快速鑒定番石榴實蠅的ss-pcr特異性引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及快速鑒定番石榴實蠅的SS-PCR特異性引 物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 番石植實繩隸屬雙翅目（Diptera)、實繩科（Tephritidae)、寡毛實繩亞科 (Dacinae)、寡毛實繩族（Dacini)、果實繩屬（Bactrocera)，目前主要分布在泰國、越南、緬 甸、尼泊爾、印度、巴基斯坦、斯里蘭卡、中國的云南、臺灣地區(qū)等地區(qū)。番石榴果實蠅寄主范 圍廣，危害性大，是果蔬生產(chǎn)中的重要害蟲，受到國內(nèi)外植物檢疫的普遍關(guān)注。近幾年，由于 國際貿(mào)易的日漸頻繁，合作領(lǐng)域不斷拓寬，在進出境的果蔬中經(jīng)常截獲番石榴實蠅等各種 不同的實蠅幼蟲、卵或蛹，甚至為頭、胸、翅、足等殘體；對于幼蟲的分類鑒定要比成蟲困難 得多，為了保證鑒定的準(zhǔn)確性通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲，而這需要花費較長的時間， 嚴(yán)重影響了果蔬進出口貿(mào)易的通關(guān)速度；而對于殘體則是無法對其進行正確的識別鑒定。 因此為了防止檢疫性實蠅傳入以及擴散，迫切需要開展關(guān)于實蠅的快速鑒定識別的技術(shù)。
[0003] 近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以解決的問題 且不受蟲態(tài)的影響，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)被運用于昆蟲的鑒定中，種特異引物 PCR(Species-specificPCR，SS_PCR)技術(shù)，即在設(shè)計目標(biāo)物種的引物時必須充分考慮引物 的特異性，使得在擴增未知模板時能夠根據(jù)目標(biāo)片段條帶的有無就能把目標(biāo)種類與其他種 類鑒別開來。本發(fā)明提供了一種采用特異性引物快速鑒定番石榴實蠅的方法，能夠準(zhǔn)確及 時對截獲的疑似番石榴實蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲及殘體等進行鑒定，建立了一種快速鑒定 番石榴實蠅的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供快速鑒定番石榴實蠅的SS-PCR特異性引物。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供快速鑒定番石榴實蠅的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供快速鑒定番石榴實蠅的方法。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的快速鑒定銹實蠅的SS-PCR特異性引物，引物序列為：
[0008] FR447 :3,ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5,；
[0009] FF463-486 :3'CACAACCGTTATTAACATGCG5'。
[0010] 選擇桔小實繩B.dorsalis，顏帶實繩B.cilifer，銹實繩B.rubigina，瑞麗果實繩 B.ruiliensis，瘤腔實繩B.tuberculata，楊桃實繩B.carambolae，瓜實繩B.cucurbitae， 辣椒實繩B.latifrons，南瓜實繩B.tau，具條實繩B.scutellata，近黑顏實繩B.parater， 黑膝實繩B.scutellaris，滇寡鬃實繩B.modica，何氏華實繩B.hochii，率實繩Carpomya vesuviana，瓜棍腹實繩Dacuslongicornis，腿端黑實繩B.atrifemur，黑顏實繩 B.diaphora，五指山實繩B.wuzhishana作為陰性對照來證明本發(fā)明設(shè)計的引物的特異性， 大大縮短了銹實蠅的鑒定周期。
[0011] 上述引物對擴增得到的鑒定番石榴實蠅的特異性片段的序列為：番石榴實蠅 Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi),645bp：
[0012] 5 '-CACAACCGTTATTAACATGCGATCGACAGGAATTTCATTTGACCGAATACCTCTATTCGTTTGAGC AGTTGTATTAACAGCTTTATTACTTCTGTTATCACTACCAGTTTTAGCAGGAGCTATCACTATACTATTAACAGATC GAAACTTAAATACTTCCTTTTTTGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCTATTCTCTACCAACACTTATTTTGATTCTTT GGACACCCAGAAGTTTACATTTTAATTTTACCAGGATTCGGAATAATTTCTCATATTATTAGTCAAGAATCAGGAAA GAAGGAAACATTCGGATCTTTAGGAATAATTTATGCTATAATAGCAATTGGTCTCTTAGGATTCATTGTATGAGCTC ATCATATATTTACTGTAGGAATAGATGTAGACACTCGAGCTTATTTCACTTCAGCTACAATAATTATTGCTGTACCC ACAGGTATTAAAATTTTTAGTTGACTAGCCACATTACACGGTACACAATTAAATTACTCCCCAGCCATATTATGAGC CCTAGGGTTTGTATTCCTATTTACAGTAGGAGGATTAACAGGAGTTGTCCTAGCTAATTCATCTGTAGACATTATTC TTCATGACACATATTATGTTGTTGCTCATTTCCACTACGT-3'
[0013] 本發(fā)明具體提供了一種采用特異性引物快速鑒定番石榴實蠅的方法，具體方法如 下：
[0014] (1)通過種特異引物PCR(SS-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出了 1對番石榴實 蠅的特異性引物FR447 :3'ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5' ；
[0015] FF463-486 :3 'CACAACCGTTATTAACATGCG5 '。
[0016] (2)采用SSR-PCR引物的種特異性的檢驗：選用桔小實蠅B.dorsalis，顏帶實蠅 B.cilifer，銹實繩B.rubigina，瑞麗果實繩B.ruiliensis，瘤腔實繩B.tuberculata，楊桃 實繩B.carambolae，瓜實繩B.cucurbitae，辣椒實繩B.latifrons，南瓜實繩B.tau，具條實 繩B.scutellata，近黑顏實繩B.parater，黑膝實繩B.scutellaris，滇寡鬃實繩B.modica， 何氏華實繩B.hochii，率實繩Carpomyavesuviana，瓜棍腹實繩Dacuslongicornis，腿端 黑實繩B.atrifemur，黑顏實繩B.diaphora，五指山實繩B.wuzhishana作為陰性對照，番石 榴實蠅為陽性對照，驗證番石榴實蠅特異性引物的種特異性。結(jié)果表明，僅番石榴實蠅在 645bp處有一條特異性擴增的條帶，陰性對照均無特異性目標(biāo)片段，從而證明該引物在實驗 涉及的這些實蠅種類范圍內(nèi)，能特異性的鑒定番石榴實蠅。
[0017] 一方面，引物的特異性是本實驗成功的關(guān)鍵，特異性片段要有足夠變異能夠?qū)⒉?同物種區(qū)分開。另一方面，當(dāng)口岸僅發(fā)現(xiàn)卵或是殘體時，即只能提取到微量DNA時，SS-PCR 檢測鑒定方法的靈敏度就至關(guān)重要了。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案具有較高的靈敏度，能檢測 到的DNA模板濃度可低至36. 24ng/uL，同時該SS-PCR特異性引物能夠穩(wěn)定區(qū)分近似物種， 因此，本發(fā)明的檢測鑒定方法在實際檢疫工作中也得到應(yīng)用和驗證。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明所建立的SS-PCR快速鑒定番石榴實蠅的方法具有快速簡便、特 異性尚、靈敏度尚等優(yōu)點，可以在8小時之內(nèi)完成鎊實繩的鑒定，能夠滿足口岸檢驗檢疫快 速通關(guān)的要求。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示引物FR447和FF463的種特異性驗證，M :100bpDNALadder，1 :番石榴 實繩 B. correcta，2 :桔小實繩 B. dorsalis，3 :顏帶實繩 B. cilifer，4 :銹實繩 B. rubigina， 5 :瑞麗果實繩 B. ruiliensis，6 :瘤腔實繩 B. tuberculata，7 :楊桃實繩 B. carambolae， 8:瓜實繩B. cucurbitae，9 :辣椒實繩B. latifrons，10 :南瓜實繩B. tau，11 :具條實繩 B. scutellata，12 :近黑顏實繩 B. parater，13 :黑膝實繩 B. scutellaris，14 :滇寡鬃實 繩 B. modica，15 :何氏華實繩 B. hochii，16 :率實繩 Carpomya vesuviana，17 :瓜棍腹實繩 Dacus longicornis，18 :腿端黑實繩 B. atrifemur，19 :黑顏實繩 B. diaphora，20 :五指山實 繩 B.wuzhishana，21 :空白對照 dd H20〇
[0020] 圖2顯示SS-PCR快速鑒定番石榴實蠅的應(yīng)用與驗證，M :100bp DNA Ladder，1-19 : 番石植實繩B. correcta，20 :空白對照dd H20。
[0021] 圖 3 顯示引物FR447 和 FF463 的靈敏度驗證，M :100bp