圖2B為EGF基因編碼外顯子23及外顯子/內含子交界區(qū)測序的部分結果，圖的 上方為NCBI數(shù)據(jù)庫中標準EGF基因序列，其下行為檢測的樣本EGF基因序列；圖2B顯示： 在cDNA 3859位置插入C。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解 釋本發(fā)明，并不對其內容進行限定。
[0024] 下面實施例中所用一些材料和試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。
[0025] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)的條件，例如Sambrook等的 《分子克?。簩嶒炇沂謨浴罚∟ew York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中 所述條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件進行操作。
[0026] 實施例1 :特異性擴增引物的設計 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中EGF正常基因的參考序列設計特異性擴增引物，該特異性擴增引物 應滿足以下條件： (1) 產(chǎn)物不能形成二級結構、堿基要隨機分布，引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補； (2) 所有PCR片段正反向引物退火溫度相差不超過5°C，各產(chǎn)物退火溫度在48°C -58°C 之間，保證擴增的特異性和穩(wěn)定性； (3) PCR擴增引物的正向擴增引物即為用于測序擴增的引物，長度在18-22bp之間。
[0027] 本發(fā)明設計的特異性擴增引物如表1所示。
[0028] 實施例2 :樣本DNA提取 本發(fā)明所用的陽性樣本取自山東的受試者，經(jīng)醫(yī)院確診為低鎂血癥4型，經(jīng)受試者同 意，取其血液樣本。
[0029] 采用Gentra Puregene血液DNA抽提試劑盒（Qiagen，德國），按照說明書的要求提 取血液基因組DNA，具體步驟如下： (1) 取紅細胞裂解液900 y L，置入1. 5mL的EP管中； (2) 在上述EP管中加入全血300 y L，上下顛倒混勾，室溫下溫育10min，以使紅細胞裂 解，注意溫育期間至少上下顛倒混合一次； (3) 室溫下13200Xg離心20s，用吸頭移棄大部分上清液(注意在管內留約 20 y L~30 y L左右的上清液）； (4) 旋渦器震蕩上管，使細胞懸浮于殘液中，以利于下一步的白細胞裂解； (5) 向上管中加入白細胞裂解液300 yL，用吸頭上下抽吸，使細胞裂解； (6) 室溫下，加入蛋白質丨幾淀液100 y L，旋禍器尚速下震湯20s，以混合； (7) 4°C下13200Xg離心3 min，沉淀的蛋白質為致密的、黑褐色。如無蛋白質沉淀，需 重復上一步，并在冰上溫育5 min，再重復該步； (8) 取含DNA的上清液放入新的EP管中，加入100%異丙醇（2-propanol) 300 y L，輕 輕上下顛倒50次，以混勻； (9) 4°C下13200Xg離心1 min，DNA會形成小的白色沉淀； (10) 移棄上清液，在吸干紙上短暫吸干EP管，加70%乙醇300 y L，輕輕上下顛倒數(shù)次， 以洗滌DNA沉淀； (11) 4°C下13200Xg離心1 min，仔細倒掉乙醇，由于DNA沉淀松軟，故倒乙醇時要慢 慢進行； (12) 倒置放置離心管于吸干紙，空氣干燥10~15 min ; (13)加入DNA溶解液50 y L，65°C溫育lh和/或室溫過夜，如有可能輕彈EP管，以促 進DNA溶解； 根據(jù)以上步驟可得出50 y L DNA樣品。
[0030] 實施例3 :PCR擴增 利用本實施例1中設計的特異性擴增引物，以樣本DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴 增的反應體系采用50yL,具體組成為：DNA模板3yL、引物（正、反向）各2yL、Taq酶 0? 4 y L、dNTP 4 y L、10XPCR緩沖液5 y L、雙蒸水補足至總體積50 y L。
[0031] PCR擴增條件為：94°C預變性3min，94°C變性35 s，退火35s，特異性擴增引物 的退火溫度為49°C-57°C，72°C延伸50 s，共30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0032] 對特異性擴增引物的退火溫度進行考察和優(yōu)化，優(yōu)化得到的各特異性擴增引物的 退火溫度見表1。
[0033] 表1. EGF基因23個編碼外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)特異性擴增引物及退火 溫度
實施例4 :凝膠電泳檢測 對實施例3中PCR擴增后的產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，檢測擴增出的片段是否為需要的 目的片段的大小，Marker采用Marker II (天根生化科技[北京]有限公司），電泳采用的是 2%瓊脂糖凝膠，電泳條件：90V，40分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果如圖1A、圖1B所示。圖 1A、圖1B顯示了 EGF基因23個編碼外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)擴增產(chǎn)物，根據(jù)Marker (Marker II，天根生化科技[北京]有限公司）的比對，可以確定23個條帶的大小，分別是 227bp~784bp，與預測結果一致。
[0034] 實施例5 :PCR擴增產(chǎn)物的切膠純化 對實施例3中PCR擴增出的產(chǎn)物凝膠電泳后，在紫外燈下切取目的條帶，采用瓊脂糖凝 膠回收試劑盒（天根生化科技[北京]有限公司）將切取得到的凝膠回收純化，示例性的 步驟如下：（1)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分）放入干凈 的離心管中，稱取重量。
[0035] (2)柱平衡步驟：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 y 1平衡液 BL，12,000 rpm (~13,400X g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集 管中。
[0036] (3)向膠塊中加入等倍體積溶液PN (如果凝膠重為0. 1 g，其體積可視為100 yL， 則加入100 y L PN溶液)，50°C水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分 溶解。
[0037] (4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 2 min，12,000 rpm (~13,400X g )離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2 放入收集管中。 (5) 向吸附柱CA2中加入600 yL漂洗液PW(使用前加入無水乙醇)，12, 000 rpm (~13,400X g )離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。 (6) 重復操作步驟（5)。
[0038] (7)將吸附柱0厶2放回收集管中，12,000印111(~13,400\8)離心2 111111，盡量 除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響 下一步的實驗。 (8)將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30 y L洗脫緩沖 液 EB，室溫放置 2 min。12,000 rpm (~13,400X g)離心 2 min 收集 DNA 溶液。
[0039] 根據(jù)以上步驟可得出30 y L純化PCR擴增產(chǎn)物樣品。
[0040] 實施例6:測序擴增產(chǎn)物的制備 采用測序引物對實施例5中純化的PCR產(chǎn)物進行測序擴增，得到測序擴增產(chǎn)物。測序 引物為表1中的正向引物。
[0041] 測序擴增反應的條件是：95°C預變性120s，95°C變性30 s，50°C退火10s，60°C延 伸120 s，共25個循環(huán)。
[0042] 測序擴增反應體系采用10ul，具體組成為：DNA模板1 yL、引物(正、反向)各1 yL、 BDT 2 y L、雙蒸水補足至總體積10 y L。
[0043] 將測序擴增產(chǎn)物進行切膠回收純化，示例性的步驟與實施例5相同。
[0044] 實施例7 :在ABI3730測序儀上進行擴測序 使用ABI3730測序儀對實施例6純化的測序擴增產(chǎn)物進行測序。示例性的測序結果示 于圖2A和圖2B。
[0045] 圖2A和圖2B顯示了 EGF基因編碼外顯子13及外顯子/內含子交界區(qū)、編碼外顯 子23及外顯子/內含子交界區(qū)測序的部分結果，每個圖的最上方為NCBI數(shù)據(jù)庫中標準EGF 基因序列，其下行為為檢測樣本的EGF基因序列。圖2A顯示：在CDNA2525位置，A突變?yōu)镚 (2525A-G,A691A,雜合子，exon13)。圖2B顯示：在 cDNA3859位置插入 C(3859inC, Q1136fs/1153X,雜合子，exon23)〇
【主權項】
1. 一種檢測EGF基因突變的引物，其特征在于，包括擴增EGF基因23個編碼外顯子及 外顯子/內含子交界區(qū)的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I- SEQ ID NO. 46所示。2. -種檢測EGF基因突變的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含權利要求1所述的檢測 EGF基因突變的引物。3. 如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中還包括有：用于PCR擴增反應的 酶和試劑。4. 如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，用于PCR擴增反應的酶和試劑，包括Taq 酶、dNTP、IOXPCR緩沖液和雙蒸水。5. 如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中還包括用于提取樣品DNA的試 劑。6. -種非診斷目的檢測檢測EGF基因的全部編碼外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)突變 的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提取待測樣本DNA ; (2) 以樣本DNA為模板，用擴增EGF基因23個編碼外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)的 引物進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； (3) 采用測序引物對擴增產(chǎn)物進行測序擴增，得到測序擴增產(chǎn)物； (4) 對測序擴增產(chǎn)物進行測序，并與數(shù)據(jù)庫中正常的EGF基因序列進行比對，從而確定 EGF基因的突變位點。7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2沖，PCR擴增的條件為：94°C預變性 3min，94°C變性35 s，退火35s，特異性擴增引物的退火溫度為49°C_57°C，72°C延伸50 s，共30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，所述測序引物為PCR擴增引物 對中的正向引物。9. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（4)中，測序的方法為Sanger法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測EGF基因突變的引物，包括擴增EGF基因全部編碼外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)突變的引物，其引物序列如SEQ？ID？NO.1-？SEQ？ID？NO.46所示。本發(fā)明還公開了一種檢測EGF基因突變的試劑盒，以及一種非診斷目的檢測EGF基因突變的方法。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中僅對熱點突變進行檢測的局限性，通過設計特異的擴增引物即可對EGF基因的全部編碼外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)進行捕獲，一次性的將多個潛在的突變位點檢測出來。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105063216
【申請?zhí)枴緾N201510509757
【發(fā)明人】王廣新, 任廣芳, 張豪正, 馬燕燕
【申請人】濟南市兒童醫(yī)院
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月19日