一種檢測(cè)cpt-ⅱ基因突變的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)CPT- II基因突變的引物、方法和試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉毒喊掠桐醜轉(zhuǎn)移酶 II (Carnitine Palmitoyltransferase-II，CPT-II)位于細(xì) 胞線粒體內(nèi)膜上，是脂肪酸氧化過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶之一，可逆地催化從酰基輔酶A將 ?；D(zhuǎn)移至L-肉毒堿的反應(yīng)，在長(zhǎng)鏈脂肪酸從線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜過(guò)程中起重 要作用。CPT- II基因全長(zhǎng)3090個(gè)核苷酸，定位于1ρ32染色體上，含有5個(gè)外顯子及4個(gè)內(nèi) 含子，編碼658個(gè)氨基酸肽鏈。CPT- II基因突變引起CPT- II功能缺陷，肉堿依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)功能將遭到破壞，導(dǎo)致脂酰肉堿不能有效地轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的脂酰輔酶A，故線粒體中長(zhǎng)鏈酰 基肉堿大量聚集，血中?；鈮A明顯增高，從而引起一系列生化紊亂。
[0003] 目前已發(fā)現(xiàn)90多種與疾病相關(guān)的CPT-II基因突變類型，其中大部分為錯(cuò)義突變， 也包括含兩種內(nèi)含子與外顯子交界區(qū)的剪切點(diǎn)突變。
[0004] 對(duì)于CPT- II基因突變的檢測(cè)通常為針對(duì)某一個(gè)熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，尚未有關(guān)于 利用多個(gè)特異性引物對(duì)CPT- II基因多個(gè)突變同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)CPT- II基因突變的引物和試 劑盒。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種非診斷目的檢測(cè)CPT- II基因的全部外顯子及外顯 子/內(nèi)含子交界區(qū)突變的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0008] 一種檢測(cè)CPT- II基因突變的引物，包括擴(kuò)增CPT- II基因5個(gè)外顯子及外顯子/ 內(nèi)含子交界區(qū)的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 16所示，具體如下：
[0009] CPT- II -Pl-F :5' - CACAGTCTCGCAAGGATGG-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] CPT- II -Pl-R:5' -GCGGAAACGGGTTCACTAG-3' ；（SEQ ID N0.2)
[0011] CPT- II -P2-F :5' - TTACACTGACCCTGCTTTCT-3' ；（SEQ ID NO. 3)
[0012] CPT- II -P2-R :5' - TTACATCTGCCACAACCCTA-3' ；（SEQ ID NO. 4)
[0013] CPT- II -P3-F :5' - TTTTAGGGCTATGCTGTTGG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0014] CPT- II -P3-R :5' - TTAGCAGGAAGTATGTCAGG-3' ；（SEQ ID NO. 6)
[0015] CPT- II -P4-1-F :5' -GTGGAGGACGCCTGTAATC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0016] CPT- II -P4-1-R :5' - ACGCATTGACCAGGTAGGC-3' ；（SEQ ID NO. 8)
[0017] CPT- II -P4-2-F :5' - CCGGTTTCTGAAGACACTCC-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0018] CPT- II -P4-2-R :5' - CCAGATGTCTCGGTTCTCAC-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0019] CPT- II -P4-3-F :5' - TCGGAAATCCAGGCACATC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0020] CPT- II -P4-3-R :5' - AGAGCCATCCTTGGCGATA-3' ；（SEQ ID NO. 12)
[0021] CPT- II -P4-4-F :5' - AAGATGGGAACATTGTGAGC-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0022] CPT- II -P4-4-R:5' -GATTTAGGCTTGCTTACCCA-3' ；（SEQ ID NO. 14)
[0023] CPT- II -P5-F :5' - AGGTTAGTCAGTTGGTGGTG-3' ；（SEQ ID NO. 15)
[0024] CPT- II -P5-R :5' - CCTGGGTTCAAGCAATTCTG-3' ；（SEQ ID NO. 16)
[0025] 其中，F(xiàn)為正向引物，R為反向引物。
[0026] CPT- II基因外顯子4較大，有1305個(gè)堿基，且該外顯子內(nèi)含有105個(gè)基因多態(tài)性， 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)比較困難。本發(fā)明通過(guò)對(duì)引物互補(bǔ)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物交聯(lián)等引物二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn) 行了精確的分析，將CPT- II基因外顯子4及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)分成四段，即4-1、4-2、 4-3、4-4,然后為每一段分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，分別如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 14所示。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CPT- II基因突變的試劑盒，該試劑盒中含有擴(kuò)增 CPT- II基因 5個(gè)外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)的引物。
[0028] 本發(fā)明所述的試劑盒還包括用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的酶和試劑。
[0029] 用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的酶和試劑包括Taq酶、dNTPUOXPCR緩沖液和雙蒸水。
[0030] 進(jìn)一步的，所述試劑盒中還包括用于提取樣品DNA的試劑。
[0031] 本發(fā)明還提供非診斷目的檢測(cè)檢測(cè)CPT- II基因的全部外顯子及外顯子/內(nèi)含子 交界區(qū)突變的方法，包括如下步驟：
[0032] (1)提取待測(cè)樣本DNA ;
[0033] (2)以樣本DNA為模板，用擴(kuò)增CPT- II基因 5個(gè)外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū) 的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0034] (3)采用測(cè)序引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序擴(kuò)增，得到測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0035] (4)對(duì)測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中正常的CPT- II基因序列進(jìn)行比對(duì)， 從而確定CPT- II基因的突變位點(diǎn)。
[0036] 步驟（2)中，PCR擴(kuò)增的條件為：94°C預(yù)變性3min，94°C變性35s，退火35s，特異性 擴(kuò)增引物的退火溫度為52. 8-57°C，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0037] 步驟（3)中，所述測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物對(duì)中的正向引物。
[0038] 步驟（3)中，測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)的條件是：95°C預(yù)變性120s，95°C變性30s，50°C退火 10s，60°C延伸120s，共25個(gè)循環(huán)。
[0039] 測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)體系采用IOul,具體組成為：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT2 μ L、雙蒸水補(bǔ)足至總體積10 μ L。
[0040] 步驟⑷中，測(cè)序的方法為Sanger法。
[0041] 本發(fā)明的有益效果：
[0042] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中僅對(duì)熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)的局限性，通過(guò)設(shè)計(jì)特異的擴(kuò)增 引物即可對(duì)CPT- II基因的全部外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)進(jìn)行捕獲，一次性的將多個(gè) 潛在的突變位點(diǎn)檢測(cè)出來(lái)。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1為CPT- II基因外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中， M泳道：DNA marker，l~8泳道：分別為CPT- II基因外顯子及交界區(qū)1、2、3、4-1、4-2、4-3、 4-4 和 5〇
[0044] 圖2Α為CPT- II基因外顯子4及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)4-3測(cè)序的部分結(jié)果，圖 的上方為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)CPT- II基因序列，其下行為檢測(cè)的樣本CPT- II基因序列；圖 2A顯示：在cDNA 1055位置，T突變?yōu)镚。
[0045] 圖2B為CPT- II基因外顯子4及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)4-4測(cè)序的部分結(jié)果，圖 的上方為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)CPT- II基因序列，其下行為檢測(cè)的樣本CPT- II基因序列；圖 2B顯示：在cDNA 1102位置，G突變?yōu)锳。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解 釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0047] 下面實(shí)施例中所用一些材料和試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
[0048] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)的條件，例如Sambrook等的 《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件進(jìn)行操作。
[0049] 實(shí)施例1 :特異性擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)
[0050] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中CPT- II正?；虻膮⒖夹蛄性O(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，該特異性 擴(kuò)增引物應(yīng)滿足以下條件：
[0051] (1)產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、堿基要隨機(jī)分布，引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互 補(bǔ)；
[0052] (2)所有PCR片段正反向引物退火溫度相差不超過(guò)5°C，各產(chǎn)物退火溫度在 52°C -58°C之間，保證擴(kuò)增的特異性和穩(wěn)定性；
[0053] (3)PCR擴(kuò)增引物的正向擴(kuò)增引物即為用于測(cè)序擴(kuò)增的引物，長(zhǎng)度在18-20bp之 間。
[0054] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物如表1所示。
[0055] 實(shí)施例2 :樣本DNA提取
[0056] 本發(fā)明所用的陽(yáng)性樣本取自山東的受試者，經(jīng)醫(yī)院確診為肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶II 缺乏癥，經(jīng)受試者同意，取其血液樣本。