檢測(cè)18種高危型hpv核酸的引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的探針，包括以下序列的探針：寡核苷酸序列SEQ ID No：1～15；寡核苷酸序列SEQ ID No：46；寡核苷酸序列SEQ ID No：49；寡核苷酸序列SEQ ID No：52；寡核苷酸序列SEQ ID No：55。本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的引物和試劑盒。本發(fā)明提供的檢測(cè)引物、探針與試劑盒在可對(duì)HPV16、18和58型進(jìn)行分型，可以更好的罹患宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的提示效果。
【專利說(shuō)明】
檢測(cè)18種高危型HPV核酸的引物、探針及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明設(shè)計(jì)核酸檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的引物、探針及 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] HPV是一種嗜上皮性病毒。根據(jù)HPV致癌風(fēng)險(xiǎn)性大小，可將引起高度宮頸上皮內(nèi)瘤 變（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)從而導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的HPV稱為高危型 HPV(high-risk HPVjR-HPVhSOCM年出版的《The Health Professional's HPV handbook》指出高危型 HPV 有 18 種，分別為 HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、 59、66、68、73、82。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)臨床主要的HPV檢測(cè)方法有熒光PCR法、雜交捕獲法、基因芯片法。現(xiàn)有熒 光PCR法產(chǎn)品有以下三大缺點(diǎn)：1、現(xiàn)有熒光定量PCR檢測(cè)試劑多數(shù)不對(duì)HPV16、HPV18分型。2、 現(xiàn)有可對(duì)HPV16、HPV18具體分型的熒光定量PCR專利不可實(shí)現(xiàn)同時(shí)區(qū)分中國(guó)人群宮頸癌樣 本中檢出率明顯較高的HPV58和實(shí)現(xiàn)對(duì)導(dǎo)致宮頸癌的18種HPV高危型(HPV16、18、26、31、33、 35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82)進(jìn)行檢測(cè)。3、現(xiàn)有可同時(shí)對(duì)冊(cè)￥16、冊(cè)￥18與 HPV58具體分型的熒光定量PCR檢測(cè)試劑均不能實(shí)現(xiàn)僅需單管檢測(cè)，致使檢測(cè)通量低且操作 繁瑣難以滿足對(duì)大規(guī)模篩查要求。
[0004] 而雜交捕獲法缺點(diǎn)是:無(wú)內(nèi)標(biāo)、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(DNA分解45min、DNA-RNA雜交60min、抗 體捕獲60min、化學(xué)發(fā)光30min、計(jì)算機(jī)判讀15min-次實(shí)驗(yàn)一般要5~6小時(shí)）、靈敏度過(guò)低 (3.5X105C〇pie S/mL)、操作復(fù)雜、檢測(cè)基因型少無(wú)法具體分型(僅13種高危型)且需要特定 昂貴的儀器，成本高，和其檢測(cè)外的高危型和低危型如HPV6、11等存在交叉反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)假 陽(yáng)性結(jié)果。PCR-反向點(diǎn)雜交法、液態(tài)芯片法等基因芯片法類產(chǎn)品雖然能對(duì)HPV具體分型，且 檢測(cè)基因型相對(duì)多，但其缺點(diǎn)是不能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，需要擴(kuò)增后產(chǎn)物分析操作，耗時(shí)長(zhǎng)(4h 以上）、易存在PCR產(chǎn)物污染、操作復(fù)雜、不能滿足臨床宮頸癌大量篩查的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種可具體區(qū)分HPV16、HPV18與HPV58的檢測(cè) 18種高危型HPV核酸的引物、探針及試劑盒。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸 的探針，包括以下序列的探針：與HPV26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、 56型、59型、66型、68型、73型和82型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No: 1~ 15;與HPV16型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID N〇:46;與HPV18型的基因序列 互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:49;與HPV58型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列 SEQIDNo:52;與人類β-actin基因的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQIDNo :55。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的引物，包括以下序列的引物：與 HPV26 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、59 型、66 型、68 型、73 型和 82 型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:16~45;與HPV16型的基因序列互補(bǔ)配 對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID N〇:47~48;與HPV18型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:50~51;與HPV58型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:53~54;與人類 β-actin基因的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQIDNo:56~57。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，包括反應(yīng)液，所述反應(yīng)液 包括檢測(cè)18種高危型HPV核酸的探針和引物，所述探針包括寡核苷酸序列SEQ ID No: 1~ 15、SEQ ID No:46、SEQ ID No:49、SEQ ID No:52和SEQ ID No:55,所述引物包括寡核苷酸 序列SEQ ID No:16~45、SEQ ID No:47~48、SEQ ID No:50~51、SEQ ID No:53~54和SEQ ID No:56~57〇
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0010] (1)本發(fā)明的檢測(cè)引物、探針與試劑盒能夠全面覆蓋國(guó)際公認(rèn)和宮頸癌密切相關(guān) 的 18 種高危型冊(cè)￥(冊(cè)￥16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型）， 同時(shí)對(duì)中國(guó)人群風(fēng)險(xiǎn)度最高的3種高危型HPV(HPV16、18和58型）分型，比現(xiàn)有試劑盒更好的 提示罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，更適合中國(guó)人群宮頸癌篩查；
[0011] (2)本發(fā)明的檢測(cè)方法只需要單一反應(yīng)管，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)1.5h，具有快速、簡(jiǎn)便 和高通量的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于大樣本檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的第一組15種高危型HPV在ABI Prism 7500上的檢測(cè)結(jié)果的 擴(kuò)增曲線；
[0013]圖2為本發(fā)明實(shí)施例的第二組HPV16在ABI Prism 7500上的檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線； [0014]圖3為本發(fā)明實(shí)施例的第三組HPV18在ABI Prism 7500上的檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線； [0015]圖4為本發(fā)明實(shí)施例的第四組HPV58在ABI Prism 7500上的檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線； [0016]圖5為本發(fā)明實(shí)施例的第五組人類β-actin基因在ABI Prism 7500上的檢測(cè)結(jié)果 的擴(kuò)增曲線；
[0017] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例的含第一組至第五組的DNA在ABI Prism 7500上的檢測(cè)結(jié)果 的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 并配合附圖詳予說(shuō)明。
[0019] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：設(shè)計(jì)出可檢測(cè)18種高危型HPV核酸且同時(shí)可具體區(qū)分 即￥16、即￥18與即￥58的引物和探針序列。
[0020] 請(qǐng)參閱圖1至圖6，本發(fā)明提供了基于Taqman探針?lè)ǖ膶?shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的15+3種 高危型HPV的檢測(cè)引物與探針，包括：
[0021] (1)具有僅與15種高危型冊(cè)￥即冊(cè)￥26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、59、66、68、 73、82的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸。其中SEQ ID No: 1~15為探針，SEQ ID No: 16~45 為引物。
[0022] (2)具有僅與HPV16的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸。其中，SEQ ID N〇:46為探針， SEQ ID No:47~48為引物。
[0023] (3)具有僅與HPV18的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸。其中，SEQ ID N〇:49為探針， SEQ ID No:50~51 為引物。
[0024] (4)具有僅與HPV58的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸。其中，SEQ ID N〇:52為探針， SEQ ID No:53~54為引物。
[0025] (5)具有僅人類β-actin基因的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸。其中，SEQ ID No: 55為探針，SEQ ID No:56~57為引物。
[0026] 其中，上述每組探針的5'端分別標(biāo)記最大發(fā)射光波長(zhǎng)為510~518nm、538~560nm、 563~583nm、600nm~610nm、640~670nm和705~715nm中的報(bào)告基團(tuán)的其中一種，并且每組 之間相互不同。同時(shí)，根據(jù)上述每組探針5'端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)的最大發(fā)射光波長(zhǎng)，在3'端對(duì)應(yīng) 標(biāo)記的泮滅基團(tuán)可在吸收光波長(zhǎng)為380~550nm、470~560nm、480~580nm、550~650nm和 620~730nm中進(jìn)行選擇。
[0027] 作為優(yōu)選方案，每組探針具體的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)按下表1選擇。表1為報(bào)告基 團(tuán)與對(duì)應(yīng)選擇的淬滅基團(tuán)的選擇列表。
[0028] 表 1
[0030] 作為最優(yōu)選方案，每組探針具體的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)按下表2選擇。表2為報(bào)告 基團(tuán)與對(duì)應(yīng)選擇的淬滅基團(tuán)的優(yōu)先選擇列表。
[0031] 表2
[0033] 本發(fā)明的具體探針和引物的排序與核酸序列如下表3。表3為本發(fā)明的檢測(cè)18種 HPV核酸的探針與引物的序列號(hào)、名稱及核酸序列的列表。
[0034] 表 3


[0038] 基于以上所述檢測(cè)15+3種高危型HPV核酸的引物與探針，本發(fā)明還提供了一種檢 測(cè)15+3種高危型人乳頭瘤病毒核酸的試劑盒。
[0039] 作為優(yōu)選方案，上述檢測(cè)15+3種高危型HPV的試劑盒包括PCR反應(yīng)液、酶(例如熱啟 動(dòng)酶）、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0040] 作為優(yōu)選方案，上述反應(yīng)液為l.lmL/管，共1管。包括上述檢測(cè)15+3種高危型HPV核 酸的引物與探針、10XPCR buffer、25mM MgCl2、25mM dN(U)TP、lU/yL UNG。引物濃度均為 100μM，用量均為2.5μL。探針濃度均為100μM，其中寡核苷酸序列為SEQIDNo:55的探針的 用量為〇.75yL，其余探針用量為l.SyLlOXPCR buffer用量為125yL，25mM MgCl2用量為 150yL，25mM dN(U)TP用量為10yL，lU/yL UNG用量為5yL，最后用純水補(bǔ)足至l.lmL。
[0041] 作為優(yōu)選方案，上述酶具備熱啟動(dòng)功能，可為熱啟動(dòng)酶，為60μ!7管，共1管，濃度為 5UAxL。作為優(yōu)選方案，上述陰性質(zhì)控品為Ing/yL人基因組DNA。作為優(yōu)選方案，上述陽(yáng)性質(zhì) 控品為Ing/yL人基因組DNA以及1 · 0 X 105copies/mL的HPV16、HPV18和HPV58全基因組質(zhì)粒 的混合物。作為優(yōu)選方案，上述檢測(cè)15+3種高危型HPV的試劑盒使用方法如下：
[0042] 1、配制并分裝Master mix:按反應(yīng)液：22yL/test、酶：lyL/test以配置分裝。
[0043] 2、加入PCR模板:將待檢DNA樣本、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品按2yL/test加入Master mix。
[0044] 3、熒光PCR檢測(cè)，設(shè)置報(bào)告基團(tuán)為?艦、￥1(：、呢0、1?(?、075，信號(hào)收集設(shè)置在55°(：。反 應(yīng)條件與程序如下：
[0046] 4、結(jié)果判讀:如果該組報(bào)告基團(tuán)沒(méi)有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，則對(duì)應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)為陰性； 如果該組檢測(cè)靶標(biāo)Ct值<38且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，則對(duì)應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)為陽(yáng)性;如果樣本DNA人 類β-actin基因與15+3種高危型HPV均為陰性，則實(shí)驗(yàn)失敗，需要對(duì)采樣、DNA提取、PCR抑制 等因素進(jìn)行分析。
[0047] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0048] (1)本發(fā)明的檢測(cè)引物、探針與試劑盒能夠全面覆蓋國(guó)際公認(rèn)和宮頸癌密切相關(guān) 的18種高危型HPV，同時(shí)對(duì)中國(guó)人群風(fēng)險(xiǎn)度最高的HPV16、HPV18和HPV58的3種高危型HPV分 型，比現(xiàn)有試劑盒更好的提示罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，更適合中國(guó)人群宮頸癌篩查；
[0049] (2)本發(fā)明的檢測(cè)方法只需要單一反應(yīng)管，檢測(cè)時(shí)間<1.5h，具有快速、簡(jiǎn)便和高 通量的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于大樣本檢測(cè)。
[0050] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳予說(shuō)明。
[0051] 以下實(shí)施例使用Applied Biosystems 7500Real_time PCR System進(jìn)行。
[0052] 本實(shí)施例提供了一種檢測(cè)18(15+3)種高危型HPV核酸的試劑盒，可以對(duì)高危型HPV 的個(gè)體感染情況進(jìn)行定性檢測(cè)，可檢測(cè)18種高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、 51、52、53、56、58、59、66、68、73和82，并且同時(shí)對(duì)冊(cè)￥16、冊(cè)￥18和冊(cè)￥58分型?？捎糜谂R床冊(cè)￥ 感染輔助診斷和宮頸癌的早期篩查。
[0053] 上述試劑盒組成成分如下表4,表4為本發(fā)明的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒 的組成成分表。
[0054] 表 4
[0056]其中反應(yīng)液所含探針的報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記如下表5。表5為上述試劑盒中的 PCR反應(yīng)液所含探針的報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記列表。
[0057]表 5
[0059]樣本采集與處理：
[0060] 1、采樣方法
[0061]以專用宮頸脫落細(xì)胞采集器進(jìn)行采樣。醫(yī)護(hù)人員先以窺陰器或陰道張開(kāi)器暴露宮 頸，用棉拭子將宮頸口過(guò)多的分泌物擦去。取出宮頸刷置于宮頸口，單方向旋轉(zhuǎn)4~5周以獲 得足量的上皮細(xì)胞樣本，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷， 旋緊洗脫管蓋，做好樣本標(biāo)識(shí)，并保持洗脫管直立放置。
[0062] 2、樣本保存:標(biāo)本一經(jīng)采集，應(yīng)盡快送檢;標(biāo)本室溫保存不超過(guò)12小時(shí)，2~8°C保 存不超過(guò)7天，-20°C保存不超過(guò)3個(gè)月。避免反復(fù)凍融。
[0063] 3、樣本運(yùn)輸:泡沫箱加冰袋密封運(yùn)輸，在途時(shí)限不宜超過(guò)48小時(shí)。
[0064] 4、樣本DNA提?。簶颖綝NA提取采用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司核酸提取試劑 (病原體DNA(離心柱型）），操作嚴(yán)格按照相關(guān)要求進(jìn)行。
[0065] 樣本檢測(cè)：
[0066] 1、配制并分裝Master mix:按反應(yīng)液:22yL/test、酶：lyL/test進(jìn)行配制并分裝。
[0067] 2、加入PCR模板:將待檢DNA樣本、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品按2yL/test加入Master mix〇
[0068] 3、熒光PCR檢測(cè)，設(shè)置報(bào)告基團(tuán)為?41^1(：、呢0、1?(?、〇75，淬滅基團(tuán)均選擇11〇116，信 號(hào)收集設(shè)置在55°C。反應(yīng)條件與程序如下：
[0070]結(jié)果判讀：
[0071] 1、如果該組報(bào)告基團(tuán)沒(méi)有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，則對(duì)應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)為陰性；
[0072] 2、如果該組檢測(cè)靶標(biāo)Ct值彡38且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，則對(duì)應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)為陽(yáng)性；
[0073] 3、如果第一組~第四組靶標(biāo)Ct值為(38,40)則需要重檢，重檢結(jié)果為<40為陽(yáng)性， 否則為陰性。
[0074] 4、如果樣本DNA人類β-actin基因與15+3種高危型HPV均為陰性，則實(shí)驗(yàn)失敗，需要 對(duì)采樣、DNA提取、PCR抑制等因素進(jìn)行分析。
[0075] 5、由于不同報(bào)告基團(tuán)焚光值(ARn)不一，建議在結(jié)果分析時(shí)，單獨(dú)選擇一種檢測(cè) 靶標(biāo)進(jìn)行分析，并在必要時(shí)手動(dòng)調(diào)整縱坐標(biāo)即熒光值(ARn)數(shù)值，以便更好地識(shí)別S型擴(kuò)增 曲線。
[0076] 請(qǐng)參照?qǐng)D1、圖2、圖3、圖4、圖5以及圖6,圖1至圖6均出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線且Ct值彡38， 即為陽(yáng)性。
[0077] 為評(píng)價(jià)本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確性與有效性，對(duì)200例有病變的宮頸脫落細(xì)胞樣本與 人乳頭瘤病毒基因分型(39型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。評(píng)價(jià)指標(biāo)采用 陽(yáng)性符合率與陰性符合率，統(tǒng)計(jì)分析采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)，如下表6。表6為對(duì)比實(shí)驗(yàn)的實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)根據(jù)表。
[0078] 表 6
[0080]陽(yáng)性符合率和陰性符合率的計(jì)算公式為：
[0081 ]陽(yáng)性符合率=a/ (a+c) * 100 % ;陰性符合率=d/ (b+d) * 100 %。
[0082] 本發(fā)明的上述試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型(39型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜 交法)對(duì)18種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表7,表7為本發(fā)明的上述試劑盒與人乳頭瘤病毒基 因分型(39型)檢測(cè)試劑盒對(duì)18種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)列表。
[0083] 表 7
[0085] 根據(jù)上述陽(yáng)性符合率和陰性符合率的計(jì)算公式以及表7可知，本發(fā)明的上述試劑 盒的總陽(yáng)性符合率為1 〇〇 % ;總陰性符合率為96.67 %。
[0086] 本發(fā)明試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型（39型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法） 對(duì)HPV16檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)將表8,表8為本發(fā)明的試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型(39型)檢測(cè) 試劑盒對(duì)HPV16檢測(cè)結(jié)果的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)列表。
[0087] 表 8
[0089] 根據(jù)表8可知，本發(fā)明的上述試劑盒的HPV16陽(yáng)性符合率為100% ;HPV16陰性符合 率為99.34%。
[0090] 本發(fā)明的上述試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型(39型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜 交法)對(duì)HPV18檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表9,表9為本發(fā)明的上述試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型 (39型)檢測(cè)試劑盒對(duì)HPV18檢測(cè)結(jié)果的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)列表。
[0091] 表9
[0093] 根據(jù)表9可知，本發(fā)明的上述試劑盒的HPV18陽(yáng)性符合率為100% ;HPV18陰性符合 率為100%。
[0094] 本發(fā)明試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型（39型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法） 對(duì)HPV58檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表10,表9為本發(fā)明的試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型(39型)檢測(cè) 試劑盒對(duì)HPV58檢測(cè)結(jié)果的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)列表。
[0095] 表1〇
[0098] 根據(jù)表10可知，本發(fā)明的上述試劑盒的HPV58陽(yáng)性符合率為100%;HPV58陰性符合 率為100%。
[0099]本發(fā)明試劑盒與人乳頭瘤病毒基因分型（39型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法） 對(duì)其他15種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表11，表11為本發(fā)明的上述試劑盒與人乳頭瘤病毒 基因分型(39型)檢測(cè)試劑盒對(duì)其他15種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)列表。
[0100]表11
[0102] 根據(jù)表11可知，本發(fā)明的上述試劑盒的其他15種高危型HPV陽(yáng)性符合率為100% ; 其他15種高危型HPV陰性符合率為100%。
[0103] 綜合上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明的上述試劑盒與對(duì)照試劑的檢測(cè)結(jié)果一致性好， 符合準(zhǔn)確、有效的原則，完全能夠符合臨床檢測(cè)需要。
[0104] 綜上所述，本發(fā)明提供的檢測(cè)引物、探針與試劑盒在能夠檢測(cè)18種高危型HPV的同 時(shí)，可對(duì)HPV16、18和58型進(jìn)行分型，可以更好的罹患宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的提示效果，更適合中國(guó)人 群宮頸癌篩查;本發(fā)明的試劑盒只需要單一反應(yīng)管，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)1.5h，具有快速、簡(jiǎn)便 和高通量的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于大樣本檢測(cè)。
[0105] 以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運(yùn)用在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括 在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。














【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的探針，其特征在于，包括以下序列的探針： 與 HPV26 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、59 型、66 型、68 型、73 型和82型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:1-15; 與HPV16型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:46; 與HPV18型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:49; 與HPV58型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:52; 與人類β-actin基因的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:55。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的探針，其特征在于，每組探針?lè)謩e 在5'端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)，并在3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)； 所述報(bào)告基團(tuán)的最大發(fā)射光波長(zhǎng)為510-518nm、538_560nm、563-583nm、600nm-6 IOnm、 640_670nm和705_715nm中的任意一種，每組探針標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)的最大發(fā)射光波長(zhǎng)不同； 所述淬滅基團(tuán)的吸收光波長(zhǎng)為 380-550nm、470-560nm、480-580nm、550-650nn^P620-730nm 中的任意一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的探針，其特征在于，所述報(bào)告基團(tuán) S6-FAM、TET、HEX、J0E、VIC、TAMRA、NED、R0X、TexasRed、LCRed610、Cy3、Cy3.5、LC Red640、Cy5、Cy5.5、Quasar670、Quasar705、LC Red705或Alexa Fluor680,所述淬滅基團(tuán)為 ECLIPSE、DABCYL、TAMRA、BHQl、BHQ2或BHQ3。4. 一種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的引物，其特征在于，包括以下序列的引物： 與 HPV26 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、59 型、66 型、68 型、73 型和82型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No: 16~45; 與HPV16型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:47~48; 與HPV18型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:50~51; 與HPV58型的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:53~54; 與人類β-actin基因的基因序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列SEQ ID No:56~57。5. -種檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng) 液包括檢測(cè)18種高危型HPV核酸的探針和引物，所述探針包括寡核苷酸序列SEQ ID No: 1~ 15、SEQ ID No:46、SEQ ID No:49、SEQ ID No:52和SEQ ID No:55,所述引物包括寡核苷酸 序列SEQ ID No:16~45、SEQ ID No:47~48、SEQ ID No:50~51、SEQ ID No:53~54和SEQ ID No:56~57〇6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，其特征在于，所述引物的 濃度為1〇〇μΜ，引物的用量為2.5yL;所述探針的濃度為100μΜ，寡核苷酸序列為SEQ ID No: 55的探針的用量為0.75yL，其余探針用量為1.5yL。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，其特征在于，所述PCR 反應(yīng)液還包括IOXPCR buffer、25mM MgCl2、25mM dN(U)TP、lUAxL UNG和純水。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，其特征在于，PCR buffer 的體積為125yL，MgCl2的體積為150yL，dN(U)TP的體積為10yL，UNG的體積為5yL，所述PCR反 應(yīng)液的總體積為I. lmL。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，其特征在于，還包括熱啟 動(dòng)酶，所述熱啟動(dòng)酶的濃度為5U/yL。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)18種高危型HPV核酸的試劑盒，其特征在于，還包括陰性 質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，所述陰性質(zhì)控品包括Ing/yL人基因組DNA;所述陽(yáng)性質(zhì)控品包括Ing/ yL的人基因組DNA以及1.0\105(3(^68/11^的冊(cè)￥16、冊(cè)￥18和冊(cè)￥58的全基因組質(zhì)粒的混合 物。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK105950788SQ201610428231
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】蔡澤加, 楊勇賢, 田潔, 陳永娟, 王曉輝, 盧舟宇
【申請(qǐng)人】亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司