一種快速檢測細菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病原微生物的檢測,具體涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增技術(shù)(LAMP技術(shù))快速檢測細菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來,隨著亞胺培南等碳青酶烯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,細菌產(chǎn)生了一類能廣泛水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的金屬β-內(nèi)酰胺酶,產(chǎn)該類酶的細菌對β-內(nèi)酰胺類所有抗生素產(chǎn)生耐藥性,給臨床抗感染治療造成極大困難,而且目前產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌種類和數(shù)量在不斷增加,已報道的主要有/#產(chǎn)和KJ#兩種類型。而在廣東廣州,2005?2007年多家醫(yī)院曾出現(xiàn)產(chǎn)MP金屬酶銅綠假單胞菌的爆發(fā)流行,己成為臨床醫(yī)師面臨的棘手問題。因此,及時有效的監(jiān)控由/#/丐丨起的耐亞胺培南銅綠假單胞菌醫(yī)院感染勢在必行。
[0003]而傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和藥敏試驗法能在臨床上提供較好的價值,但因耗時長、繁瑣的操作過程、需要昂貴的儀器設(shè)備等不同的原因未能在臨床上大規(guī)模推廣使用。而本研宄針對MP設(shè)計的特異性擴增引物不單可以有效特異地擴增/#產(chǎn),從而建立起一種簡便、快速檢測細菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP試劑盒、以及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增技術(shù)(LAMP技術(shù))快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMPmm。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種用于快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組,其包括一對內(nèi)引物、一對外引物和一對環(huán)引物,核苷酸序列分別如下所示:
內(nèi)引物 1:5,_ TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3,(SEQ ID N0.1);內(nèi)引物 2:5’ - GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3,(SEQ ID N0.2);外引物 1:5,- TTCCATAGCGACAGCACG -3,(SEQ ID N0.3);
外引物 2:5,- ATTACCTAGACCGTAGGGTTT -3,(SEQ ID N0.4);
環(huán)引物 1:5’ - GTTAATTCAGATGCATACGTGG-3’ (SEQ ID N0.5);
環(huán)引物 2:5,- TATCCTGGTCCAGGGCAC -3,(SEQ ID N0.6)。
[0006]一種用于快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/猶LAMP試劑盒,其包括上述用于快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組。
[0007]作為優(yōu)選的,所述引物組中,內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物的摩爾比為6-8:1:3_4。
[0008]作為優(yōu)選的,所述試劑盒中還含有:DNA聚合酶,LAMP反應(yīng)液,顯色劑,陽性對照和陰性對照。
[0009]作為優(yōu)選的,所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
[0010]作為優(yōu)選的,所述LAMP反應(yīng)液含有:10 mM dNTP, 10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgSCVK溶液、5 mM甜菜堿,四者的體積比為6-8:4-5:2-3:8_10。
[0011]作為優(yōu)選的,所述顯色劑為SYBR GREEN I。
[0012]作為優(yōu)選的,所述陽性對照為含有細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/竹段的質(zhì)粒,所述細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/竹段如SEQ ID N0.7所示;所述陰性對照為DEPC 水。
[0013]一種快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺方法,包括如下步驟:
(1)提取待檢樣品DNA;
(2)利用上述用于快速檢測細菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組對待檢樣品DNA進行等溫擴增;
(3)結(jié)果判斷:在上述反應(yīng)管中加入1_2μ?顯色劑10XSYBRGREEN I,混勻后觀察反應(yīng)液的顏色,若呈現(xiàn)綠色則為/#產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因,橙色則為非/#/?因。
[0014]作為優(yōu)選的,等溫基因擴增反應(yīng)的25 μ L反應(yīng)體系含有:內(nèi)引物各8pmol/>L,外引物各I pmol/^L,環(huán)引物各4 pmol/^L,反應(yīng)液12.5μ?,DNA聚合酶8U,待檢DNA 1-100 ng,用滅菌去離子水補齊到25μ? ;等溫基因擴增反應(yīng)的條件為:60-65°C反應(yīng)55_65min。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:發(fā)明針對細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因TMc特異性設(shè)計了 6條引物,與目的基因的6個區(qū)域結(jié)合,具有較高的特異性,能準確地將細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/7與其他非細菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/3區(qū)分開來。另外,本發(fā)明的試劑盒方便快捷,能在較短的時間內(nèi)鑒別細菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#產(chǎn),不需要昂貴的儀器設(shè)備;靈敏度高;特異性好,適合現(xiàn)場檢測。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明對細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP以及對非細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因頂P的擴增結(jié)果(一:陰性樣品,+:細菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因頂P樣本);
圖 2 為實施例 3 的特異性驗證結(jié)果(l:DEPC,2:C7Z-#-l,3:/?E;4: SMB, 5: CMY-2,6: TEM, 7:1MP, 8: VIM and CMY-2);
圖3為實施例4的LAMP靈敏度實驗結(jié)果(a::本發(fā)明LAMP擴增的電泳結(jié)果;b:本發(fā)明LAMP擴增的顯色結(jié)果;其中,I為DEPC,2?9為含有細菌屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的 pBCSK 質(zhì)粒,濃度依次為 1.0XlO0、1.0XlO1U.0Χ102、1.0Χ103、1.0Χ104、1.0X 105、1.0Χ106、1.0X 17 拷貝 /yL)o
[0017]圖4為實施例4的常規(guī)PCR靈敏度實驗結(jié)果(其中,I為DEPC,2?9含有細菌屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/猶PBCSK質(zhì)粒,濃度依次為1.0X10° U-OXlO1U.0XlO2,1.0Χ103、1.0Χ104、1.0Χ105、1.0Χ106、1.0 X 17 拷貝 /yL)o
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明,但并不局限于此。
[0019]實施例1用于快速檢測細菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的LAMP試劑盒的建立
用于快速檢測細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的LAMP試劑盒,包括以下成分:
(I)特異性引物組;(2) DNA聚合酶;(3) LAMP反應(yīng)液;(4)顯色劑;(5)陽性對照和陰性對照。
[0020]( I)特異性引物的設(shè)計:
根據(jù)細菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因頂P (GenBank登錄號為:(NF812058)的特異性設(shè)計6條特異性引物,序列分別如下:
內(nèi)引物 1:5,_ TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3,(SEQ ID N0.1);內(nèi)引物 2:5’ - GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3,(SEQ ID N0.2);外引物 1:5,- TTCCATAGCGACAGCACG -3,(SEQ I