一種檢測(cè)水體中污染物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于污染物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)水體中污染物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)品是海洋和淡水漁業(yè)生產(chǎn)的動(dòng)植物的統(tǒng)稱，如魚類、蝦類、蟹類等。我國(guó)既是 水產(chǎn)品生產(chǎn)大國(guó)，同時(shí)也是消費(fèi)大國(guó)。水產(chǎn)品的質(zhì)量安全不僅關(guān)系著我國(guó)人民的生活健康， 也影響著水產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展，因此對(duì)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全檢測(cè)具有重要意義。隨著農(nóng)、獸藥的 濫用及環(huán)境污染的日益加劇，生物體持續(xù)暴露在多種污染物交叉的環(huán)境中，造成了其同時(shí) 遭受多種污染的現(xiàn)象。目前，對(duì)水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)是各種化學(xué)手段，但其只 能針對(duì)部分有毒有害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)被生物體吸收代謝轉(zhuǎn)化成的次級(jí)代謝產(chǎn)物無法 檢測(cè)，同時(shí)還可能由于漏檢某種有毒有害物質(zhì)而產(chǎn)生嚴(yán)重后果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)水體中污染物的方法，即采用動(dòng)物體內(nèi)谷胱甘肽硫 轉(zhuǎn)移酶（GSTs)的含量變化來檢測(cè)養(yǎng)殖水體中污染物的方法。
[0004] 本發(fā)明的方法，包括有如下的步驟：
[0005] 1)從待檢測(cè)水體中養(yǎng)殖的動(dòng)物組織中提取RNA，然后以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄 合成cDNA;
[0006] 2)用能擴(kuò)增谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因的引物對(duì)步驟1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行熒光定 量PCR檢測(cè)，
[0007] 3)通過對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量的變化進(jìn)行對(duì)比分析來確定養(yǎng)殖水體中 是否存在污染物。
[0008] 其中步驟2)中還用內(nèi)參引物對(duì)步驟1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)；
[0009] 所述的內(nèi)參引物，為能擴(kuò)增0 -actin的引物；
[0010] 所述的動(dòng)物組織，優(yōu)選為動(dòng)物的肝臟組織；
[0011] 所述的動(dòng)物，可以是魚類或貝類或其他水生無脊椎類；例如鰱魚或貽貝或章魚；
[0012] 所述的污染物，可以是農(nóng)獸藥、PAH、PCB、毒素、重金屬、環(huán)境內(nèi)分泌物。
[0013] 更具體的，所述的污染物為孔雀石綠、溴氰菊酯、多氯聯(lián)苯。
[0014] 本發(fā)明的方法相比目前的儀器化學(xué)方法，其檢出限更低，方法更加靈敏。且驗(yàn)證實(shí) 驗(yàn)室一致認(rèn)為該方法準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好；不使用有毒的有機(jī)溶劑和標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì) 操作人員的安全更有保障，同時(shí)減少了對(duì)環(huán)境的污染；縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)成本， 有效地提升了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。通過該項(xiàng)目的深入研究，可建立與國(guó)際接軌的食品安全 生物檢測(cè)體系。
【附圖說明】
[0015] 圖1 :基因的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖。由圖看出，擴(kuò)增曲線的整體平行性較好， 曲線拐點(diǎn)清楚，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象。各管的擴(kuò)增曲線平行性較好，表明擴(kuò)增效率相近，可 以用來進(jìn)行熒光定量PCR，分析基因的表達(dá)水平。
[0016] 圖2 :待測(cè)基因的熒光定量PCR溶解曲線圖。利用熒光定量PCR的方法測(cè)試了部 分基因的表達(dá)水平，并得到了這些基因的擴(kuò)增溶解曲線（如圖）。溶解曲線可以反映出實(shí)時(shí) 熒光定量PCR的擴(kuò)增特異性，如果每條溶解曲線只有一個(gè)峰，表明擴(kuò)增的特異性較好，如果 有兩個(gè)或者多個(gè)峰，則表明熒光定量PCR過程中存在非特異擴(kuò)增。由圖可知：這些基因的溶 解曲線只有一個(gè)峰，這表明基因的特異性擴(kuò)增效果較好，可以用來進(jìn)行熒光定量PCR，分析 基因的表達(dá)水平。
[0017] 圖3 :鰱魚在受到孔雀石綠污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨時(shí)間的變化圖。利用熒光定 量PCR方法測(cè)定了孔雀石綠對(duì)鰱魚谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)水平的影響?？疾炝丝兹?石綠在20 y g/L濃度時(shí)（實(shí)驗(yàn)組），不同作用時(shí)間對(duì)鰱魚GSTs表達(dá)量的影響，分別選取了 24h、48h、72h、96h、120h對(duì)實(shí)驗(yàn)組的GSTs的基因表達(dá)量進(jìn)行分析（對(duì)照組為同樣條件下不 添加孔雀石綠養(yǎng)殖的鰱魚，設(shè)置為100)。由圖可以看出：在受到孔雀石綠污染誘導(dǎo)后，鰱魚 在72h內(nèi)GSTs相對(duì)表達(dá)量急劇增多，可能與通過魚鰓吸收較快有關(guān)，而在72h之后表達(dá)量 增長(zhǎng)緩慢，相對(duì)平穩(wěn)，可能與孔雀石綠已經(jīng)降解有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)工作選取72h作為 考察時(shí)間。
[0018] 圖4 :鰱魚GSTs基因表達(dá)量隨孔雀石綠濃度變化的表達(dá)圖。經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知，水 中孔雀石綠在0. 03mg/L就就有較好的殺菌效果，因此，本實(shí)驗(yàn)組的給藥濃度依次設(shè)定為5、 10、20、30和40 y g/L。由圖可知，隨著給藥濃度的增大，鰱魚GSTs基因相對(duì)表達(dá)量也隨之明 顯增加，僅在5 y g/L濃度時(shí)其相對(duì)表達(dá)量就達(dá)1. 4倍，變化明顯；其在在30 y g/L和40 y g/ L濃度時(shí)相對(duì)表達(dá)量持平，說明酶的表達(dá)在高濃度孔雀石綠中可能會(huì)受到抑制。
[0019] 圖5 :鰱魚在受到溴氰菊酯污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨時(shí)間的變化圖。利用熒光定 量PCR方法測(cè)定了溴氰菊酯對(duì)鰱魚谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)水平的影響?？疾炝虽迩杈?酯在4mg/L濃度時(shí)對(duì)鰱魚不同作用時(shí)間（實(shí)驗(yàn)組），分別選取了 24h、48h、72h、96h、120h對(duì) 實(shí)驗(yàn)組的GSTs的基因表達(dá)量進(jìn)行分析（對(duì)照組為同樣條件下不添加溴氰菊酯養(yǎng)殖的鰱魚， 設(shè)置為100)。由圖可以看出：鰱魚在72h內(nèi)GSTs相對(duì)表達(dá)量急劇增多，而72h后相對(duì)平穩(wěn)， 可能是在溴氰菊酯的誘導(dǎo)下該酶和底物的結(jié)合開始趨于飽和；綜合其他因素，本實(shí)驗(yàn)選取 了 96h作為考察時(shí)間。
[0020] 圖6 :鰱魚GSTs基因表達(dá)量隨溴氰菊酯濃度變化的表達(dá)圖。經(jīng)查閱相關(guān)資料，實(shí) 驗(yàn)組在溴氰菊酯經(jīng)口給藥濃度l〇mg/L時(shí)，72h后，鰱魚死亡，本實(shí)驗(yàn)選定在養(yǎng)殖水體中溴氰 菊酯的給藥濃度分別選擇了 1、2、4、6和8mg/L。由圖看出：隨著給藥濃度的增大，鰱魚GSTs 基因相對(duì)表達(dá)量也隨之增加，并表現(xiàn)出對(duì)溴氰菊酯敏感，其GSTs基因相對(duì)表達(dá)量在8mg/L 時(shí)高了 2倍多；其在4mg/L、6mg/L和8mg/L濃度時(shí)表達(dá)量趨于平穩(wěn)，說明該酶在這個(gè)濃度下 開始趨于飽和。
[0021] 圖7 :鰱魚在受到多氯聯(lián)苯污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨時(shí)間的變化圖。利用熒光定 量PCR方法測(cè)定了 PCBs對(duì)鰱魚谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)水平的影響。考察了 PCBs在 1 y g/L濃度時(shí)（實(shí)驗(yàn)組），不同作用時(shí)間對(duì)鰱魚GSTs表達(dá)量的影響，分別選取了 24h、48h、 72h、96h、120h對(duì)實(shí)驗(yàn)組的GSTs的基因表達(dá)量進(jìn)行分析（對(duì)照組為同樣條件下不添加多氯 聯(lián)苯養(yǎng)殖的鰱魚，設(shè)置為100)。由圖可以看出：鰱魚在120h之內(nèi)未達(dá)到平穩(wěn)期，且一直呈 現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明PCBs -直在誘導(dǎo)GSTs表達(dá)，其在體內(nèi)蓄積并難以代謝，導(dǎo)致其GSTs酶一 直處于超表達(dá)狀態(tài)。在120h時(shí)，鰱魚GSTs相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了 2. 5倍之多。因此，本實(shí)驗(yàn)選 取了 120h作為考察時(shí)間。
[0022] 圖8 :鰱魚GSTs基因表達(dá)量隨孔雀石綠濃度變化的表達(dá)圖。經(jīng)過文獻(xiàn)查閱，魚的 LD5。為PCBs 1-10 y g/kg，96h ;5 y g/L，45d。本實(shí)驗(yàn)選定了在養(yǎng)殖水體中的給藥濃度分別 為0. 1、0. 5、1和2yg/L。由圖看出：隨著給藥濃度的增大，GSTs基因相對(duì)表達(dá)量也隨之增 加，其中，在PCBs濃度達(dá)2 yg/L時(shí)，鰱魚高了 2. 5倍；尤其值得一提的是，在PCBs濃度為 0. 1 y g/L時(shí)，鰱魚中GSTs基因相對(duì)表達(dá)量時(shí)就高了 1. 5倍，這說明鰱魚的GSTs對(duì)PCBs的 誘導(dǎo)反應(yīng)很敏感，GSTs非常適合作為一種生物標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)環(huán)境中PCBs存在情況。
[0023] 圖9 :貽貝在受到孔雀石綠污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨孔雀石綠濃度變化的表達(dá) 圖。
[0024] 圖10 :貽貝在受到溴氰菊酯污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨溴氰菊酯濃度變化的表達(dá) 圖。
[0025] 圖11 :貽貝在受到多氯聯(lián)苯污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨多氯聯(lián)苯濃度變化的表達(dá) 圖。
[0026] 圖12 :章魚在受到孔雀石綠污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨孔雀石綠濃度變化的表達(dá) 圖。
[0027] 圖13 :章魚在受到溴氰菊酯污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨溴氰菊酯濃度變化的表達(dá) 圖。
[0028] 圖14 :章魚在受到多氯聯(lián)苯污染時(shí)GSTs基因表達(dá)量隨多氯聯(lián)苯濃度變化的表達(dá) 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 1、從鰱魚肝臟組織中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
[0032] 材料：
[0033] 鰱魚肝臟；RNA提取試劑盒，RNApreppureTissueKit，Tiangen;反轉(zhuǎn)錄Prime ScriptRT試劑盒：TaKaRa，日本；移液器；一次性注射器；方盤；鑷子；手術(shù)剪；培養(yǎng)皿； 1. 5mL離心管。
[0034] 試劑材料
[0035] 95 % 的 RNase-free 乙醇；0? 1 % DEPC 處理水；SV RNA Lysis Buffer ;SV RNA dilution Buffer ；SV RNA Wash Solution ；Yellow core Buffer ；MnCl20. 09M ；DNase I ；SV DNase Stop Solution ;Nuclease_Free water ;瓊脂糖；10XTAE 電泳緩沖液（40m MTris， 20 mM NaAc，lmM EDTA PH 8. 0);載體緩沖液（0. 25%溴酚藍(lán)，30%甘油）；溴化乙錠水溶液 (10mg/mL) 〇
[0036] 由于RNA容易被降解，整個(gè)提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染。提取過程用到 的玻璃容器、EP管等樣品需要用0? 1% (v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC:diethypyrocarbonate) 浸泡處理。實(shí)驗(yàn)中用的微量移液器需要用75%的消毒酒精對(duì)表面進(jìn)行消毒，超凈臺(tái)也要擦 拭干凈，用消毒酒精消毒后，進(jìn)行紫外滅菌30min以上。提取過程中，要帶口罩和一次性PE 手套，實(shí)驗(yàn)過程需要勤換手套，嚴(yán)防RNA酶污染。
[0037] 肝臟中RNA的提取
[0038] 本次實(shí)驗(yàn)采用天根生化科技有限公司的RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑 盒，對(duì)鰱魚的肝臟RNA提取。
[0039] 具體步驟如下：
[0040] (1)分離鰱魚的肝臟組織，分別取50mg樣品于離心管中，加入175y 1 SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器將組織壓碎、反復(fù)抽打混勾。#
[0041](2)加 350 y 1 SV RNA Dilution Buffe