突變型OsGBSS1酶及其制備方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種顆粒結(jié)合淀粉合成酶，該酶在對(duì)應(yīng)于SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)選自下組的氨基酸位點(diǎn)中發(fā)生突變：H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413、C487、A114、EA314-315和T543，所述酶的比酶活性顯著降低。因此，本發(fā)明揭示特定氨基酸殘基與直鏈淀粉含量的關(guān)系，從而能調(diào)節(jié)水稻中直鏈淀粉含量，進(jìn)而可用于改善稻米的食用品質(zhì)。
【專利說明】突變型OsGBSSI酶及其制備方法與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及突變型OsGBSSI (顆粒結(jié)合淀粉合成酶1，2.4.1.242)以及利用該酶改善大米中直鏈淀粉含量的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]禾谷類作物是我國的主要糧食作物。其中，水稻(Oryza sativa)是重要的禾谷類作物，有秈粳之分，秈包括秈稻和秈糯，粳包括粳稻和粳糯。稻米供人類食用的主要部分是胚乳中的淀粉，淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉。糯稻與非糯稻的區(qū)別在于胚乳的淀粉組成比例不同，非糯型的水稻直鏈淀粉含量較高，在10-30wt%之間；糯型的水稻直鏈淀粉含量則低于3wt%。在表觀上非糯 型的米粒色澤呈透明或淺透明狀，用碘-碘化鉀對(duì)米粒橫切面進(jìn)行染色，呈蘭色；糯型的米粒色澤呈蠟質(zhì)狀，用碘-碘化鉀染色，呈橙黃色。水稻胚乳中的直鏈淀粉含量和膠稠度是稻米品質(zhì)評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)。
[0003]直鏈淀粉是在ADP-Glc焦磷酸化酶(AGPase)和Wx基因編碼的OsGBSSI [I, 2]的作用下合成的。Wx基因的表達(dá)水平、OsGBSSI的活性與AC呈顯著正相關(guān)[1，3，4]。根據(jù)直鏈淀粉含量的不同一般將水稻分為四類:極低直鏈淀粉含量品種、低直鏈淀粉含量品種、中等直鏈淀粉含量品種和高直鏈淀粉含量品種[5]。
[0004]影響大米蒸煮和食用品質(zhì)的關(guān)鍵因素包括:直鏈淀粉含量(AC)、膠稠度以及糊化溫度[6]。這其中膠稠度和糊化溫度兩項(xiàng)參數(shù)也與直鏈淀粉含量有一定的相關(guān)性，因?yàn)檫@兩項(xiàng)流變力學(xué)特征決定于支鏈淀粉結(jié)構(gòu)，尤其是短支鏈與長支鏈的比例[7]。OsGBSSI同時(shí)負(fù)責(zé)支鏈淀粉中超長鏈的延伸[8]。所以，通過調(diào)節(jié)Wx基因的表達(dá)或活性水平可以在影響AC的同時(shí)，決定蒸煮和食用品質(zhì)的不同。
[0005]一般而言，高直鏈淀粉含量的稻米其食用品質(zhì)會(huì)降低，而這一現(xiàn)象也廣泛存在于在中國種植的雜交秈稻中。研究人員正努力在降低大米AC保證食用品質(zhì)的同時(shí)保證其高產(chǎn)。目前有三種降低AC的方法。(I)通過引入反義鏈降低WxmRNA的表達(dá)量[9，10] ; (2)通過調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性。例如利用dsRNAi方法抑制一個(gè)可以結(jié)合到Wx基因啟動(dòng)子上的一段特異31bp片段上的轉(zhuǎn)錄因子0sBP-5來達(dá)到降低OsGBSSI表達(dá)的目的[11] ； (3)降低Wx基因pre-mRNA的剪接效率。例如將剪接因子du_l或du_2突變后，由于Wx的異常剪接造成OSGBSSI成熟蛋白質(zhì)含量降低，直接造成直鏈淀粉含量降低[12，13]。RNA介導(dǎo)的RNA沉默機(jī)制的發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用，為包括直鏈淀粉含量的控制提供了一種直接途徑。但通過dsRNAi對(duì)基因表達(dá)的抑制作用只能定性而并不能精確地對(duì)其產(chǎn)生的作用進(jìn)行定量，這也在一定程度上阻礙了其在水稻育種品質(zhì)改良上的應(yīng)用。此外，上述方法都建立在Wx的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)控的理論基礎(chǔ)上，并沒有系統(tǒng)研究直接改變OsGBSSI酶活性的諸方面。
[0006]自然界的眾多水稻品種提供了一個(gè)很大的水稻品質(zhì)庫，Wx基因在眾多水稻品種中也存在很多自然突變。Wx基因本身存在產(chǎn)生不同突變進(jìn)而影響水稻淀粉品質(zhì)的潛能[4]。由于這些水稻品種之間存在遺傳背景上的不同，因此這些自然突變是否就是造成它們之間AC不同的唯一原因就不得而知。[0007]因此，為本領(lǐng)域急需從OsGBSSI本身入手，系統(tǒng)研究如何改變其活性，例如通過突變其氨基酸序列改變其活性，進(jìn)而改善水稻以及所得大米的品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種活性改變的顆粒結(jié)合淀粉合成酶并揭示特定氨基酸殘基與直鏈淀粉含量的關(guān)系，進(jìn)而用于調(diào)節(jié)水稻中直鏈淀粉含量以及改善稻米的食用品質(zhì)。
[0009]在第一方面，本發(fā)明提供一種顆粒結(jié)合淀粉合成酶，所述酶在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNOil所示氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)選自下組的氨基酸位點(diǎn)中發(fā)生突變:
[0010](a)H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413 或 C487 ；
[0011](b)A114、EA314-315 或 T543 ;或
[0012](c)上述(a)或(b)的任意組合。
[0013]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述突變是選自下組的突變:(1)非極性氨基酸替代極性氨基酸，優(yōu)選以A替代；(2)改變主鏈的碳鏈長度；或(3)改變氨基酸上的R基團(tuán)。
[0014]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述突變是:H236Y、N265D、Y268F、Y268W、N353A、R408A、E410D、E410Q、C487A、K413A、A114S、EA314-315QT 或 T543A。
[0015]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述顆粒結(jié)合淀粉合成酶的比酶活降低10%_100%。
[0016]在第二方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明第一方面所述顆粒結(jié)合淀粉合成酶的多核苷酸。
[0017]在第三方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第二方面所述多核苷酸的表達(dá)載體。
[0018]在第四方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第二方面所述多核苷酸或本發(fā)明第三方面所述表達(dá)載體的植物細(xì)胞。
[0019]在第五方面，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)顆粒結(jié)合淀粉合成酶活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0020](I)將待調(diào)節(jié)活性的顆粒結(jié)合淀粉合成酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作序列比對(duì)；
[0021](2)根據(jù)調(diào)節(jié)需要從下表中選擇相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行突變:
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種顆粒結(jié)合淀粉合成酶，其特征在于，所述酶在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)選自下組的氨基酸位點(diǎn)中發(fā)生突變: (a)H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413或 C487 ； (b)A114、EA314-315或 T543 ;或 (c)上述(a)或(b)的任意組合。
2.如權(quán)利要求1所述的顆粒結(jié)合淀粉合成酶，其特征在于，所述突變是:H236Y、N26?、Y268F、Y268W、N353A、R408A、E410D、E410Q、C487A、K413A、A114S、EA314-315QT 或 T543A。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述顆粒結(jié)合淀粉合成酶的多核苷酸。
4.包含權(quán)利要求3所述多核苷酸的表達(dá)載體。
5.包含權(quán)利要求3所述多核苷酸或權(quán)利要求4所述表達(dá)載體的植物細(xì)胞。
6.一種調(diào)節(jié)顆粒結(jié)合淀粉合成酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將待調(diào)節(jié)活性的顆粒結(jié)合淀粉合成酶的氨基酸序列與SEQID NO:1所示氨基酸序列作序列比對(duì)； (2)根據(jù)調(diào)節(jié)需要從下表中選擇相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行突變:
7.一種制備顆粒結(jié)合淀粉合成酶活性受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (I)將待調(diào)節(jié)活性的顆粒結(jié)合淀粉合成酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作序列比對(duì)； (2)根據(jù)調(diào)節(jié)需要從下表中選擇相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行突變:
8.調(diào)節(jié)水稻中直鏈淀粉含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將待調(diào)節(jié)直鏈淀粉含量的水稻植株的OsGBSSI的氨基酸序列與SEQID NO:1所示氨基酸序列作序列比對(duì)； (2)根據(jù)調(diào)節(jié)需要從下表中選擇相應(yīng)的位點(diǎn):
9.一種生產(chǎn)直鏈淀粉含量受調(diào)節(jié)的稻米的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求7所得的轉(zhuǎn)基因水稻；和 (2)獲得所述轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)生的稻米。
10.如權(quán)利要求1所述的顆粒結(jié)合淀粉合成酶或權(quán)利要求3所述的編碼多核苷酸的用途，其特征在于，所述酶在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)選自Α114、ΕΑ314-315或Τ543的氨基酸位點(diǎn)中發(fā)生突變，所述顆粒結(jié)合淀粉合成酶或其編碼多核苷酸作為分子標(biāo)記用于制備通過特異性識(shí)別Α114、ΕΑ314-315或Τ543位點(diǎn)的氨基酸突變來鑒別水稻品種的試劑或試劑盒。
11.一種鑒別水稻品種的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)鑒定待鑒別水稻的GBSSl氨基酸序列中Α114、ΕΑ314-315或Τ543位點(diǎn)的氨基酸、GBSSl比酶活或該水稻的直鏈淀粉含量； (2)根據(jù)下表判斷所鑒別的水稻屬于下表中哪一品種。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103695381SQ201310069961
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月5日
【發(fā)明者】蔡秀玲, 劉德瑞 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院