一種用于同時檢測斑點熱群立克次體和莫氏立克次體的檢測試劑盒及引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測斑點熱群立克次體和莫氏立克次體用引物、探針及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑點熱群立克次體（SFGR)和莫氏立克次體（RM)它們引起的疾病分別稱為斑點熱 和地方性斑瘆傷寒。斑點熱的地理分布較廣泛，遍布于世界各大洲。斑點熱群立克次體的常 見傳播媒介為蜱，其次是螨、蚤。地方性斑瘆傷寒又稱鼠型斑瘆傷寒，由鼠蚤傳播，多散發(fā)， 癥狀較輕。地方性斑瘆傷寒的流行與當(dāng)?shù)氐氖蠡疾币约皽囟?、濕度適合于蚤的孳生密切 有關(guān)，易形成地方性爆發(fā)流行。
[0003] 立克次體病臨床表現(xiàn)一般缺乏特異性，如表現(xiàn)為不明原因的高熱、頭痛、全身酸 痛、食欲不振等，常常誤瘆為其它傳染病，確診主要依靠實驗室檢查，包括血清學(xué)檢測和病 原的分離與鑒定。特異性抗體的檢出一般在發(fā)病2周以后，所以血清學(xué)檢測不能用于立克 次體感染的早期診斷。由于大多數(shù)立克次體不能在人工培養(yǎng)基上生長，需要靠動物接種、細(xì) 胞培養(yǎng)等對立克次體病原進(jìn)行分離。立克次體病原分離操作復(fù)雜，費時費力且成功率很低。 因此立克次體的傳統(tǒng)檢測方法已逐漸被酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、PCR技術(shù)、芯片技術(shù)等現(xiàn)代檢測 方法所代替。如今，研宄的趨勢更是進(jìn)一步轉(zhuǎn)向了在一個檢測平臺上同時檢測多種致病菌， 以此縮短檢測周期、減少檢測成本。因此，能同時快速有效檢測多種病原微生物的高通量檢 測技術(shù)已成為臨床疾病檢測，國境口岸衛(wèi)生檢疫，公共安全等領(lǐng)域研宄的熱點。
[0004] 多重?zé)晒釶CR技術(shù)是在同一個反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增兩個或兩個以上的目標(biāo)基因 序列。多重?zé)晒釶CR技術(shù)可同時檢測多種病原，具有快速、簡便、準(zhǔn)確、特異的優(yōu)點，應(yīng)用前 景十分廣闊。
[0005] 本研宄著重研宄影響檢測鼠源性立克次體病多重?zé)晒釶CR技術(shù)方法的關(guān)鍵因素， 提出解決方案，促使形成技術(shù)升級的同時，形成產(chǎn)業(yè)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的同時檢測斑點 熱群立克次體和莫氏立克次體的核苷酸序列，包括引物和探針。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的檢測斑點熱群立 克次體和莫氏立克次體的檢測試劑盒。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了檢測斑點熱群立克次體的引物和探針，具體如下：
[0010] 通過序列比較，根據(jù)斑點熱群立克次體（Spottedfevergroup rickettsiae,SFGR)OmpB基因的序列（GenBank:EF219464)，在其保守區(qū) 1020-1090 位置設(shè) 計一對引物及一條探針：
[0011] 1)SFG正義引物（SFG-F)5,-TGACGITGGTACAGACGGTACT-3'（SEQIDNO:1);
[0012] 2)SFG反義引物（SFG-R)5,-TTGAGmTGGGTTAITGCAACTTTAGAA-3'（SEQIDNO: 2)；
[0013] 3)SFG探針（SFG-probe) 5' -FAM-CTGCCTTTAAAACAGC-3'-MGB(SEQIDNO:3)，該探 針的5'端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB;
[0014] 擴(kuò)增目的片段為71bp。
[0015] 通過序列比較，根據(jù)莫氏立克次體（Rickettsiamooseri,RM)0mpB基因的序列 (GenBank:KF241858)，在其保守區(qū)147-210位置設(shè)計一對引物及一條探針：
[0016] 4)RM正義引物（RM-F)5, -TGirGATGGTGCAGGAITTGA-3'（SEQIDNO:4);
[0017] 5)RM反義引物（RM-R)5, -TCTTCCTGTCGCTACAAAITCG-3'（SEQIDNO:5);
[0018]6)RM探針（RM-probe)5,-TET-CAAACTGGCGCTGGTGT-3'-MGB(SEQIDNO:6)，該探 針的5'端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)TET，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB;
[0019] 擴(kuò)增目的基因大小為64bp。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種檢測斑點熱群立克次體和莫氏立克次體的檢測試劑盒，由以 下組分組成：
[0021] 1)DNA提取試劑；通?？梢允褂蒙虡I(yè)購買的DNA提取試劑盒或按照常規(guī)方法來提 取DNA，所述的試劑盒例如DNA提取試劑盒（TIANampGenomicDNAKit，cat.noDP304);
[0022] 2)DNA標(biāo)準(zhǔn)品為：斑點熱群立克次體OmpB基因片段的陽性重組質(zhì)粒DNA;和莫氏 立克次體OmpB基因片段的陽性重組質(zhì)粒DNA;
[0023] 3)實時定量PCR反應(yīng)液，其包括：PCR反應(yīng)混合液，熒光定量PCR參比染料，檢測 斑點熱群立克次體的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測莫氏立克次體的正義引物、反義 引物和熒光探針，
[0024] 優(yōu)選為：2XPCR反應(yīng)混合液，IX熒光定量PCR參比染料，檢測斑點熱群立克次體 的正義引物〇. 2yM、反義引物0. 2yM和熒光探針0. 4yM，檢測莫氏立克次體的正義引物 0. 2yM、反義引物0. 2yM和熒光探針0. 4yM;
[0025] 進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)混合液（PremixExTaq?)，購自大連寶生物公司 (Takra)，貨號RR390A。所述引物和探針均委托大連寶生物公司合成。
[0026] 4)陰性對照：DEPC水；
[0027] 5)DEPC水；lmLx2管，自來水兩次蒸餾，經(jīng)過Millipore純水儀純化，電阻率大于 18. 0MQ.CM〇
[0028] 其中，檢測斑點熱群立克次體的正義引物為序列表SEQIDNo:1所示的核苷酸序 列，反義引物為序列表SEQIDNo:2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQIDNo:3所 示的核苷酸序列，其5'端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB;檢測莫氏立克次 體的正義引物為序列表SEQIDNo:4所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQIDNo:5 所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，其5'端標(biāo)記報告 熒光基團(tuán)TET，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種檢測斑點熱群立克次體和莫氏立克次體的檢測試劑盒的使 用方法：
[0030] 1.樣品采集、運送
[0031] 解剖鼠取其脾臟置于凍存管中，或?qū)z獲蜱蟲置于凍存管中，將凍存管置于干冰 或液氮中運送回實驗室。-70 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0032] 2.DNA提取
[0033] 按照TIANampGenomicDNAKit試劑盒提供的方法提取立克次體DNA，具體方法如 下：
[0034] (1)動物組織（脾組織用量應(yīng)少10mg)應(yīng)先打碎處理為細(xì)胞懸液，然后10,OOOrpm 離心lmin，倒盡上清，加200y1緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。
[0035] (2)加入20yIProteinaseK溶液，混勻，在56°C放置，直至組織溶解，簡短離心以 去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn)行下一步驟。
[0036] (3)加入200y1緩沖液GB，充分顛倒混勾，70°C放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離 心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0037] (4)加人200y1無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短 離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0038] (5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12,OOOrpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0039] (6)向吸附柱CB3中加入500y1緩沖液⑶（使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇），12,OOOrpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0040] (7)向吸附柱CB3中加入600y1漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇 12,OOOrpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0041] (8)重復(fù)操作步驟7。
[0042] (9)將吸附柱CB3放回收集管中，12,OOOrpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0043] (10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200y1洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12,OOOrpm離心2min，將溶液收集到離心管中。
[0044] 3.實時定量PCR反應(yīng)：
[0045] 96孔PCR板，第一排12孔作為標(biāo)準(zhǔn)曲線和陰性對照孔，其余為樣品檢測孔。
[0046] 反應(yīng)體系為20yL，見表1:
[0047] 表 1
[0048]
[0049] 其中熒光定量PCR參比染料為ROXReference Dye。
[0050] 所述的模板DNA，如果是制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用斑點熱群立克次體OmpB基因片段（SEQ IDNo:9)和莫氏立克次體OmpB基因片段（SEQIDNo:12)的陽性重組質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為 模板，濃度為lO^lO8,如果是樣品檢測，用鼠脾臟或蜱蟲提取的DNA為模板，陰性對照模板 為DEPC水，
[0051] 檢測條件為：在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95°C10分鐘， 然后經(jīng)過95°C15秒鐘，58°C60秒鐘40個循環(huán)。
[0052] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0053] 本方法在一個PCR管中同時檢測兩種立克次體，大大提高了檢測效率，并能做到 鑒別診斷兩種立克次體。
【具體實施方式】
[0054] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用的試驗材料，如無特殊 說明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購買得到。
[0055] 實施例1、試劑盒的組成
[0056] -、試劑盒的組成
[0057] 1)DNA提取試劑；天根公司的DNA提取試劑盒（TIANampGenomicDNAKit,cat.no DP304)；
[0058] 2) DNA標(biāo)準(zhǔn)品：斑點熱群立克次體OmpB基因片段的陽性重組質(zhì)粒DNA ;和莫氏立 克次體OmpB基因片段的陽性重組質(zhì)粒DNA ;
[0059]