r (藍(lán)色），翻轉(zhuǎn)管子 3-4 次混勻，置 70°C水 浴 3min〇
[0042] (3)冰上冷卻1-2秒，14000rpm離心10min，上清液移入一新離心管。
[0043] ⑷加入200 yl 95%的乙醇，槍頭混勻。
[0044] (5)將上述混合液移入 Spin Basket Assembly，14000rpm 離心 lmin，棄濾液。
[0045](6)加入 600 u 1 SV RNA Wash Solution (with ethand added)，14000rpm 離心 lmin，棄濾液。
[0046] (7)在一新離心管中配制 DNase incubation mix :
[0047] Yellow Core Buffer 40 y 1
[0048] MnCl20. 09M 5 y 1
[0049] DNaseI5 y 1
[0050] (8)將上述50 y 1混合液直接加在Spin Basket的膜上，室溫（20-25°C )保育 15min〇
[0051] (9)加 200 y 1 SV DNase Stop Solution (with ethand added)至 Spin Basketl4000rpm，離心 lmin〇
[0052] (10)加 600 y 1 SV RNA Wash Solution，14000rpm 離心 lmin，棄濾液。
[0053] (11)加 250 y 1 SV RNA Wash Solution，14000rpm 離心 2min，將 Spin Basket 轉(zhuǎn) 移到一新離心管中。
[0054] (12)加 50 y 1 Nuclease-Free Water 至膜上，14000rpm離心 lmin，溶解RNA，-8CTC 保存。
[0055] (13)取5 y 1 RNA樣品，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。
[0056] 2、RNA質(zhì)量檢測
[0057] 瓊脂糖凝膠電泳測定
[0058] (1)將制膠用具用70%乙醇沖冼一遍，晾干備用。
[0059] (2)配制瓊脂糖凝膠：
[0060] 稱取0. 5g瓊脂糖，置干凈的100ml錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內(nèi)加熱使 瓊脂糖徹底溶化均勻。待膠涼至60-70°C，依次向其中加入9mL甲醛、5ml 10x MOPS緩沖液 和0. 5 y L溴化乙錠，混合均勻。
[0061] (3)準(zhǔn)備RNA樣品
[0062] 取DEPC處理過的500 y L小離心管，依次加入如下試劑：10x MOPS緩沖液2uL，甲 醛3. 5 y L，甲酰胺（去離子）10 y L，RNA樣品4. 5 y L，混勻。將離心管置于60°C水浴中保 10分鐘，再置冰上2分鐘。向管中加入3 y L上樣染料，混勻。
[0063] (3)上樣，電泳；電泳條件為0. 5XTAE電泳緩沖液、瓊脂糖1. 2%、150V，15min。因 為細(xì)胞中的RNA主要是rRNA，其含量為70 %~80 %，所以電泳檢測到的主要是rRNA條帶。 電泳結(jié)果表明rRNA條帶非常明顯，28S rRNA條帶和18S rRNA條帶亮度很清楚，而5. 8S rRNA條帶則相對較弱，且在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可 能是由mRNA和其它異型RNA組成。電泳檢測說明提取的RNA完整性較好。
[0064] 利用紫外分光光度計(jì)檢測了提取RNA的純度。一般來講，檢測RNA的純度可以通 過0D 26Qnni/0D2SQnni比值來反映，高質(zhì)量RNA的0D 26Qnni/0D2SQnni比值在1. 8~2. 1之間，而比值較 小則提取的RNA不純，表明有蛋白質(zhì)的污染。測定結(jié)果表明，提取的RNA的0D2Mnni/0D 2S(]nni為 1.9,表明RNA純度較好。
[0065] 3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0066] 1)以提取的mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄Prime Script RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0067] 構(gòu)建10 y L的反應(yīng)體系：
[0068]
[0069] 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
[0070] 反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7°C，15min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，85°C，5s滅活酶反應(yīng)。制備的cDNA放置 于-80°C冰箱保存。
[0071] 2)引物設(shè)計(jì)
[0072] 通過NCBI獲得不同來源鰱魚的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTs)基因序列，利用序列 分析軟件Clustal X進(jìn)行同源性比較，在同源性最高的區(qū)域設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增用引物，并利用 Primer Premier 5. 0生物軟件中的引物分析功能對所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的具體分析， 最終確定本發(fā)明擴(kuò)增用的引物組，并進(jìn)一步以其為核心制備檢測試劑盒。而且，為了防止假 陰性，選用基因表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小的0-actin基因作為內(nèi)參。P-actin基因 在個體各個生長階段的大多數(shù)幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)或變化很小，這種管家基因的表達(dá) 只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。所以，選擇 0-actin的基因作為熒光定量PCR的內(nèi)參。
[0073] 所設(shè)計(jì)的引物的序列信息如下：
[0074]GSTs 正向引物 LI :ccgttaggacgtcatgtaacgtc (SEQ ID NO: 1)、
[0075]GSTs 反向引物 L2ccaggtgagtgtgccttca(SEQ ID NO:2)、
[0076] 設(shè)計(jì)的內(nèi)參的序列信息如下：
[0077]LG1:gagaggtatcctgactctg(SEQ ID NO:3)、
[0078] LG2 :gacttagcactgtgtgtacc(SEQ ID NO:4)〇
[0079] 3)熒光定量PCR檢測引物的效果
[0080] 利用 SYBR Green PCR Master Mix (Tiangen)試劑盒，在 ABI 7500System 上進(jìn)行 熒光定量PCR。
[0081] 反應(yīng)體系為：
[0082]
[0083] 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
[0084] PCR反應(yīng)條件
[0085] 將配制好的P -actin內(nèi)參和待測樣品的PCR反應(yīng)溶液置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反 應(yīng)。每個樣品放3個孔，目的基因和內(nèi)參基因同時擴(kuò)增。采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR :95°C 預(yù)變性10min;95°C 30s、60°C 30s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，從而檢驗(yàn)退 火溫度是否適宜，產(chǎn)物中是否含有引物二聚體。得到的的擴(kuò)增曲線（圖1)。由圖1可以看 出，擴(kuò)增曲線的整體平行性較好，曲線拐點(diǎn)清楚，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象。各管的擴(kuò)增曲線平 行性較好，表明擴(kuò)增效率相近，可以用來進(jìn)行熒光定量PCR，分析基因的表達(dá)水平。
[0086] 擴(kuò)增溶解曲線如圖2所示。溶解曲線可以反映出實(shí)時熒光定量PCR的擴(kuò)增特異性， 如果每條溶解曲線只有一個峰，表明擴(kuò)增的特異性較好，如果有兩個或者多個峰，則表明熒 光定量PCR過程中存在非特異擴(kuò)增。由圖2可知：基因的溶解曲線的只有一個峰，這表明基 因的特異性擴(kuò)增效果較好，可以用來進(jìn)行熒光定量PCR，分析基因的表達(dá)水平。
[0087] 對引物的靈敏度進(jìn)行了檢測，具體步驟如下：
[0088] 1)將制備好的 cDNA 分別稀釋成 100ng/ y L、50ng/ y 1 和 10ng/ y L。
[0089] 2)構(gòu)建50 y L PCR反應(yīng)體系，分別以100ng、50ng和lOng為模板進(jìn)行反應(yīng)，電泳檢 測。
[0090] 3)電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)：cDNA模板濃度為100ng、50ng和10ng的電泳擴(kuò)增條帶清晰，且 電泳圖下方?jīng)]有二聚體出現(xiàn)，說明該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物靈敏度和特異性都很好，能夠很好的 滿足實(shí)驗(yàn)要求。
[0091] 實(shí)施例2對孔雀石綠的檢測
[0092] 孔雀石綠具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，在動物體內(nèi)能長期 殘留，通過代謝進(jìn)入人和動物的機(jī)體后，可以通過生物轉(zhuǎn)化，還原代謝成為脂溶性的無色孔 雀石綠，嚴(yán)重危害人類健康。許多國家都將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。1992年，加 拿大就禁止其作為漁場殺菌劑。美國規(guī)定在食用水產(chǎn)品中禁止檢出孔雀石綠和無色孔雀石 綠。2002年6月，歐盟頒布法令禁止在漁場中使用孔雀石綠。英國食品標(biāo)準(zhǔn)局認(rèn)為孔雀石 綠是一種對人體有極大副作用的化學(xué)制劑，任何魚類都不允許含有此類物質(zhì)，并且這種化 學(xué)物質(zhì)不應(yīng)該出現(xiàn)在任何食品中。2002年5月，我國農(nóng)業(yè)部已將孔雀石綠列入《食品動物 禁用的獸藥及其化合物清單》，孔雀石綠在水生食品動物中被禁止使用。
[0093] 將鰱魚暴露于5、10、20、30和40 yg/L不同濃度的孔雀石綠中，如圖3所示，其在 72h內(nèi)GSTs相對表達(dá)量急劇增多，而在72h之后表達(dá)量增長緩慢，相對平穩(wěn)，可能與孔雀石 綠已經(jīng)降解有關(guān)。
[0094] 在5 y g/L孔雀石綠濃度下，其GSTs基因表達(dá)已有顯著增高，隨著孔雀石綠濃度增 高，GSTs表達(dá)量也隨之增高（如圖4)，而在5 y g/L這個濃度下，采用液相色譜-質(zhì)譜的檢 測方法（《GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留的測定》）結(jié)果顯示，在同樣 條件下，鰱魚中并未檢測到孔雀石綠的存在，原因是孔雀石綠殘留在體內(nèi)的含量不足以檢 出（孔雀石綠的液相色譜-質(zhì)譜檢測限為0. lyg/L)。在20iig/L孔雀石綠濃度下，鰱魚肉 中孔雀石綠的含量檢測結(jié)果僅為4. 7ppb，而GSTs基因的表達(dá)顯著提高，增量接近2倍。由 此看見，針對水產(chǎn)品中的孔雀石綠來講，本發(fā)明方法的靈敏度要高于化學(xué)檢測方法。
[0095] 實(shí)施例3 :暴露于溴氰菊酯中的檢測
[0096] 以溴氰菊酯為代表的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對魚高毒，因此在我國有相關(guān)的規(guī)定，菊 酯類農(nóng)藥禁止在水田中使用，但菊酯類農(nóng)藥的使用，通過環(huán)境的轉(zhuǎn)移，水環(huán)境不可避免地受 到農(nóng)藥的影響和危害，對水產(chǎn)品造成污染。
[0097]將鰱魚暴露于1、2、4、6和8mg/L不同濃度的溴氰菊酯中，如圖5所示，其在72h內(nèi) GSTs相對表達(dá)量急劇增多，而在72h之后表達(dá)量增長緩慢，相對平穩(wěn)，可能在溴氰菊酯的誘 導(dǎo)下該酶和底物的結(jié)合開始趨于飽和。
[0098] 本例實(shí)施了其GSTs基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的情況