檢測(cè)dnmt3a突變位點(diǎn)的方法、引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測(cè)DNMT3A第882位多態(tài)性突變的方法、引物和試劑盒。采用普通PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行測(cè)序，就可確定檢測(cè)急性粒細(xì)胞白血病（AML）患者體內(nèi)DNMT3A第882位多態(tài)性突變情況，本發(fā)明所述的方法、引物和試劑盒對(duì)于臨床上急性粒細(xì)胞白血?。ˋML）患者的治療和用藥有極大的指導(dǎo)意義。
【專利說明】檢測(cè)DNMT3A突變位點(diǎn)的方法、引物和試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及檢測(cè)DNMT3A第882位多態(tài)性突變的方法、引物和試劑盒。采用普通PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行測(cè)序，就可確定檢測(cè)急性粒細(xì)胞白血病(AML)患者體內(nèi)DNMT3A第882位多態(tài)性突變情況。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一類由造血祖細(xì)胞分化受阻及增殖異常而導(dǎo)致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來在AML中鑒定出了多種有重要預(yù)后價(jià)值的分子標(biāo)記，由基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡途徑的改變是AML的發(fā)病基礎(chǔ)。其中，新近的研究熱點(diǎn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A基因(DNA-methyltransferase 3 alpha,DNMT3A)編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A，在DNA甲基化過程中起催化作用，而現(xiàn)今普遍認(rèn)為DNA的甲基化水平與腫瘤的發(fā)生高度相關(guān)。DNMT3A基因的突變?cè)贏ML患者中高達(dá)20%，經(jīng)大量臨床隨訪研究提示該基因發(fā)生突變與預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)。它的突變形式也多種多樣，熱點(diǎn)突變是發(fā)生于編碼第第882位精氨酸的基因位點(diǎn)的錯(cuò)義突變，突變類型為R882位精氨酸變?yōu)榻M氨酸(R882H)、半胱氨酸(R882C)，脯氨酸(R882P)、絲氨酸(R882S)。
[0005]DNMT3A突變已成為新的預(yù)后指標(biāo)，有助于臨床醫(yī)師早期識(shí)別正常核型AML患者中的不同亞型，以便盡早地對(duì)患者進(jìn)行有效治療。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)DNMT3A第882位多態(tài)性突變的方法、引物和試劑盒。采用普通PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行測(cè)序，就可確定檢測(cè)急性粒細(xì)胞白血病(AML)患者體內(nèi)DNMT3A第882位多態(tài)性突變情況。
[0008]本發(fā)明提供檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的引物，所述引物包括一對(duì)擴(kuò)增引物，其堿基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG(SEQ ID N0.1)
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA(SEQ ID N0.2)。
[0009]進(jìn)一步地，所述引物還一對(duì)測(cè)序引物，其堿基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA。
[0010]進(jìn)一步地，所述多態(tài)性突變選自R882H、R882C、R882P和R882S。
[0011]本發(fā)明還提供一種檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的方法，所述方法包括:
(I)提取樣品中的基因組DNA ；(2)利用一對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)(I)中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)利用一對(duì)測(cè)序引物對(duì)(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列；
(4)將(3)中的基因序列與DNMT3A野生型基因序列進(jìn)行比較，確定所述多態(tài)性突變是否存在，其中
所述的一對(duì)擴(kuò)增引物，其堿基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA
所述的一對(duì)測(cè)序引物，其喊基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的試劑盒，所述試劑盒包括樣品基因組DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液、測(cè)序體系反應(yīng)液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。
[0012]進(jìn)一步地，所述檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液包括dNTPs、KOD FX DNA Polymerase和一對(duì)擴(kuò)增引物 DNMT3A882-F 和 DNMT3A882-R，其中
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTT ACACACACGCA
進(jìn)一步地，所述測(cè)序體系反應(yīng)液包括測(cè)序純化反應(yīng)液、EDTA、無水乙醇、75%乙醇、HIDI和一對(duì)測(cè)序引物DNMT3A882-F和DNMT3A882-R，其中DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAGDNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA
進(jìn)一步地，所述測(cè)序純化反應(yīng)液包括牛小腸堿性磷酸酶和外切酶I。
[0013]進(jìn)一步地，所述陽性對(duì)照品為含有DNMT3A序列的溶液，所述陰性對(duì)照品為無含有DNMT3A序列的溶液，所述空白對(duì)照品為生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0014]進(jìn)一步地，所述多態(tài)性突變選自R882H、R882C、R882P和R882S。
[0015]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增DNMT3A第882位多態(tài)性突變的引物。采用普通PCR技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定的擴(kuò)增體系。通過調(diào)整上下引物的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率達(dá)到最佳。
[0016]本發(fā)明具有特異性好、自動(dòng)化程度高、污染控制好等優(yōu)點(diǎn)。將反應(yīng)體系所需的引物進(jìn)行合理配比和優(yōu)化，使反應(yīng)條件達(dá)到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實(shí)驗(yàn)效率。
[0017]有益效果:本發(fā)明基于傳統(tǒng)PCR原理，提供一種用于檢測(cè)患者DNMT3A突變的方法，有助于快速、準(zhǔn)確地診斷患者DNMT3A第882位多態(tài)性突變的狀況，對(duì)于臨床上急性粒細(xì)胞白血病(AML)患者的治療和用藥有極大的指導(dǎo)意義。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1樣品1的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0020]圖2樣品2的檢測(cè)結(jié)果圖。[0021]圖3樣品3的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0022]圖4樣品4的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0023]圖5樣品5的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0024]【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0026]實(shí)施例1
一種檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括樣品基因組DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液、測(cè)序體系反應(yīng)液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。其中樣品基因組DNA抽提試劑購(gòu)自天根生物。
[0027]檢測(cè)體系PCR 反應(yīng)液包括:2XPCR Buffer ；dNTPs (2mM) ；K0D FX DNAPolymerase (IU/μ I);一對(duì)擴(kuò)增引物 DNMT3A882-F (10 μ Μ)和 DNMT3A882_R(10 μ Μ)。
[0028]測(cè)序體系包括:測(cè)序純化反應(yīng)液:牛小腸堿性磷酸酶(calf intestinal alkalinephosphatase, CIAP): 0.6U 和外切酶 1: 1.2U ;EDTA(125mmol);無水乙醇；75% 乙醇；HIDI(高度去離子甲酰胺);一對(duì)測(cè)序引物DNMT3A882-F (3.2 μ M)、DNMT3A882_R(3.2 μ M);以及Bigdye Terminator V3.1 (購(gòu)買自美國(guó) Applied Biosystems 公司)
檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液配制如表1所示。
[0029]
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的引物，其特征在于，所述引物包括一對(duì)擴(kuò)增引物，其堿基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA 。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括一對(duì)測(cè)序引物，其堿基序列為: DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述多態(tài)性突變選自R882H、R882C、R882P和 R882S。
4.一種檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提取樣品中的基因組DNA； (2)利用一對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)(I)中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)利用一對(duì)測(cè)序引物對(duì)(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列； (4)將(3)中的基因序列與DNMT3A野生型基因序列進(jìn)行比較，確定所述多態(tài)性突變是否存在，其中 所述的一對(duì)擴(kuò)增引物，其堿基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA
所述的一對(duì)測(cè)序引物，其喊基序列為:
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA 。
5.一種檢測(cè)樣品DNMT3A第882位多態(tài)性突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括樣品基因組DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液、測(cè)序體系反應(yīng)液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液包括 dNTPs、KOD FX DNA Polymerase 和一對(duì)擴(kuò)增引物 DNMT3A882-F 和 DNMT3A882-R，其中 DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述測(cè)序體系反應(yīng)液包括測(cè)序純化反應(yīng)液、EDTA、無水乙醇、75%乙醇、HIDI和一對(duì)測(cè)序引物DNMT3A882-F和DNMT3A882-R，其中
DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA。
8.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述測(cè)序純化反應(yīng)液包括牛小腸堿性磷酸酶和外切酶I。
9.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對(duì)照品為含有DNMT3A序列的溶液，所述陰性對(duì)照品為無含有DNMT3A序列的溶液，所述空白對(duì)照品為生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述多態(tài)性突變選自R882H、R882C、R882P 和 R882S。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103540659SQ201310459210
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】周曉犢, 李文靜, 王淑一 申請(qǐng)人:武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司