用于檢測表皮生長因子基因突變的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測表皮生長因子基因突變的引物、方 法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF)是一種由53個氨基酸殘基組成 的小肽，分子量6201Da，分子內(nèi)有6個半胱氨酸組成的二硫鍵，形成3個分子內(nèi)環(huán)型結(jié)構(gòu)，組 成生物活性所必須的受體結(jié)合區(qū)域。人的EGF主要由唾液腺、腎臟及十二指腸的Brunner 氏腺等合成和分泌，廣泛存在于血液、唾液、胃液、尿液、乳汁、羊水等體液中。EGF通過與 靶細(xì)胞膜上高親和細(xì)胞表面受體即表皮生長因子受體結(jié)合而發(fā)揮作用，參與多種細(xì)胞的生 長、增殖和分化。EGF基因定位于4q25染色體上，全長約llOkb，含有23個編碼外顯子。EGF 基因突變引起EGF功能缺陷，導(dǎo)致低鎂血癥4型的發(fā)生。另外，該基因的功能失調(diào)還與某些 癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。目前僅發(fā)現(xiàn)3種與疾病相關(guān)的EGF基因突變類型。
[0003] 對于EGF基因突變的檢測通常為針對某一個熱點突變進行檢測，尚未有關(guān)于利用 多個特異性引物對EGF基因多個突變同時進行測定的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測EGF基因突變的引物和試劑 盒。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種非診斷目的檢測EGF基因的全部編碼外顯子及外 顯子/內(nèi)含子交界區(qū)突變的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案： 一種檢測EGF基因突變的引物，包括擴增EGF基因23個編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子 交界區(qū)的引物，其引物序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 46所示，具體如下： EGF-P1-F:5' -CAGTGAAGTCAGCCAGAGCA -3' ；（SEQ ID N0.1) EGF-P1-R:5' -CCAAGCAATTAGCCAGGTGT -3' ；（SEQ ID N0.2) EGF-P2-F：5, - GTTGGTTGTCATTGGGAAGT -3? ； (SEQ ID NO. 3) EGF-P2-R:5' -CTATATTTGGCAGACACGCA -3' ；（SEQ ID N0.4) EGF-P3-F：5, - GGGTCAGAGGAGGTAAATGC -3 ? ； (SEQ ID NO. 5) EGF-P3-R：5, - CAAAAGAGGGCTTTGGTCTC -3 ? ； (SEQ ID NO. 6) EGF-P4-F：5, - AAACTTGCCCTGTGAAGGAG -3 ? ； (SEQ ID NO. 7) EGF-P4-R:5' -ACAGACGGTAAATCTGGAGC -3' ；（SEQ ID N0.8) EGF-P5-F：5, - TCTTCCCCATTTTCATCACA -3 ? ； (SEQ ID NO. 9) EGF-P5-R:5' -TGAATGGGTGGGAACTATGT -3' ；（SEQ ID NO. 10) EGF-P6-F:5' -GACTTATTTTACCCTTTGCT -3' ；（SEQ ID NO. 11) EGF-P6-R:5' -TCATAGCCACCTTAGAAACA -3' ；（SEQ ID N0.12) EGF-P7-F:5' -AATTTTCAGGCATAACCACA -3' ；（SEQ ID N0.13) EGF-P7-R:5' -CTCAAAGCCCTTGCTCATA -3' ；（SEQ ID N0.14) EGF-P8-F:5' -AGCCTGGGTGAAAGAGTGA -3' ；（SEQ ID NO. 15) EGF-P8-R:5' -AGTTCCAGACAACCACAGCA -3' ；（SEQ ID NO.16) EGF-P9-F:5' -CATCCTCTTGCCTGTCTTCA -3' ；（SEQ ID NO.17) EGF-P9-R:5' -AGTCTCCCATCCTCATCTCC -3' ；（SEQ ID NO.18) EGF-P10-F:5' -CAAGCTCTTAACACCCTGTA -3' ；（SEQ ID NO.19) EGF-P10-R:5' -TTGTTCAACTCCCACTTATG -3' ；（SEQ ID NO. 20) EGF-P11-F:5' -TGGGCTTATTGCTGCTACT -3' ；（SEQ ID NO. 21) EGF-P11-R:5' -GGTTTCTGGTTTTGGACACT -3' ；（SEQ ID N0.22) EGF-P12-F:5' -TTACTCAAGCCTATTTACTC -3' ；（SEQ ID N0.23) EGF-P12-R:5' -TGTCTCTATTCCATATTCAC -3' ；（SEQ ID N0.24) EGF-P13-F：5, - TTCCACCTTTCTCCTTCATG -3? ； (SEQ ID NO. 25) EGF-P13-R:5' -GAGGTGAAATTGGAGGGATA -3' ；（SEQ ID N0.26) EGF-P14-F:5' -TTCATCTTCAAACCCACTTG -3' ；（SEQ ID N0.27) EGF-P14-R:5' -TTGCCTGTAATAAGGAACTCA -3' ；（SEQ ID N0.28) EGF-P15-F:5' -TAGCAGGGTGAGGTTTACTA -3' ；（SEQ ID N0.29) EGF-P15-R:5' -CTTTCTCAGGCACATCATTC -3' ；（SEQ ID NO. 30) EGF-P16-F:5' -CAACCTCCTGATTCTCCTAC -3' ；（SEQ ID NO. 31) EGF-P16-R:5' -AATTCTTCCCCTTAATGACA -3' ；（SEQ ID N0.32) EGF-P17-F:5' -TAATCGGATAGGTGGGAACT -3' ；（SEQ ID N0.33) EGF-P17-R:5' -ATCCTGTCTTCCCTCTGCT -3' ；（SEQ ID N0.34) EGF-P18-F:5' -CTCCTCTTCCAAAGGCTGTC -3' ；（SEQ ID NO. 35) EGF-P18-R:5' -TAGACCACCCACCAACCTAC -3' ；（SEQ ID N0.36) EGF-P19-F:5' -AATACTGAGCCCAAAGGAAG -3' ；（SEQ ID N0.37) EGF-P19-R:5' -CCAGAAACAGATCACGGATG -3' ；（SEQ ID N0.38) EGF-P20-F:5' -ATCCCAGAGCAAACAGACGA -3' ；（SEQ ID N0.39) EGF-P20-R:5' -ACACGGAGTCTCGCTCTATC -3' ；（SEQ ID NO. 40) EGF-P21-F:5' -ACACCCTCTACCTCACAGAA -3' ；（SEQ ID NO. 41) EGF-P21-R:5' -ACTTGGCTAACACTGACACC -3' ；（SEQ ID N0.42) EGF-P22-F:5' -GCCTTTCTTCTGACTTTCAC -3' ；（SEQ ID N0.43) EGF-P22-R:5' -ACAGCCCAGCTATTCACATA -3' ；（SEQ ID N0.44) EGF-P23-F:5' -ACCGTTTAGGGTCTGTCTTG -3' ；（SEQ ID NO. 45) EGF-P23-R:5' -CCAGGCATTGAGTAGGTGAT -3' ；（SEQ ID N0.46) 其中，F(xiàn)為正向引物，R為反向引物。
[0007] EGF基因外顯子較多。本發(fā)明通過對引物互補、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物交聯(lián)等引物二級結(jié) 構(gòu)進行了精確的分析，將EGF基因23個編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)分別設(shè)計二對 引物，根據(jù)PCR擴增結(jié)果分別擇優(yōu)選取一對引物，分別如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 46所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種檢測EGF基因突變的試劑盒，該試劑盒中含有擴增EGF基因 23個編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)的引物。
[0009] 本發(fā)明所述的試劑盒還包括用于PCR擴增反應(yīng)的酶和試劑。
[0010] 用于PCR擴增反應(yīng)的酶和試劑包括Taq酶、dNTP、10XPCR緩沖液和雙蒸水。
[0011] 進一步的，所述試劑盒中還包括用于提取樣品DNA的試劑。
[0012] 本發(fā)明還提供非診斷目的檢測檢測EGF基因的全部編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子 交界區(qū)突變的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測樣本DNA; (2) 以樣本DNA為模板，用擴增EGF基因23個編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)的 引物進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； (3) 采用測序引物對擴增產(chǎn)物進行測序擴增，得到測序擴增產(chǎn)物； (4) 對測序擴增產(chǎn)物進行測序，并與數(shù)據(jù)庫中正常的EGF基因序列進行比對，從而確定 EGF基因的突變位點。
[0013] 步驟（2)中，PCR擴增的條件為：94°C預(yù)變性3min，94°C變性35 s，退火35s， 特異性擴增引物的退火溫度為49°C-57°C，72°C延伸50 s，共30個循環(huán)；最后72°C延伸 5min〇
[0014] 步驟（3)中，所述測序引物為PCR擴增引物對中的正向引物。
[0015] 步驟（3)中，測序擴增反應(yīng)的條件是：95°C預(yù)變性120s，95°C變性30 s，50°C退 火10s，60°C延伸120 s，共25個循環(huán)。
[0016] 測序擴增反應(yīng)體系采用10ul，具體組成為：DNA模板1 yL、引物(正、反向)各1 yL、 BDT 2 y L、雙蒸水補足至總體積10 y L。
[0017] 步驟（4)中，測序的方法為Sanger法。
[0018] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中僅對熱點突變進行檢測的局限性，通過設(shè)計特異的擴增引物 即可對EGF基因的全部編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)進行捕獲，一次性的將多個潛 在的突變位點檢測出來。
【附圖說明】
[0019] 圖1A為EGF基因1~17編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖； 其中，M泳道：DNA marker，1~17泳道：分別為EGF基因1~17編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子 交界區(qū)。
[0020] 圖1B為EGF基因18~23編碼外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)PCR擴增產(chǎn)物電泳 圖；其中，M泳道：DNA marker，18~23泳道：分別為EGF基因18~23編碼外顯子及外顯子/ 內(nèi)含子交界區(qū)。
[0021] 圖2A為EGF基因編碼外顯子13及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)測序的部分結(jié)果，圖的 上方為NCBI數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)EGF基因序列，其下行為檢測的樣本EGF基因序列；圖2A顯示： 在cDNA 2525位置，A突變?yōu)镚。
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