酶合成基因B1型突變位點。
[0028] 圖2為利用高分辨率熔解曲線分析儀器進行突變位點檢測結(jié)果；
[0029](其中，1，為B1突變型；2,為野生型；3,為雜合型）。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0031] 以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0032] 實施例1
[0033] 1)首先克隆出高油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列 (NCBIID為100805777,大豆基因組數(shù)據(jù)庫序列編號為：Glyma20g24530)，利用DNAstar軟 件進行序列比對首次發(fā)現(xiàn)了位于409bp處的單堿基突變（序列比對結(jié)果見附圖1)。同時， 提取待測樣品的DNA。
[0034] 2)根據(jù)步驟1)中突變位點設(shè)計巢式PCR的外部上游引物B1-F和外部下游引物 B1-R(如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示），利用以待鑒定材料的基因組DNA作為模板進行 GmFAD2-lB突變位點的第一輪PCR，所采用的PCR反應(yīng)體系（表1)及擴增程序如下：
[0035] 表1第一輪PCR反應(yīng)的擴增體系
[0036]
[0037] PCR擴增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56°C退火30s，72°C延伸15s，共 35個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。
[0038] 3)根據(jù)步驟1)中突變位點設(shè)計巢式PCR的內(nèi)部上游引物B1-內(nèi)-BAY-F，B1-內(nèi)-F 和內(nèi)部下游引物B1-內(nèi)-R(如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 5所示），以步驟2)中第一輪所得 PCR產(chǎn)物稀釋10倍后為模板，進行第二輪保證特異性的PCR擴增，其中PCR反應(yīng)體系（表 2)及擴增條件如下：
[0040] 表2第二輪PCR擴增反應(yīng)體系
[0041] ?0?擴增條件為：94°0預(yù)變性4!^11，941：變性4〇8,56.81：退火3〇8,721：延伸1〇8， 共15個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。
[0042] 4)將步驟3)中第二輪PCR所得的PCR產(chǎn)物用20礦物油覆蓋成混合樣品，并將該 混合樣品轉(zhuǎn)移至高分辨率熔解曲線分析儀器專用96孔板中，進行基因型突變檢測。
[0043] 5)根據(jù)步驟4)的GmFAD-2-lB(大豆脂肪酸脫氫酶合成基因）B1型突變位點類型 檢測結(jié)果如附圖2所示。其中，曲線1(左峰）為A3型突變體，曲線2(右峰）為野生型，曲 線3(中間）為雜合型。
[0044] 雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動與修飾，因此，本發(fā)明的保 護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因BI型突變的引物組，其特征在于，核苷酸 如 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 5 所示。2. -種利用權(quán)利要求1所述引物組檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因Bl型突變的方 法，其特征在于，是以待測樣品的DNA為模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所述序列為 引物進行第一輪PCR擴增，稀釋擴增產(chǎn)物后，再以稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，以如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列為引物進行第二輪PCR擴增，最后利用高分辨率熔解曲線分析 儀器對第二輪擴增產(chǎn)物進行基因型突變檢測。3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 提取待鑒定材料的DNA ; 2) 以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所述序列為引物進行 第一輪PCR巢式擴增，獲得擴增產(chǎn)物后，進行稀釋處理； 3) 以步驟2)中稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，以如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列為 引物進行第二輪巢式PCR擴增，擴增結(jié)束后獲得第二輪擴增產(chǎn)物； 4) 利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分辨率 熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物的基因型突變進行檢測。4. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟2)所述第一輪巢式PCR擴增，擴增條件為： 94°〇預(yù)變性4!^11，941：變性4〇8,561：退火3〇8,721：延伸158，共35個循環(huán)，再721：延伸 4min，4°C保溫；所述稀釋處理，是利用ddH 20稀釋10倍。5. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)所述第二輪巢式PCR擴增，擴增條件為： 94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56. 8°C退火30s，72°C延伸10s，共15個循環(huán)，再72°C延伸 4min，4°C 保溫。6. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟4)所述利用高分辨率熔解曲線分析儀器對 第二輪擴增產(chǎn)物的基因型突變進行檢測，是根據(jù)目標(biāo)片段的GC含量的變化在不同熔解溫 度出現(xiàn)吸收峰的位置判定，突變株的GC含量下降，熔解溫度降低，吸收峰在左側(cè)；野生型GC 含量增加，熔解溫度升高，吸收峰在右側(cè)；雜合型的GC含量居中，吸收峰位于中間溫度。7. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 提取待鑒定材料的DNA ; 2) 以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所述序列為引物進行 第一輪PCR巢式擴增，擴增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56°C退火30s，72°C延 伸15s，共35個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述稀釋處理，是利用ddH 20稀釋10倍； 3) 以步驟2)中稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，以如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列 為引物進行第二輪巢式PCR擴增，擴增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56.8°C退火 30s，72°C延伸10s，共15個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，擴增結(jié)束后獲得第二輪擴增產(chǎn) 物； 4) 利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分辨率 熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物的基因型突變進行檢測，并將所得熔解曲線與野生型 和雜合型樣品的熔解曲線進行對比，當(dāng)待測樣品的熔解溫度降低，熔解曲線位于野生型和 雜合型樣品的左側(cè)時，該待測樣品即為Bl型突變株。8. 權(quán)利要求3-7所述任一方法，其特征在于，用于大豆的遺傳育種。9. 利用權(quán)利要求1所述引物組制備的檢測試劑盒。10. 權(quán)利要求9所述試劑盒，其特征在于，用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氫酶合成基因 Bl型突變體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組及應(yīng)用，屬于植物分子標(biāo)記開發(fā)和作物分子輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供引物組的核苷酸序列表如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。同時本發(fā)明還提供了一種利用上述引物組快速檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變位點的方法，該方法是以待測樣品的DNA為模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR擴增，稀釋擴增產(chǎn)物后，再以稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，以如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所述序列為引物進行第二輪PCR擴增，最后利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物進行基因型突變檢測。本發(fā)明所提供的引物和方法對于高油酸大豆的分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104962631
【申請?zhí)枴緾N201510386064
【發(fā)明人】任航, 南海洋, 張倩
【申請人】黑龍江富航農(nóng)業(yè)科技有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年6月30日