檢測mthfr酶活性或葉酸代謝能力的引物和探針及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的引物和探針，其中所述引物包括第一、第二引物對，所述探針包括第一、第二探針對，所述第一引物對包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列，所述第二引物對包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示序列，所述第一探針對包括SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示序列，所述第二探針對包括SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示序列。本發(fā)明還公開了基于所述引物和探針的試劑、試劑盒等。本發(fā)明所設(shè)計的引物和探針具有良好的特異性，能夠靈敏地檢測MTHFR基因rs1801131、rs1801133位點突變，檢測過程簡單、耗時短，污染少，且所用的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件穩(wěn)定，檢測結(jié)果可靠，靈敏性高，適于對體液樣本進行高通量的快速檢測。
【專利說明】
檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的引物和探針及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種冠屯、病遺傳風(fēng)險因子檢測方法，特別設(shè)及一種檢測MTHFR酶活性 或葉酸代謝能力的引物和探針、試劑盒及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠屯、病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成屯、 肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的屯、臟病。大量的流行病學(xué)調(diào)查研究表明血漿同型半脫氨酸水 平升高與動脈粥樣硬化性血管疾病危險增加有關(guān)，且血漿同型半脫氨酸與動脈粥樣硬化性 血管疾病之間存在著一種強烈的劑量依賴關(guān)系，運種關(guān)系不依賴于傳統(tǒng)的致動脈粥樣硬化 性血管疾病的危險因子。造成高半脫氨酸的原因基本上分為遺傳性代謝和獲得性代謝障礙 兩大類。其中遺傳性代謝可歸因于血漿同型半脫氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶的基因突變，運 會導(dǎo)致酶活性下降，使甲硫氨酸代謝障礙，導(dǎo)致血漿同型半脫氨酸在體內(nèi)蓄積。
[0003] 目前研究中，MTRR突變是造成葉酸/甲基維生素缺乏癥的主要病因，也是同型半脫 氨酸、葉酸代謝異常的主要原因之一。而同型半脫氨酸、葉酸代謝與許多疾病(Down綜合癥- 先天愚型、神經(jīng)管疾病、屯、血管疾病等）相關(guān)。MTHFR為5，l〇-methylenete1:rahyhofolate reductase(NADPH)，亞甲基四氨葉酸還原酶蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中 將5,10-亞甲基四氨葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氨葉酸。5-甲基四氨葉酸可W 進一步進入甲基傳遞通路，通過同型半脫氨酸的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白 質(zhì)甲基化提供甲基并且使血液中的同型半脫氨酸水平保持在一個較低的水平，高濃度的同 型半脫氨酸能損害血管的內(nèi)皮細胞，成為重要的屯、腦血管致病因素。此外葉酸的中間代謝 產(chǎn)物在核巧酸合成過程中也有重要的作用，通過一碳單位代謝為嚷嶺環(huán)的形成提供碳原 子。MTHFR基因的缺陷將導(dǎo)致機體多個基礎(chǔ)生化過程的素亂，包括細胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、 DNAW及蛋白質(zhì)甲基化修飾等，并進而引發(fā)神經(jīng)管缺陷、癌癥、屯、腦血管疾病等多種病癥?，F(xiàn) 已發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有多種突變類型，不同的基因突變類型對MTHFR的酶活性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生 不同的影響，表現(xiàn)出各種不同的酶活性和熱穩(wěn)定性。一般說來，設(shè)及進化上保守序列的突變 會引起酶活性的急劇下降，危害性比較大;相反，處于非保守序列的突變對酶的活性影響較 小，危害性也較小。rslSOl 133為MTHFR基因中的一個SNP位點MTHFR C677T，是一個常見的不 耐熱錯義突變。MTHFR基因第677位密碼子C被T置換，從而使一個高度保守的丙氨酸變成了 鄉(xiāng)氨酸，同時產(chǎn)生了一個HInfl和化ql限制性酶切位點。C677T位于MTHFR催化區(qū)域，該突變 直接影響亞甲基四氨葉酸還原酶的活性和耐熱性，表現(xiàn)為不同程度的酶活性降低并伴有酶 的耐熱性降低。
[0004] 為實現(xiàn)對冠屯、病遺傳風(fēng)險因子的檢測，研究人員發(fā)展出了多種方法，其中較為常 見的一種方式是構(gòu)建對應(yīng)于運些風(fēng)險因子的試劑盒，但是現(xiàn)有的此類試劑盒在應(yīng)用時往往 存在準(zhǔn)確性較差等問題，且通量較低，難W進行實際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的引物和探針、 試劑盒及其應(yīng)用，W克服現(xiàn)有技術(shù)中不足。
[0006] 為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：
[0007] 本發(fā)明實施例提供了一種檢測MTWR酶活性或葉酸代謝能力的引物和探針，其中： 所述引物包括第一引物對和第二引物對，所述探針包括第一探針對和第二探針對，其中所 述第一引物對包括SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，所述第二引物對包括 SEQ ID NO. 3和沈Q ID NO.4所示的核巧酸序列，所述第一探針對包括SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，所述第二探針對包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核巧 酸序列。
[0008] 進一步的，所述第一引物對和第二引物對中各引物的末端還連接有巧光標(biāo)記物， 所述巧光標(biāo)記物包括FAM或VIC。
[0009] 本發(fā)明實施例還提供了所述的引物和探針在制備檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能 力的試劑中的用途。
[0010] 本發(fā)明實施例還提供了所述的引物和探針在制備檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能 力的試劑盒中的用途。
[0011] 本發(fā)明實施例還提供了一種用于檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑，其包 含所述的引物和探針。
[0012] 本發(fā)明實施例還提供了一種用于MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑盒，其包含 所述的引物和探針。
[0013] 進一步的，所述試劑盒還包含PCR反應(yīng)所需的緩沖液、酶體系W及用于提取待測樣 品DNA的試劑。
[0014] 本發(fā)明實施例還提供了所述的引物和探針、所述的試劑、或者所述的試劑盒于制 備冠屯、病遺傳風(fēng)險因子檢測試劑或試劑盒中的用途。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明通過設(shè)計特異性的引物對和探針對，能實現(xiàn)對MTHFR基 因中rsl801131、rsl801133位點進行快速、準(zhǔn)確地檢測，操作簡單、成本低，結(jié)果精確，可W 實現(xiàn)高通量檢測，具有廣泛應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合一些典型實施例進一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0017] 需要說明的是，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂凑誗ambrook 等人、分子克隆、實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989)等 所述的條件，或按照廠商所建議的條件。
[0018] 在本發(fā)明的如下實施例主要提供了一種檢測冠屯、病遺傳風(fēng)險因子的引物對、試 劑、試劑盒等。更具體的說，如下實施例提供了一種檢測MTWR酶活性或者葉酸代謝能力的 引物和探針、試劑、試劑盒，其設(shè)及的基因位點主要為MTHFR基因中的rs 1801131位點及 rsl801133位點。
[0019] 其中，該MTHFR基因單核巧酸多態(tài)性位點rsl801131位點、rsl801133位點均與冠屯、 病密切相關(guān)。而MTHFR基因的詳細序列可參見ht化://www. ncbi . nlm. nih. gov/。
[0020]進一步的，本發(fā)明實施例提供的一種檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的引物和 探針中，所述引物包括第一引物對和第二引物對，所述探針包括第一探針對和第二探針對， 其中所述第一引物對包括SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，所述第二引物對 包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核巧酸序列，所述第一探針對包括SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，所述第二探針對包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的 核巧酸序列
[0021] 其中，所述第一引物對對應(yīng)于rsl801131位點，其包含的兩條引物可分別命名為 rsl801131-fp(沈Q ID N0.1)和rsl801131-rp(沈Q ID N0.2)。
[0022] 其中，所述第二引物對對應(yīng)于rsl801133位點，其包含的兩條引物可分別命名為 rsl801133-fp(沈Q ID N0.3)和rsl801133-rp(沈Q ID N0.4)。
[0023] 其中，所述第一探針對對應(yīng)于rsl801131位點，其包含的兩條探針可分別命名為 rsl801131-FAM(SEQ ID N0.5)和rsl801131-VIC(SEQ ID N0.6)。
[0024] 其中，所述第二探針對對應(yīng)于rsl801133位點，其包含的兩條探針可分別命名為 rsl801133-FAM(SEQ ID N0.7)和rsl801133-VIC(SEQ ID N0.8)。
[0025] 其中，F(xiàn)AM(簇基巧光素）、VIC為連接于各探針尾端的巧光基團。
[0026] 本發(fā)明實施例還提供了所述的引物和探針在制備檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能 力的試劑或試劑盒中的用途。
[0027] 相應(yīng)的，本發(fā)明實施例還提供了一種用于檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試 劑，其包含所述的引物和探針。
[00%]相應(yīng)的，本發(fā)明實施例還提供了一種用于MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑盒， 其包含所述的引物和探針。
[0029] 進一步的，所述試劑盒還包含PCR反應(yīng)所需的緩沖液、酶體系W及用于提取待測樣 品DNA的試劑。
[0030] 本發(fā)明實施例還提供了所述的引物和探針、所述的試劑、或者所述的試劑盒于制 備冠屯、病遺傳風(fēng)險因子檢測試劑或試劑盒中的用途。
[0031] 本發(fā)明實施例還提供了基于前述引物和探針、試劑或試劑盒的檢測冠屯、病易感位 點的方法，其可W包括如下步驟：
[0032] (1)提取樣品的基因組DNA;
[0033] (2) W待測牛的基因組DNA為模板，用上述引物對和探針對進行PCR擴增；
[0034] (3)對步驟(2)的擴增產(chǎn)物進行基因型判定：如果探針?biāo)鶚?biāo)記巧光染料(FAM，其激 發(fā)波長465nm，發(fā)射波長510nm)的巧光強度增長，而探針?biāo)鶚?biāo)記巧光染料(VIC，其激發(fā)波長 53化m，發(fā)射波長580nm)的巧光強度無增長，表示被測樣本基因型存在突變;反之，如果探針 所標(biāo)記巧光染料(VIC)的巧光強度增長，而探針?biāo)鶚?biāo)記巧光染料(FAM)的巧光強度無增長， 表示被測樣本基因型無突變;如果兩種巧光強度均增長，則被測樣本基因型存在突變。
[0035] (4)最后可W通過專口的分析軟件，進行等位基因分型。
[0036] 為了便于檢測結(jié)果分析，可在PCR擴增步驟中增加已知基因型的陽性對照和陰性 對照。
[0037] 較之現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所設(shè)計的引物和探針具有良好的特異性，能夠靈敏地檢測 MTHFR基因 rs 1801131位點、rs 1801133位點突變，檢測過程只經(jīng)一個反應(yīng)步驟，即可得出判 型結(jié)果，無需PCR后反應(yīng)，步驟簡單、耗時短，污染少，且所用的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件穩(wěn)定，檢 測結(jié)果可靠。而且，本發(fā)明工作流程簡單，只需混合DM模板、引物和探針試劑即可進行儀器 檢測，易于掌握，且靈敏性高，對DNA的濃度要求低(可低至Ing)，適于對體液樣本進行高通 量的快速檢測。
[003引實施例；
[0039] 一、巧光PCR檢測
[0040] 1、實驗材料
[0041 ] LightCycler480巧光定量PCR儀購自瑞：t羅氏（Roche)公司，聚合酶鏈反應(yīng)液 (XightCycler480High Resolution Melting Master)由瑞:t羅氏（Roche)公司定制合成。
[0042] 2、引物及探針設(shè)計與合成：
[0043] WMTHFR基因外顯子的部分序列為模板，使用Primer Premie巧軟件分析引物、探 針，并由上海生工生物工程有限公司定制合成。
[0044] 檢測用引物：
[0045] MTHFR 基因 rsl801131 上游引物序列 rsl801131-fp:
[0046] 5' -AGAGCAAGTCCCCCAAGGA-3'(沈Q ID NO. 1);
[0047] MTHFR 基因 rsl801131 下游引物序列 rsl801131-巧：
[004引 5'-GAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGAC-3' (SEQ ID NO.2)。
[0049] MTHFR 基因 rsl801133上游引物序列rsl801133-fp:
[0050] 5'-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3' (SEQ ID NO.3);
[0化1] MTHFR基因 rsl801133下游引物序列rsl801133-巧：
[0052] 日'-CGGTGCATGCCTTCACAA-3'(沈Q ID N0.4)。
[0053] 檢測用探針：
[0化4] MTHFR 基因 rsl801131 探針 rsl801131-FAM:
[0055] 5' -ACCAGTGAAGAAAG-3'(沈Q ID NO. 5);
[0056] MTHFR 基因 rsl801131 探針 rsl801131-VIC:
[0057] 5' -ACCAGTGAAGCAAG-3'(沈Q ID NO. 6);
[0化引 MTHFR基因甘31801133探針'31801133斗施：
[0059] 5'-CTGCGGGAGTCGA-3' (SFQ ID NO.7);
[0060] MTHFR基因 r s 1801133探針r s 1801133-VIC:
[0061 ] 5/-CTGCGGGAGCCGA-3/(沈Q ID N0.8)。
[0062] 3、樣本檢測：實驗共檢測50例冠屯、病病例和50例正常對照人群，每例收集血樣標(biāo) 本約2ml，用酪/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結(jié)果用微量紫外/可見光分光光度計（Themo Fisher公司）檢測。
[0063] 按如下體系進行巧光PCR擴增，最后用roche LC480softwarel .5掃描并聚類分析：
[0064] ?5μΙ 2X Light Cycler480High Resolution Melting Master Mix [00化]1.2^25πιΜ MgCb溶液
[0066] 化L 2μΜ Primer Mix
[0067] 化L 5ngAiL左右DNA
[006引 1.祉L出0
[0069] 反應(yīng)總體積10化，其可在384孔板中進行。
[0070]
[0071] 4、基因組DM抽提的檢測結(jié)果：所有樣本的基因組DM符合檢測要求（260/280> 1.8，濃度>10雌/41^。
[0072] 二、Taqman法檢測冠屯、病rsl801131、rsl801133位點的基因型
[0073] 用Taqman法檢測冠屯、病遺傳風(fēng)險基因 MTHFR基因的rsl801131、rsl801133位點。挑 選上述冠屯、病病例-對照組樣本各10例進行化qman分型實驗，判斷rsl801131、rsl801133的 基因型。
[0074] 1、實驗方法
[0075] 化qman探針方法使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的化qman探針，蘇州新海生物科技有 限公司的化qman Mix。
[0076] 按如下體系進行PCR擴增，最后用roche LC480softwarel.5掃描并聚類分析：
[0077] SjiLTaqman Mix
[0078] 0.1化 Taqman Probe
[0079] 化L 2μΜ Primer Mix
[0080] 化 L5ng/yL 左右 DM
[0081 ] 3.化 LH2O
[0082] 反應(yīng)總體積10化，其可在384孔板中進行。
[0083]
[0084] 2、實驗結(jié)果:20例化qman分型結(jié)果與Li曲t切cler480巧光PCR的HRM分析結(jié)果完全 一致。
[0085] 3、MTHFR基因 rsl801131、rsl801133基因型和冠屯、病易感的關(guān)聯(lián)分析
[00化]MTHFR基因 rsl801131、rsl801133在冠屯、病病人和對照中分布的比較采用RxCx2檢 驗。用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，檢測結(jié)果證實，rsl801131、rsl801133基因型和冠屯、病易感 存在顯著關(guān)聯(lián)。
[0087] Ξ、該實施例還提供了一類冠屯、病易感位點的檢測試劑盒，其可W對MTHFR基因外 顯子中包含rsl801131、rsl801133位點的區(qū)域進行擴增及分析，該檢測試劑盒可W檢測冠 屯、病的易感性，其包含有可擴增出MTHFR基因外顯子中包含rsl801131、rsl801133位點的特 異性引物及探針和其他PCR反應(yīng)所需輔助試劑。
[0088] 檢測試劑盒供50人份檢測應(yīng)用，于-20°C避光保存，其組分及含量包括：
[0089] f5yL2X Light Cycler 480Hi曲 Resolution Melting Master Mix
[0090] 1.2^25πιΜ MgCb溶液
[0091] 化L2yM Primer Mix
[0092] 化 LSng/μΙ 左右 DM
[0093] 1.祉L 出0
[0094] 具有沈Q ID NO:1~沈Q ID NO:4所示序列的特異性引物各0.2uM;
[0095] 具有沈Q ID NO:5~沈Q ID NO:8所示序列的探針各0.2uM。
[0096] 籍由該試劑盒，利用前述的方法檢測不同人群的MTHFR基因中rsl801131、 rsl801133位點的基因型，W此判斷不同個體患冠屯、病的發(fā)病風(fēng)險，并將檢測結(jié)果與其它方 法（例如PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformationalpolymor曲ism，SSCP)法）的 檢測結(jié)果對照，證實該試劑盒可用于精確(檢測限可達Ing)、快速的檢測。
[0097] 應(yīng)當(dāng)理解，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此 項技術(shù)的人±能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)W實施，并不能W此限制本發(fā)明的保護范圍。凡 根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的引物和探針，其特征在于:所述引物包括第 一引物對和第二引物對，所述探針包括第一探針對和第二探針對，其中所述第一引物對包 括SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示的核苷酸序列，所述第二引物對包括SEQIDN0.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探針對包括SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6所示的核苷 酸序列，所述第二探針對包括SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于:所述第一引物對和第二引物對中各 引物的末端還連接有熒光標(biāo)記物，所述熒光標(biāo)記物包括FAM或VIC。3. 權(quán)利要求1或2所述的引物和探針在制備檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑中 的用途。4. 權(quán)利要求1或2所述的引物和探針在制備檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑盒 中的用途。5. -種用于檢測MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑，其特征在于:所述試劑包含權(quán)利 要求1或2所述的引物和探針。6. -種用于MTHFR酶活性或葉酸代謝能力的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包含權(quán)利 要求1或2所述的引物和探針。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含PCR反應(yīng)所需的緩沖 液、酶體系以及用于提取待測樣品DNA的試劑。8. 權(quán)利要求1或2所述的引物和探針、權(quán)利要求5所述的試劑、或者權(quán)利要求6-7中任一 項所述的試劑盒于制備冠心病遺傳風(fēng)險因子檢測試劑或試劑盒中的用途。
【文檔編號】C12N15/11GK106011282SQ201610579688
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】黃迅威
【申請人】蘇州康吉診斷試劑有限公司