樣品的DNA為模板，以如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 2 所述序列為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物后，再以稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以 如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后利用高分辨率熔 解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因型突變檢測。
[0008] 所述方法的步驟如下：
[0009] 1)提取待鑒定材料的DNA ;
[0010] 2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引物 進(jìn)行第一輪PCR巢式擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)行稀釋處理；
[0011] 3)以步驟2)中稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 5所述序 列為引物進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后獲得第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型突變進(jìn)行檢測。
[0013] 優(yōu)選地，步驟2)所述第一輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變 性40s，56°C退火30s，72°C延伸15s，共35個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述稀釋處 理，是利用ddH20稀釋10倍。
[0014] 優(yōu)選地，步驟3)所述第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變 性4〇8,56.8°0退火3〇8,72°0延伸1〇8，共15個循環(huán)，再721：延伸4111111，41：保溫。
[0015] 優(yōu)選地，步驟4)所述利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因 型突變進(jìn)行檢測，是根據(jù)目標(biāo)片段的GC含量的變化在不同熔解溫度出現(xiàn)吸收峰的位置判 定，突變株的GC含量下降，熔解溫度降低，吸收峰在左側(cè)；野生型GC含量增加，熔解溫度升 高，吸收峰在右側(cè)；雜合型的GC含量居中，吸收峰位于中間溫度。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)提取待鑒定材料的DNA ;
[0018] 2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引 物進(jìn)行第一輪PCR巢式擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56°C退火30s， 72°C延伸15s，共35個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述稀釋處理，是利用ddH20稀釋 10倍；
[0019] 3)以步驟2)中稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 5所述序 列為引物進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56.8°C退 火30s，72°C延伸10s，共15個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，擴(kuò)增結(jié)束后獲得第二輪擴(kuò) 增產(chǎn)物；
[0020] 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型突變進(jìn)行檢測，并將所得熔解曲線與野 生型和雜合型樣品的熔解曲線進(jìn)行對比，當(dāng)待測樣品的熔解溫度降低，熔解曲線位于野生 型和雜合型樣品的左側(cè)時，該待測樣品即為B1型突變株。
[0021] 所述任一方法用于大豆的遺傳育種。
[0022] 利用所述引物組制備的檢測試劑盒。
[0023] 所述試劑盒用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變體。
[0024] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0025] 本發(fā)明是在克隆出的大豆脂肪酸脫氫酶合成基因GmFAD2_lB基礎(chǔ)上，通過比較高 油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列，首次發(fā)現(xiàn)了位于409bp處的 單堿基突變（C-G)，且該突變導(dǎo)致油酸含量變化。
[0026] 本發(fā)明針對B1突變位點(diǎn)開發(fā)了2套分子標(biāo)記（外部引物和內(nèi)部引物，引物如序列 表表1)進(jìn)行巢式PCR以確保擴(kuò)增的特異性，并利用高分辨率熔解曲線分析儀器進(jìn)行突變位 點(diǎn)檢測。本發(fā)明開發(fā)的分子標(biāo)記的使用方法為：首先利用外部引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，隨 后將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作模板，且以內(nèi)部引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移 至高分辨率熔解曲線分析儀器中進(jìn)行基因型突變檢測。該突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記開發(fā)對于高 油酸大豆的分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1為大豆脂肪酸脫氫