一種浴場海水中致病性細菌的基因芯片檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種浴場海水中致病性細菌的基因芯片檢測 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 夏秋時節(jié)旅游旺季海濱浴場承受著超負荷的壓力，給浴場水質(zhì)帶來了嚴重的影 響，同時也增加了病原微生物的傳播機會。細菌是引發(fā)感染性疾病的主要病原體，在抗生素 濫用的選擇壓力下，海洋環(huán)境中出現(xiàn)了大量的耐藥細菌，給人類健康帶來了潛在且無法估 計的新威脅，因此，多種致病性細菌的同時、快速、靈敏、特異的診斷是有效預防感染性疾病 發(fā)生，控制其暴發(fā)性傳播的前提和關(guān)鍵。雖然PCR及其衍生技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)致病性細菌的快 速、靈敏診斷，但是一次只能同時檢測一種致病性細菌，與之相比，基因芯片技術(shù)具有高通 量、平行性、微型化、自動化等顯著優(yōu)點，該技術(shù)的出現(xiàn)為致病性細菌的分子診斷提供了有 力的技術(shù)支撐。
[0003]目前國內(nèi)外許多學者都已經(jīng)將基因芯片技術(shù)應用到臨床以及食品安全等多個研 宄領(lǐng)域。我國自1997年開始了解生物芯片技術(shù)，1998年正式進入芯片研宄，現(xiàn)全國已有20 多家科研機構(gòu)和公司從事生物芯片的研發(fā)。目前與致病性細菌檢測相關(guān)的基因芯片研宄獲 得長足進展，已申請的專利包括"食源性致病菌快速檢測基因芯片及其應用"、"炭疽菌診斷 基因芯片的制備及應用"、"泌尿生殖道炎癥病原體和耐藥性集成診斷基因芯片及方法"等 上百種。然而由于海水中雜質(zhì)較多、致病性細菌種類繁多，且檢測靶位易突變，給該方法的 應用帶來一系列困難，造成該方法尚未在海洋環(huán)境檢測領(lǐng)域得以應用。
[0004] 目前，基因芯片對應的探針靶定區(qū)域通常選擇致病性細菌的16SrDNA序列、23S rRNA序列和16SrRNA-23SrRNA基因。16SrDNA序列因具有高度保守性，已成為細菌種屬鑒 定最常用的序列，但由于其高度保守性，因而不能很好的鑒別相近種或同一種內(nèi)的不同菌 株；而23SrRNA序列目前被報道的比較少，我們常常無法獲取需要的序列；16SrRNA-23Sr RNA基因區(qū)間由于其可用于鑒別相近種，或同一種內(nèi)的差異，而被廣泛應用，但對于只有一 個或兩個操縱子拷貝的細菌而言，不能利用16SrRNA-23SrRNA的基因區(qū)間序列進行探針 的設(shè)計，因此，為保證其特異性，需要選擇合適的特異性的靶基因進行引物設(shè)計。
[0005]目前基因芯片對應的探針種類主要有兩種，一種是進行氨基修飾的長度在 20-40mer的探針，另一種是不進行氨基修飾的60-70mer的探針。以往的研宄多采用的是短 探針。短探針可用來檢測單個堿基的不同，提高檢測的特異性，需點制在醛基基片上；而長 探針不需要檢測到單個堿基的差異，當考慮到不同個體之間的核酸堿基多態(tài)性時，可選擇 設(shè)計此類探針，該類探針需點制在氨基基片上。與短探針相比，長探針具有更好的特異性和 均一的退火溫度（Tm值），被證明在靈敏度和特異度兩方面表現(xiàn)更佳，此外還能兼顧信號強 度，但是以往的研宄多采用短探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明以浴場海水中對人類危害較大的6種致病性細菌為研宄對象，旨在建立浴 場海水致病性細菌的基因芯片檢測方法，科學合理的確定其反應條件的最優(yōu)化，并克服海 水環(huán)境復雜的缺點，保證檢測的特異性。建立其基因芯片的檢測方法。本發(fā)明所采用的技 術(shù)方案是：
[0007] -種浴場海水中致病性細菌的基因芯片檢測方法，該檢測方法的步驟為：
[0008] 第一步：致病性細菌及其靶基因的確定。根據(jù)國內(nèi)外大量的文獻報道以及本研宄 前期大量的調(diào)查研宄為基礎(chǔ)，確立了浴場海水中常見的、對人類危害較大的6種致病性細 菌，分別為嗜水氣單胞菌、大腸桿菌〇157:H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、溶藻弧菌、金黃 色葡萄球菌。
[0009] 根據(jù)國內(nèi)外文獻確定上述各菌株的特異性靶基因。其特異性靶基因分別為： 嗜水氣單胞菌（A.hydrophila)的Ahal基因、大腸桿菌0157 :H7 (E.coli0157:H7)的 hlyA、fliC、rfbE基因、腸炎沙門氏菌（Salmonella)的invA和hilA基因、單增李斯特菌 (L.monocytogenes)的pic和hlyA基因、溶藻弧菌（V.alginolyticus)的hsp60 基因、金黃 色葡萄球菌（S.aureus)的tuf基因。
[0010] 第二步：6種浴場致病性細菌70-mer寡核苷酸探針及引物的設(shè)計。應用AllelelD 6. 0軟件設(shè)計特異基因的引物及寡核苷酸探針，并應用DNASTAR軟件對其進行評價。引物和 探針信息如表1和表2所示。
[0011] 表1各致病性細菌的引物序列及其Tm值
[0013]
[0014] 表2各致病性細菌的探針序列及其Tm值

[0017] 第三步：焚光標記PCR產(chǎn)物。PCR擴增采用20yL反應體系，
[0018] 1〇xPCR緩沖液(AMgCI2) 2.0(jL dNTPs(10mmol/L) 0.4|jL 上下游引物(10pmol/pL) ^ 0.5 |jL TaqDNA聚合酶（5U/mL) 0.2mL DNA模板 1|JL ddH20 15.4 mL
[0019] 1)取5 y L PCR產(chǎn)物至無菌潔凈的0. 2mL離心管中，作為模板；
[0020] 2)向每個樣品管加入一定濃度的帶有熒光素Cy3標記的隨機引物（9N)溶液 3yL，并補水至19yL，震蕩混勻，瞬時離心。在最佳探針濃度和最佳基因組濃度條件下， 進行Cy3-隨機引物濃度的確定，當Cy3-隨機引物濃度為0. 375yM時，能產(chǎn)生肉眼可見的 熒光。而當Cy3-隨機引物濃度為0. 190yM時，熒光度值< 1000,產(chǎn)生的熒光極弱，說明 Cy3-隨機引物的最低濃度至少可達到0. 375yM，為確保能產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號，本實驗過 程中采用的Cy3-隨機引物濃度為0. 75yM;
[0021] 3)將離心后的樣品管放入PCR儀，95°C變性3min，立即放置冰上3min;
[0022] 4)在冰上制備焚光標記反應體系Mix:5XKlenowBuffer2. 5uL，klenow酶 1yL,dNTP(2. 5mM)2. 5yL；
[0023] 5)將步驟3)樣品管瞬時離心，并向各管中加入6yL熒光標記反應體系Mix，震蕩 混勻，瞬時離心；
[0024] 6)將離心管放入PCR儀，進行熒光標記擴增，熒光標記反應程序為：37°C1.5h， 70°C10min〇
[0025] 7)程序結(jié)束后，將樣品置于冰上，然后進行芯片雜交。為確定最佳的紫外交聯(lián)時 間，在紫外照射能量為2400mJ條件下，分別照射0. 5h、lh、2h、3h、4h、5h、6h，紫外交聯(lián)lh時， 即可產(chǎn)生肉眼可見的熒光信號，熒光信號值為5808,而交聯(lián)0.5h時，熒光值為< 1000。因 此確定當紫外照射能量為2400mJ時，最低紫外交聯(lián)時間為lh，為確保實驗的能產(chǎn)生穩(wěn)定熒 光信號，本實驗采用的紫外交聯(lián)時間為2h;
[0026] 第四步：制備基因芯片。采用噴點式芯片點樣系統(tǒng)點樣儀，以及Nano-tip A070-401點樣針進行點樣。將一定濃度的探針與點樣液等體積混合，然后用移液槍將其混 合物加入384孔板，按照設(shè)定好的參數(shù)將探針點到氨基化玻片上，每個點重復三次。點樣 時要注意保持濕度為70%，點樣時除放芯片之外，還要放一張感應試紙（用于觀察點樣效 果）。點樣完畢后，將點好的芯片取出，關(guān)閉儀器。將點制好的芯片放入紫外燈下交聯(lián)一定 的時間，然后用0.5%的SDS沖洗2min，用離心機甩干后，放入4°C冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｍ?過設(shè)置探針濃度梯度，發(fā)現(xiàn)探針濃度為1UM到16yM都可以檢測到熒光信號，而探針濃度 為0. 5yM時，熒光度值< 500,熒光信號很微弱，因此我們確定探針的最小終濃度為1yM， 為確保實驗的經(jīng)濟合理且順利進行，實驗過程中我們采用能產(chǎn)生較強穩(wěn)定熒光信號的探針 濃度2yM;
[0027] 第五步：雜交。將雜交buffer放到50°C水浴鍋中預熱，然后配置20yL的雜交液：
[0028] 4X雜交緩沖液 5yL
[0029] 焚光標記產(chǎn)物15 yL
[0030] 雜交液配好后，95°C變性3min，立即放置冰上，然后放入沸水中煮沸2min后，立即 放入預冷的無水乙醇中l(wèi)min，用低速離心機將芯片甩干。然后將該芯片對應的感應試紙放 于芯片下面，按照感應試紙上矩陣的排列方式。避光條件下，用移液槍取15yL的熒光標記 產(chǎn)物和5yL的陽控混合均勻后加入芯片點樣區(qū)，然后蓋上蓋玻片，然后將此芯片放入65°C 水浴鍋中水浴2h或過夜；
[0031] 第六步：芯片清洗及掃描。取出上一步的芯片，用自來水沖洗半分鐘，再用蒸餾 水沖洗一次，然后分別用42°C預熱過的洗液I、II、III分別洗脫2min，洗液I是用10mL20XSSC(175. 3g氯化鈉，88. 2g檸檬酸鈉，加蒸餾水定容至1000mL，pH為7. 0)和4mL 10XSDS(10g二十烷基磺酸鈉加入雙蒸水100mL制成）加入186mL蒸餾水混勻制成；洗液 II是用2mL20XSSC加入198mL蒸餾水混勻制成；洗液III是用lmL20XSSC加入199mL蒸 餾水混勻制成，然后將芯片離心甩干。用生物芯片掃描儀掃描芯片，并輸出熒光值，然后用 軟件分析所得數(shù)據(jù)。
[0032] 本發(fā)明的探針分別根據(jù)嗜水氣單胞菌的Ahal基因、大腸桿菌0157 :H7的hlyA、 fliC、rfbE基因、腸炎沙門氏菌的invA、hilA基因、單增李斯特菌的plc、hlyA基因、溶藻弧 菌的hsp60基因和金黃色葡萄球菌tuf基因而設(shè)計的特異性的探針，每種致病性細菌設(shè)計 了 1-3條探針，其長度約為70-mer。
[0033] 鑒于現(xiàn)有探針技術(shù)存在的問題，在探針設(shè)計時采取了兩種措施：一、為保證物種的 特異性，每