D N0.3)；
外引物 2:5，- ATTACCTAGACCGTAGGGTTT -3，(SEQ ID N0.4)；
環(huán)引物 1:5’ - GTTAATTCAGATGCATACGTGG-3’ (SEQ ID N0.5)；
環(huán)引物 2:5，- TATCCTGGTCCAGGGCAC -3，(SEQ ID N0.6)。
[0021](2) DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶；
(3)LAMP 反應(yīng)液含有:1mM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4,5mM 甜菜堿，四者的體積比為8:5:3:10o
[0022](4)顯示劑為 SYBR GREEN I。
[0023](5)陽性對(duì)照為含有細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因7?°片段(SEQ ID N0.7)的PBCSK質(zhì)粒(利用常規(guī)的質(zhì)粒構(gòu)建方法將SEQ ID N0.7插入pBCSK質(zhì)粒中得到)；陰性對(duì)照為DEPC水。
[0024]實(shí)施例2細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因7?°的快速檢測(cè)方法
利用實(shí)施例1的試劑盒快速檢測(cè)細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#產(chǎn)，具體步驟如下: (O提取模板DNA:采用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA ；
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):25yL反應(yīng)體系含有:內(nèi)引物1、2終濃度各為8pmol/KL，外引物1、2終濃度各為I pmol/^L，環(huán)引物1、2終濃度各為4 pmol/^L，反應(yīng)液12.5μ?，DNA聚合酶8U，待檢DNA 50 ng，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ?，然后加入20μ?的密封液，將上述反應(yīng)管于63°C反應(yīng)60min ；
(3)結(jié)果判斷:在上述反應(yīng)管中加入WL顯色劑IXSYBRGreen I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#產(chǎn)，橙色則為非細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP (如圖1)。
[0025]實(shí)施例3特異性實(shí)驗(yàn)
利用實(shí)施例2的方法分別對(duì)經(jīng)鑒定不含/#/?因的臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，DEPC水為陰性對(duì)照。
[0026]檢測(cè)結(jié)果見圖2。僅細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#尸管為綠色，其余管為橙色。結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒特異性高，能準(zhǔn)確地將/#/?其他非/#/3區(qū)分開來。
[0027]實(shí)施例4靈敏度實(shí)驗(yàn)
取陽性對(duì)照品(即構(gòu)建好的含有細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#產(chǎn)片段(SEQID N0.7)的pBCSK質(zhì)粒)，測(cè)定其濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，按照10倍的濃度梯度稀釋，選取1.0X 10°?1.0X 10 7拷貝/ μ L的濃度作為樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別用本發(fā)明的檢測(cè)方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0028]常規(guī)PCR檢測(cè)方法所用的引物序列如下所示: blaIMP-F: CGCGGATCCATGAGCAAGTTATTTGTATT (SEQ ID N0.8) blaIMP-R: CCGGAATTCTTAATGTGCAGTGGTACTT (SEQ ID N0.9)
本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，本試劑盒對(duì)/#/?因的最低檢出限為:1.0XlO4 拷貝 /yL。
[0029]常規(guī)PCR方法的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。其最低檢出限為:1.0X 10 5拷貝/ μ L。
[0030]以上實(shí)施例表明，本發(fā)明的試劑盒具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高的特點(diǎn)，且不需要昂貴的儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場檢測(cè)。
[0031]以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組，其包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物和一對(duì)環(huán)引物，核苷酸序列分別如下所示:內(nèi)引物 1:5，_ TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3，(SEQ ID N0.1)；內(nèi)引物 2:5’ - GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5，- TTCCATAGCGACAGCACG -3，(SEQ ID N0.3)；外引物 2:5，- ATTACCTAGACCGTAGGGTTT -3，(SEQ ID N0.4)；環(huán)引物 1:5’ - GTTAATTCAGATGCATACGTGG-3’ (SEQ ID N0.5)；環(huán)引物 2:5，- TATCCTGGTCCAGGGCAC -3，(SEQ ID N0.6)。2.一種用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP試劑盒，其包括權(quán)利要求I所示的引物組。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LAMP試劑盒，其特征在于，所述引物組中，內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物的摩爾比為6-8:1:3-4。4.根據(jù)權(quán)利要求2所示的LAMP試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有:DNA聚合酶，LAMP反應(yīng)液，顯色劑，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LAMP試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為BstDNA聚合酶。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LAMP試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)液含有:10mMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150 mM MgSOjK溶液、5 mM甜菜堿，四者的體積比為6-8:4-5:2-3:8-10o7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LAMP試劑盒，其特征在于，所述顯色劑為SYBRGREEN I。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LAMP試劑盒，其特征在于，所述陽性對(duì)照為含有細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/竹段的質(zhì)粒，所述細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/竹段如SEQ ID N0.7所示；所述陰性對(duì)照為DEPC水。9.一種快速檢測(cè)細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺方法，包括如下步驟: (1)提取待檢樣品DNA； (2)利用權(quán)利要求1的引物組對(duì)待檢樣品DNA進(jìn)行等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)； (3)結(jié)果判斷:在上述反應(yīng)管中加入1_2μ?顯色劑10XSYBRGREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因7?°，橙色則為非/#/?因。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)的25μ L反應(yīng)體系含有:內(nèi)引物各8pmol/pL，外引物各I pmol/gL，環(huán)引物各4 pmol/gL，反應(yīng)液12.5PL，DNA聚合酶8U，待檢DNA I?100 ng，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ?;等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:60-65 °C 反應(yīng) 55-65min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的LAMP試劑盒及檢測(cè)方法。所述試劑盒中包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，分別如SEQ ID NO.1-6提取待檢細(xì)菌基因組DNA，采用六條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在60-65℃對(duì)DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，加入顯色劑觀察反應(yīng)管內(nèi)的顏色變化來判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、檢測(cè)簡便、適合現(xiàn)場檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104962626
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510353287
【發(fā)明人】田國寶, 黃曦, 鐘蘭蘭, 張雪飛
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年6月23日