突變酶及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的課題在于提供一種顯示葡萄糖脫氫酶活性的新型酶。此外，本發(fā)明的課題在于提供有關(guān)酶的修飾的新型方法。本發(fā)明提供一種突變酶，其由在來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中選自以下一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列構(gòu)成：與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的115位、131位、132位、193位、353位、436位、446位、472位、511位、535位、537位、582位或583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸。
【專(zhuān)利說(shuō)明】突變酶及其用途
[0001] 本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)是針對(duì)申請(qǐng)日為2010年11月22日、申請(qǐng)?zhí)枮?01080055012.4、
發(fā)明名稱(chēng)為“突變酶及其用途”的申請(qǐng)?zhí)岢龅姆职干暾?qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及突變酶及酶的修飾方法,提供經(jīng)脫氫酶(dehydrogenase)化的葡萄糖氧化酶及其制備方法等。本申請(qǐng)主張基于2009年12月5日申請(qǐng)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)第2009-277096號(hào)的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)參照的方式援引該專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]使用電化學(xué)生物傳感器的簡(jiǎn)易型自我血糖測(cè)定器得到廣泛使用。在該生物傳感器中利用以葡萄糖為底物的酶即葡萄糖氧化酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“G0”)、葡萄糖脫氫酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“GDH”)。GO具有針對(duì)葡萄糖的特異性高且熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)異這樣的優(yōu)點(diǎn)，但另一方面被指出如下問(wèn)題:在使用GO的測(cè)定中容易受到測(cè)定樣品中的溶解氧的影響，溶解氧對(duì)測(cè)定結(jié)果造成影響。
[0004]另一方面，作為不受到溶解氧的影響且在NAD (P)不存在的情況下對(duì)葡萄糖發(fā)生作用的酶，已知以吡咯喹啉醌(PQQ)為輔酶的⑶H (以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“PQQ-GDH”)(例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)I~3)。但是，PQQ-GDH存在如下問(wèn)題=(I)PQQ容易從酶中離解；(2)針對(duì)葡萄糖的選擇性低；以及(3)由于一般存在于膜組分，因此其提取、分離操作中存在困難等。
[0005]除PQQ-GDH以外，作為不受到溶解氧的影響且在NAD(P)不存在的情況下對(duì)葡萄糖發(fā)生作用的酶，已知以黃素腺嘌呤二核苷酸為輔酶的⑶H(以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“FAD-GDH”)。迄今為止，從米曲霉(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I~4、專(zhuān)利文獻(xiàn)4)及土曲霉(專(zhuān)利文獻(xiàn)5)中分別取得FAD-GDH。作為FAD-GDH的一般特性，已知:針對(duì)木糖的反應(yīng)性比較高(例如在專(zhuān)利文獻(xiàn)5所公開(kāi)的FAD-GDH的情況下，對(duì)木糖的反應(yīng)性為對(duì)葡萄糖的作用性的10%左右)以及最適溫度高(例如專(zhuān)利文獻(xiàn)4所公開(kāi)的FAD-GDH的最適溫度為約60°C)。應(yīng)予說(shuō)明，以提高實(shí)用性等為目的，正在大力嘗試酶的修飾。報(bào)告FAD-GDH的修飾的文獻(xiàn)如下所示(專(zhuān)利文獻(xiàn)6~9)。
[0006]最近，報(bào)告了利用GO的結(jié)構(gòu)進(jìn)行FAD-GDH的立體結(jié)構(gòu)分析，Glu414及Arg502對(duì)底物識(shí)別是重要的(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5，6)。
[0007]專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0008]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2000-350588號(hào)公報(bào)
[0009]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2001-197888號(hào)公報(bào)
[0010]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2001-346587號(hào)公報(bào)
[0011]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開(kāi)第2007/139013號(hào)小冊(cè)子
[0012]專(zhuān)利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)第2004/058958號(hào)小冊(cè)子
[0013]專(zhuān)利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2009-225801號(hào)公報(bào)
[0014]專(zhuān)利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)2009-225800號(hào)公報(bào)
[0015]專(zhuān)利文獻(xiàn)8:日本特開(kāi)2009-159964號(hào)公報(bào)[0016]專(zhuān)利文獻(xiàn)9:日本特開(kāi)2008-237210號(hào)公報(bào)
[0017]非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.1.1nduction of its synthesis by p—benzoquinone and hydroquinone, T.C.Bak, and R.Sato, Biochim.Biophys.Acta, 139, 265-276 (1967).[0018]非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.11.Purification and physical and chemical properties, T.C.Bak, Biochim.Biophys.Acta, 139, 277-293(1967).[0019]非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.1I1.General enzymatic properties, T.C.Bak, Biochim.Biophys.Acta,146，317-327(1967).[0020]非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.1V.Histidyl residue as an active site, T.C.Bak, and R.Sato, Biochim.Biophys.Acta, 146, 328-335(1967).[0021]非專(zhuān)利文獻(xiàn)5:2009年度日本藥學(xué)會(huì)年會(huì)要旨集卷:129號(hào):第3頁(yè):118演講題目序號(hào):26Q-pmll5
[0022]非專(zhuān)利文獻(xiàn)6:2009年度日本生化學(xué)會(huì)大會(huì)要旨集演講題目序號(hào):3T5a_5(3P-109)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]FAD-GDH與PQQ-GDH相比存在有利之處。另一方面，F(xiàn)AD-GDH針對(duì)木糖的反應(yīng)性比較高，因此在測(cè)定木糖負(fù)荷試驗(yàn)受試者的血糖時(shí)存在難以檢測(cè)出正確的測(cè)定值這樣的問(wèn)題。此外，由于最適溫度 高，因此在寒冷地區(qū)的測(cè)定等溫度低的環(huán)境下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，無(wú)法發(fā)揮充分的活性。在這種測(cè)定條件下需要進(jìn)行溫度修正且還容易產(chǎn)生測(cè)定誤差。如上所述，原有的FAD-GDH存在待改善之處，期望實(shí)用性的進(jìn)一步提高。本發(fā)明的課題之一在于響應(yīng)這種要求。本發(fā)明目前的一個(gè)課題為提供有關(guān)酶的修飾的新型方法。
[0024]作為用于獲得實(shí)用性高的⑶H的方法，大致有:(1)將現(xiàn)有的⑶H (FAD-GDH,PQQ-GDH )進(jìn)行修飾的方法、以及(2)將微生物等進(jìn)行篩選的方法。這些方法大多已有嘗試(例如上述專(zhuān)利文獻(xiàn)6、7)，今后，與更有效的酶的創(chuàng)造相關(guān)的可能性低。鑒于該狀況，本發(fā)明的發(fā)明人等著眼于葡萄糖氧化酶(GO)中沒(méi)有FAD-GDH所具有的上述問(wèn)題。已知GO與FAD-GDH的氨基酸序列的同源性比較高。著眼于該同源性，決定采用對(duì)GO賦予GDH活性，SP，將GO進(jìn)行⑶H化這樣的新方法。首先,選擇來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)的GO,將其氨基酸序列與已知的多種FAD-GDH的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。然后，通過(guò)利用比對(duì)結(jié)果與GO的立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，從而在位于GO的活性中心附近的氨基酸中，檢索出雖然在FAD-GDH間保守(共同性高)，但是在GO與FAD-GDH之間不同的氨基酸。結(jié)果是，13處氨基酸位置得到確定。接著，制作在這些氨基酸位置導(dǎo)入突變而得的突變酶，研究其特性，結(jié)果認(rèn)定GDH活性與GO活性的比率(GDH活性/GO活性)上升的突變酶。因此，決定分析該突變酶的序列。由此，成功地確定了對(duì)⑶H活性的上升、即⑶H化有效的4處氨基酸位置。該結(jié)果一方面啟示了在最初確定的13處內(nèi)，除該4處以外，對(duì)GDH活性的上升沒(méi)有效果。但是，在是通過(guò)GO與FAD-GDH的詳細(xì)比較而發(fā)現(xiàn)的氨基酸位置方面沒(méi)有不同，因此對(duì)于其余9處也隱藏著對(duì)底物特性、輔酶特異性、溫度穩(wěn)定性等其它特性的改良、改善有用的可能性。此外，通過(guò)并用兩種以上，也有提高GDH活性、其它特性的可能性。由此，其余9處氨基酸位置也有價(jià)值，其活用得到期待。
[0025]另一方面，進(jìn)一步研究的結(jié)果，成功地確定了對(duì)⑶H化特別有效的取代位置的組合。在采用該組合時(shí)，底物特異性也良好(對(duì)木糖的反應(yīng)性低)。此外，對(duì)于最優(yōu)異的組合，嘗試取代的最優(yōu)化(即，最有效的取代后的氨基酸的確定)，結(jié)果對(duì)GDH化有效的取代后的氨基酸得到確定，并且發(fā)現(xiàn)了帶來(lái)完全的GDH化的取代后的氨基酸。此外，確認(rèn)了完全GDH化的突變體的底物特異性也優(yōu)異(對(duì)木糖的反應(yīng)性低)。
[0026]可是，也經(jīng)歷很多通過(guò)將有效果的兩種氨基酸突變進(jìn)行組合而產(chǎn)生相加或協(xié)同的效果的可能性高的情況。因此，可以說(shuō)確定成功的4處突變對(duì)象位置不限于單獨(dú)，關(guān)于其組合也對(duì)⑶H化有效。
[0027]此外，對(duì)于同種酶而言，若鑒于結(jié)構(gòu)(一級(jí)結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu))的相似性高，同樣的突變產(chǎn)生同樣的效果的概率高這樣的技術(shù)常識(shí)，可以說(shuō)對(duì)于與后述實(shí)施例所示的黑曲霉的GO之間結(jié)構(gòu)上的相似性實(shí)際上非常高的尼崎青霉(Pen1c1ll1um amagasak1ense)的G0、其它G0，可適用本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的突變方法。
[0028]如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人等成功地將GO進(jìn)行GDH化，創(chuàng)造出GDH活性高的突變型G0。同時(shí)，還成功地確定了對(duì)GO的突變有效的氨基酸位置。在所得突變型GO中，有的不顯示出對(duì)木糖的反應(yīng)性。即，在不顯示出對(duì)木糖的反應(yīng)性方面，成功地取得超出現(xiàn)有FAD-GDH的 GDH。
[0029]以上成果一方面證實(shí):在結(jié)構(gòu)相似性高的兩種酶之間，將氨基酸序列進(jìn)行網(wǎng)羅地比較，并且利用活性中心附近的立體結(jié)構(gòu)這樣的方法對(duì)酶的修飾(特別是，對(duì)于修飾對(duì)象的酶，賦予其它酶具有的特性或其它酶在更優(yōu)選的狀態(tài)下具備的特性)有效。
[0030]以下示出的本發(fā)明基于以上成果。
[0031][1] 一種突變酶，由在來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中選自以下(1)~(13)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列所構(gòu)成:
[0032](1)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0033](2)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0034](3)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0035](4)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0036](5)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0037](6)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0038](7)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0039](8)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0040](9)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0041](10)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0042](11)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； [0043](12)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0044](13)與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸。
[0045][2]根據(jù)[1]所述的突變酶，其中，來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列為序列號(hào)I或2的氨基酸序列。
[0046][3]根據(jù)[I]或[2]所述的突變酶，其中，被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
[0047][4]根據(jù)[3]所述的突變酶，其中，對(duì)于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸為丙氨酸，對(duì)于(5)的氨基酸，取代后的氨基酸為丙氨酸，對(duì)于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸為絲氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
[0048][5]根據(jù)[I]或[2]所述的突變酶，其中，被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
[0049][6]根據(jù)[5]所述的突變酶，其中，對(duì)于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸為丙氨酸，對(duì)于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸為絲氨酸，精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
[0050][7]根據(jù)[I]或[2]所述的突變酶，其中，被取代的氨基酸為(7)的氨基酸及(12)
的氨基酸。
[0051][8]根據(jù)[7]所述的突變酶，其中，對(duì)于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸為絲氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
[0052][9]根據(jù)[I]所述的突變酶，其中，由序列號(hào)7~21、59~61中的任一氨基酸序列所構(gòu)成。
[0053][10] 一種基因，編碼[I]~[9]中任一項(xiàng)所述的突變酶。
[0054][11]根據(jù)[10]所述的基因,其中，包含序列號(hào)22~36、62~64中的任一堿基序列。
[0055][12] 一種重組DNA，包含[10]或[11]所述的基因。
[0056][13] 一種微生物，具有[12]所述的重組DNA。
[0057][14] 一種葡萄糖測(cè)定法，其特征在于，使用[I]~[9]中任一項(xiàng)所述的突變酶，測(cè)定試樣中的葡萄糖。
[0058][15] 一種葡萄糖測(cè)定用試劑，其特征在于，包含[I]~[9]中任一項(xiàng)所述的突變酶。
[0059][16] 一種葡萄糖測(cè)定用試劑盒，包含[15]所述的葡萄糖測(cè)定用試劑。
[0060][17] 一種方法，其特征在于，使用[I]~[9]中任一項(xiàng)所述的突變酶，降低工業(yè)制品或其原料中的葡萄糖量。
[0061][18] 一種酶劑，含有[I]~[9]中任一項(xiàng)所述的突變酶。
[0062][19] 一種突變酶的設(shè)計(jì)方法，包括以下步驟(i)和(ii):
[0063]( i )在突變對(duì)象酶的氨基酸序列中，確定選自以下(I)~(13)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸的步驟，上述突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶或來(lái)自微生物的黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶:
[0064](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0065](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0066](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0067](4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0068](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；[0069](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0070](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0071](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0072](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0073](10)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0074](11)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0075](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0076](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸；
[0077](ii)基于突變對(duì)象酶的氨基酸序列，構(gòu)建在步驟(i)中確定的氨基酸序列被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列的步驟。
[0078][20]根據(jù)[19]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶，在步驟(i)中被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
[0079][21]根據(jù)[19]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶，在步驟(i)中被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨 基酸的組合。
[0080][22]根據(jù)[19]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶，在步驟(i)中被取代的氨基酸為(7)的氨基酸及(12)的氨基酸。
[0081][23]根據(jù)[20]~[22]中任一項(xiàng)所述的設(shè)計(jì)方法，其中，來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶為黑曲霉(Aspergillus niger)或尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)的葡萄糖氧化酶。
[0082][24]根據(jù)[23]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，葡萄糖氧化酶的氨基酸序列為序列號(hào)I或2的氨基酸序列。
[0083][25]根據(jù)[19]所述的設(shè)計(jì)方法,其中，突變對(duì)象酶為意大利青霉(Penicilliumitalicum)、薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)、米曲霉(Aspergillusoryzae)或土曲霉(Aspergillus terreus)的黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶。
[0084][26]根據(jù)[25]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列為序列號(hào)3~6中的任一氨基酸序列。
[0085][27] 一種突變酶的制備方法，包括以下步驟(1)~(III):
[0086](I)制備將序列號(hào)7~21、59~61中的任一氨基酸序列、或由[19]~[26]中任一項(xiàng)所述的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核酸的步驟；
[0087](II)使所述核酸進(jìn)行表達(dá)的步驟，及
[0088](III)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0089]圖1為來(lái)自黑曲霉的GO的氨基酸序列與來(lái)自尼崎青霉的GO的氨基酸序列的比較。用下劃線表示突變對(duì)象的氨基酸。用粗體字表示在突變對(duì)象的氨基酸中對(duì)GDH活性提聞?dòng)行У臍饣?。箭頭為活性中心的氣基酸。表不同一(identical), “: ”表不保守性取代(conserved substitutions), ” 表不半保守性取代(sem1-conservedsubstitutions)。
[0090]圖2為來(lái)自微生物的GO與來(lái)自微生物的FAD-GDH的氨基酸序列的比較。從上段開(kāi)始依次表示意大利青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)3的N末端側(cè)部分)、薄刺青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)4的N末端側(cè)部分)、米曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)5的N末端側(cè)部分)、土曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)6的N末端側(cè)部分)、黑曲霉GO的氨基酸序列(序列號(hào)I的N末端側(cè)部分)。用下劃線表示在處于GO的活性中心附近的氨基酸中，在FAD-GDH間保守(共同性高)而在GO與FAD-GDH之間不同的氨基酸，并且從N末端側(cè)依次附加序號(hào)。
[0091]圖3為來(lái)自微生物的GO與來(lái)自微生物的FAD-GDH的氨基酸序列的比較(圖1的接續(xù))。從上段開(kāi)始依次表示意大利青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)3的C末端側(cè)部分)、薄刺青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)4的C末端側(cè)部分)、米曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)5的C末端側(cè)部分)、土曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列號(hào)6的C末端側(cè)部分)、黑曲霉GO的氨基酸序列(序列號(hào)I的C末端側(cè)部分)。用下劃線表示在處于GO的活性中心附近的氨基酸中，在FAD-GDH間保守(共同性高)而在GO與FAD-GDH之間不同的氨基酸，從N末端側(cè)依次附加序號(hào)。箭頭為GO的活性中心的氨基酸。
[0092]圖4為包含用PCR擴(kuò)增的黑曲霉GO的基因序列的序列(序列號(hào)37)。在Y末端添加HindIII位點(diǎn)(框線)與Kozak序列(下劃線),在3'末端側(cè)添加X(jué)hoI位點(diǎn)(框線)。應(yīng)予說(shuō)明，通過(guò)添加Kozak序列，第2個(gè)氨基酸從谷氨酰胺變更成絲氨酸。黑曲霉GO的基因序列如序列號(hào)38所示。
[0093]圖5為平板測(cè) 定法的結(jié)果。制作包含導(dǎo)入突變的質(zhì)粒的文庫(kù)(釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)),將生長(zhǎng)的菌落在表達(dá)平板中復(fù)制后,用平板測(cè)定法檢測(cè)GO活性及⑶H活性。
[0094]圖6為表示液體培養(yǎng)中的活性確認(rèn)的結(jié)果。對(duì)于突變酶轉(zhuǎn)化株內(nèi)可確認(rèn)陽(yáng)性菌落(在GO測(cè)定中不發(fā)色，在GDH測(cè)定中發(fā)色)的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行液體培養(yǎng)，比較GO活性及GDH活性。與未突變(PYES-GO)進(jìn)行比較，用網(wǎng)紋表示⑶H活性值及⑶H活性與GO活性之比(⑶H活性/GO活性)同時(shí)高的轉(zhuǎn)化株。表中的pYES-GO表示未突變的轉(zhuǎn)化株，表中的pYES2表示用插入基因前的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化株，表中的GO表示GO “Amano”2 (天野酶公司)，表中的FAD-GDH表示⑶H “Amano ” 8 (天野酶公司)。
[0095]圖7為表示用液體培養(yǎng)的活性確認(rèn)的結(jié)果的圖表。用條形表示各突變酶轉(zhuǎn)化株的GOH活性及GO活性，用折線表示⑶H活性/GO活性。pYES-GO表示未突變的轉(zhuǎn)化株。圖表中的pYES-GO表示未突變的轉(zhuǎn)化株，圖表中的pYES2表示用插入基因前的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化株，圖表中的GO表示GO “Amano”2 (天野酶公司)，圖表中的FAD-GDH表示⑶H “Amano”8(天野酶公司)。
[0096]圖8為表示確認(rèn)⑶H/G0活性比變化大的突變酶轉(zhuǎn)化株的突變的表。推測(cè)5-1-5的T353H起因于混合。同樣，推測(cè)7-2-17的D446S及7_2_42的D446R也起因于混合。
[0097]圖9為表示突變型GO的底物特異性的圖表。以對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性的相對(duì)值的形式，算出對(duì)各底物的反應(yīng)性。pYES-GO表示未突變的轉(zhuǎn)化株。
[0098]圖10為表示在各酶中的突變對(duì)象氨基酸的表。對(duì)各酶均表示了(I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，
(4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(10)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(11)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸，(13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸。
[0099]圖11為多重突變型GO的活性的比較。以培養(yǎng)上清為樣品，將突變組合不同的各種轉(zhuǎn)化株的GDH/G0活性比進(jìn)行比較。用〇表示各突變酶轉(zhuǎn)化株具有的突變。
[0100]圖12為具有有效突變的組合的突變酶轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的突變型酶的比活性。用〇表示各突變酶轉(zhuǎn)化株具有的突變。
[0101]圖13為具有有效突變的組合的突變酶轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的突變型酶的底物特異性。比較對(duì)麥芽糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖及乳糖的反應(yīng)性。
[0102]圖14為D446及V582多重突變酶的活性的比較。對(duì)于取代后的氨基酸不同的各種酶，比較⑶H/G0活性比。*:G0活性為檢測(cè)限以下。
[0103]圖15為D446H及V582P多重突變酶的底物特異性。將對(duì)麥芽糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖及乳糖 的反應(yīng)性與FAD-GDH (⑶H “Amano”8 (天野酶公司))進(jìn)行比較。
【具體實(shí)施方式】
[0104]為了便于說(shuō)明，對(duì)于用于本發(fā)明的用語(yǔ)的一部分，定義如下。
[0105](用語(yǔ))
[0106]用語(yǔ)“突變酶”為利用本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的方法將“基礎(chǔ)酶”進(jìn)行突變乃至修飾而得到的酶。“突變酶”、“突變型酶”及“修飾型酶”可交換使用?；A(chǔ)酶典型地為野生型酶。但是，并不妨礙將已經(jīng)被施加人工操作的酶作為“基礎(chǔ)酶”而適用于本發(fā)明。應(yīng)予說(shuō)明，在本說(shuō)明書(shū)中，“基礎(chǔ)酶”也被稱(chēng)作“突變對(duì)象酶”或“靶標(biāo)酶”。
[0107]將使某種酶(為了便于說(shuō)明稱(chēng)作A酶)與其它酶(為了便于說(shuō)明稱(chēng)作B酶)近似，SP，以使A酶的一種以上的特性與B酶的對(duì)應(yīng)特性接近的方式進(jìn)行修飾稱(chēng)作“將A酶進(jìn)行B酶化”。這里的“特性”的示例為酶活性(例如在A酶為葡萄糖氧化酶的情況下的葡萄糖氧化酶活性)、底物特異性、溫度特性(最適溫度、溫度穩(wěn)定性等)、PH特性(最適pH、pH穩(wěn)定性)、輔酶特異性、與介質(zhì)的反應(yīng)性。
[0108](使葡萄糖氧化酶進(jìn)行突變而得的酶)
[0109]本發(fā)明的第I方面涉及使來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶(GO)進(jìn)行突變而得的酶(以下也稱(chēng)作“突變G0”)。本發(fā)明突變GO具有在來(lái)自微生物的GO (突變對(duì)象酶)的氨基酸序列中選自以下(I)~(13)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列。
[0110](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0111](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸[0112](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0113](4) 與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0114](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0115](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0116](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0117](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0118](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0119](10)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0120](11)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0121](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0122](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0123]如后述實(shí)施例所示，上述115位氨基酸、131位氨基酸、132位氨基酸、193位氨基酸、353位氨基酸、436位氨基酸、446位氨基酸、472位氨基酸、511位氨基酸、535位氨基酸、537位氨基酸、582位氨基酸及583位氨基酸為通過(guò)將黑曲霉的GO與多種FAD-GDH進(jìn)行比較而發(fā)現(xiàn)的氨基酸，處于GO的活性中心附近且具有GO特征性。在本發(fā)明中，通過(guò)使被認(rèn)為對(duì)GO特性起到重要作用的與這些氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸進(jìn)行突變，從而實(shí)現(xiàn)酶特性的改良、改善。
[0124]在此，在本說(shuō)明書(shū)中對(duì)于氨基酸殘基使用時(shí)的用語(yǔ)“對(duì)應(yīng)”是指在被比較的蛋白質(zhì)(酶)間對(duì)其功能的發(fā)揮作出同等貢獻(xiàn)。例如，對(duì)于基準(zhǔn)氨基酸序列(即，序列號(hào)I的氨基酸序列)，將比較對(duì)象的氨基酸序列在考慮一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)的部分同源性的同時(shí)，以能夠進(jìn)行最優(yōu)比較的方式進(jìn)行排列時(shí)(此時(shí)可以根據(jù)需要導(dǎo)入空位(gap)而使比對(duì)最優(yōu)化)，可將與基準(zhǔn)氨基酸序列中的特定氨基酸對(duì)應(yīng)的位置的氨基酸確定為“對(duì)應(yīng)的氨基酸”。也可代替一級(jí)結(jié)構(gòu)彼此的比較而利用立體結(jié)構(gòu)(三次元結(jié)構(gòu))彼此的比較，或者不僅利用一級(jí)結(jié)構(gòu)彼此的比較，而且還利用立體結(jié)構(gòu)(三次元結(jié)構(gòu))彼此的比較，確定“對(duì)應(yīng)的氨基酸”。通過(guò)利用立體結(jié)構(gòu)信息，可得到可靠性高的比較結(jié)果。在該情況下，可采用在將多種酶的立體結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)進(jìn)行比較的同時(shí)進(jìn)行比對(duì)的方法。突變對(duì)象酶的立體結(jié)構(gòu)信息例如可由蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank) (http://www.pdbj.0rg/index_j.html)取得。
[0125]利用X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的決定方法的一例如下所示。
[0126](I)將蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶化。為了確定立體結(jié)構(gòu)，結(jié)晶化不可缺少，但除此以外，作為蛋白質(zhì)的高純度的純化法、高密度且穩(wěn)定的保存方法，也有產(chǎn)業(yè)上的有用性。在該情況下，優(yōu)選將作為配體結(jié)合有底物或者其類(lèi)似化合物的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶化。
[0127](2)對(duì)制成的結(jié)晶照射X射線，收集衍射數(shù)據(jù)。應(yīng)予說(shuō)明，蛋白質(zhì)結(jié)晶因X射線照射而受到損害并使衍射能劣化的情形有很多。在該情況下，將結(jié)晶急劇地冷卻至_173°C左右，在該狀態(tài)下收集衍射數(shù)據(jù)的低溫測(cè)定技術(shù)最近逐漸普及。應(yīng)予說(shuō)明，為了最終收集用于確定結(jié)構(gòu)的高分解能數(shù)據(jù)，亮度高的同步加速器放射光得到利用。
[0128](3)在進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析時(shí)，除了衍射數(shù)據(jù)以外，還需要相位信息。對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)，在不知道類(lèi)似的蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)，不可能用分子取代法確定結(jié)構(gòu)，必須利用重原子同晶取代法解決相位問(wèn)題。重原子同晶取代法為如下方法:將汞、鉬等原子序號(hào)大的金屬原子導(dǎo)入結(jié)晶中，利用金屬原子的大X射線散射能對(duì)X射線衍射數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)而得到相位信息的方法。決定的相位可通過(guò)將結(jié)晶中的溶劑區(qū)域的電子密度平滑化而進(jìn)行改善。溶劑區(qū)域的水分子由于波動(dòng)大而幾乎觀測(cè)不到電子密度，因此通過(guò)使該區(qū)域的電子密度近似于O，從而能夠接近真正的電子密度，乃至相位得到改善。此外，在非對(duì)稱(chēng)單元中包含多種分子時(shí)，通過(guò)將這些分子的電子密度進(jìn)行平均化，從而相位得到更大幅度的改善。使蛋白質(zhì)模型符合使用這樣改善的相位計(jì)算出的電子密度圖。該工藝在計(jì)算機(jī)繪圖的基礎(chǔ)上使用MSI公司(美國(guó))的QUANTA等程序進(jìn)行。然后，使用MSI公司的X-PLOR等程序，進(jìn)行結(jié)構(gòu)精密化，完成結(jié)構(gòu)分析。對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)，在類(lèi)似的蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)是已知的情況下，使用已知蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)，利用分子取代法可進(jìn)行決定。分子取代與結(jié)構(gòu)精密化可用程序CNS_S0LVEver.11等進(jìn)行。
[0129]突變對(duì)象酶即來(lái)自微生物的GO的示例為來(lái)自黑曲霉的GO及來(lái)自尼崎青霉的G0。在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的來(lái)自黑曲霉的GO的氨基酸序列及來(lái)自尼崎青霉的GO的氨基酸序列分別如序列號(hào)I及序列號(hào)2所示。此外，這兩種氨基酸序列的比對(duì)比較如圖1所示。
[0130]在以具有序列號(hào)I的氨基酸序列的來(lái)自黑曲霉的GO為突變對(duì)象酶時(shí)，上述(I)的氨基酸為序列號(hào)I的115位氨基酸，上述(2)的氨基酸為序列號(hào)I的131位氨基酸，上述(3)的氨基酸為序列號(hào)I的132位氨基酸，上述(4)的氨基酸為序列號(hào)I的193位氨基酸，上述
(5)的氨基酸為序列號(hào)I的353位氨基酸，上述(6)的氨基酸為序列號(hào)I的436位氨基酸，上述(7)的氨基酸為序列號(hào)I的446位氨基酸，上述(8)的氨基酸為序列號(hào)I的472位氨基酸，上述(9)的氨基酸為序列號(hào)I的511位氨基酸，上述(10)的氨基酸為序列號(hào)I的535位氨基酸，上述(11)的氨基酸為序列號(hào)I的537位氨基酸，上述(12)的氨基酸為序列號(hào)I的582位氨基酸，上述(13)的氨基酸為序列號(hào)I的583位氨基酸。
[0131]另一方面，在以具有序列號(hào)2的氨基酸序列的來(lái)自尼崎青霉的GO為突變對(duì)象酶時(shí)，上述(I)的氨基酸為序 列號(hào)2的115位氨基酸，上述(2)的氨基酸為序列號(hào)2的131位氨基酸，上述(3)的氨基酸為序列號(hào)2的132位氨基酸，上述(4)的氨基酸為序列號(hào)2的193位氨基酸，上述(5)的氨基酸為序列號(hào)2的353位氨基酸，上述(6)的氨基酸為序列號(hào)2的436位氨基酸，上述(7)的氨基酸為序列號(hào)2的446位氨基酸，上述(8)的氨基酸為序列號(hào)2的472位氨基酸，上述(9)的氨基酸為序列號(hào)2的511位氨基酸，上述(10)的氨基酸為序列號(hào)2的535位氨基酸，上述(11)的氨基酸為序列號(hào)2的537位氨基酸，上述(12)的氨基酸為序列號(hào)2的582位氨基酸，上述(13)的氨基酸為序列號(hào)2的583位氨基酸。
[0132]被取代的氨基酸優(yōu)選為(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸。這些如后述實(shí)施例所示，為對(duì)⑶H活性的提高有效得到確認(rèn)的氨基酸。在這些氨基酸中的至少一個(gè)被取代的突變GO中，與突變前的酶相比能夠發(fā)揮高的GDH活性。(3)的氨基酸被取代的突變GO的具體例為由序列號(hào)7的氨基酸序列所構(gòu)成的酶。同樣，(5)的氨基酸被取代的突變GO的具體例為由序列號(hào)8的氨基酸序列所構(gòu)成的酶，(7)的氨基酸被取代的突變GO的具體例為由序列號(hào)9的氨基酸序列所構(gòu)成的酶，(12)的氨基酸被取代的突變GO的具體例為由序列號(hào)10的氨基酸序列所構(gòu)成的酶。這些突變GO均與突變前的酶即來(lái)自黑曲霉的GO相比顯示出高的⑶H活性。
[0133]取代后的氨基酸的種類(lèi)沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選以不屬于所謂“保守性氨基酸取代”的方式，選擇取代后的氨基酸。這里的“保守性氨基酸取代”是指將某種氨基酸殘基取代成具有同樣性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈而分成堿性側(cè)鏈(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸，苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)之類(lèi)的若干族。保守性氨基酸取代典型地為同一族內(nèi)的氨基酸殘基間的取代。
[0134]若舉出取代后的氨基酸的示例，對(duì)于(3)的氨基酸而言為丙氨酸，對(duì)于(5)的氨基酸而言為丙氨酸，對(duì)于(7)的氨基酸而言為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸而言為絲氨酸，精氨酸、亮氨酸及脯氨酸。
[0135]上述(I)~(13)的氨基酸內(nèi)，兩種以上的氨基酸可得到取代。如下列舉出被取代的氨基酸的組合的示例。
[0136](3)與(5)的組合
[0137](3)與(7)的組合
[0138](3)與(12)的組合
[0139](5)與(7)的組合
[0140](5)與(12)的組合 [0141](7)與(12)的組合
[0142](3)、(5)與(7)的組合
[0143](3)、(5)與(12)的組合
[0144](3)、(7)與(12)的組合
[0145](5)、(7)與(12)的組合
[0146](3)、(5)、(7)與(12)的組合
[0147]應(yīng)用以上的組合而得到的突變酶的氨基酸序列的示例如序列號(hào)11~21所示。這些序列為針對(duì)黑曲霉的GO應(yīng)用上述組合而得到的突變GO的氨基酸序列。序列號(hào)與突變的組合的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下所述。
[0148]序列號(hào)11: (3)與(5)的組合
[0149]序列號(hào)12: (3)與(7)的組合
[0150]序列號(hào)13: (3)與(12)的組合
[0151]序列號(hào)14: (5)與(7)的組合
[0152]序列號(hào)15: (5)與(12)的組合
[0153]序列號(hào)16: (7)與(12)的組合
[0154]序列號(hào)17: (3)、(5)與(7)的組合
[0155]序列號(hào)18: (3)、(5)與(12)的組合
[0156]序列號(hào)19: (3)、(7)與(12)的組合
[0157]序列號(hào)20: (5)、(7)與(12)的組合
[0158]序列號(hào)21: (3)、(5)、(7)與(12)的組合
[0159]序列號(hào)59: (7)與(12)的組合
[0160]序列號(hào)60: (7)與(12)的組合
[0161]序列號(hào)61: (7)與(12)的組合
[0162]若按照后述實(shí)施例(確認(rèn)突變組合的效果)中表示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則在以上組合中，優(yōu)選(3)與(12)的組合，(7)與(12)的組合，及(3)、(7)與(12)的組合。特別優(yōu)選的組合為(7)與(12)的組合(該組合的突變酶的氨基酸序列的具體例如上所述為序列號(hào)16、59~61)。取代后的氨基酸對(duì)于(7)而言?xún)?yōu)選組氨酸，對(duì)于(12)而言?xún)?yōu)選絲氨酸(序列號(hào)16)、精氨酸(序列號(hào)59 )、亮氨酸(序列號(hào)60 )或脯氨酸(序列號(hào)61)。對(duì)于(12 )，特別優(yōu)選取代后的氨基酸為脯氨酸。
[0163]不過(guò)，一般而言，在使某種蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分進(jìn)行突變時(shí)，有時(shí)突變后的蛋白質(zhì)具有與突變前的蛋白質(zhì)同等的功能。即，有時(shí)氨基酸序列的突變對(duì)于蛋白質(zhì)的功能未帶來(lái)實(shí)質(zhì)性的影響，蛋白質(zhì)的功能在突變前后得以維持。若考慮到該技術(shù)常識(shí)，則在與由選自上述(I)~(13)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列所構(gòu)成的突變GO進(jìn)行比較時(shí)，雖然氨基酸序列的稍微不同未被確認(rèn)(其中，氨基酸序列的不同在實(shí)施了上述氨基酸取代的位置以外的位置發(fā)生)，但是特性中實(shí)質(zhì)性的差異未被確認(rèn)的酶可被認(rèn)為是與上述突變GO實(shí)質(zhì)同一的酶。這里的“氨基酸序列的稍微不同”典型地是指利用構(gòu)成氨基酸序列的I~數(shù)個(gè)(上限為例如3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè))氨基酸的缺失、取代，或者I個(gè)~數(shù)個(gè)(上限為例如3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè))氨基酸的添加、插入、或這些組合而在氨基酸序列中產(chǎn)生突變(變化)?！皩?shí)質(zhì)同一的酶”的氨基酸序列與作為基準(zhǔn)的上述突變GO的氨基酸序列的同一性(％)優(yōu)選為90%以上，更優(yōu)選為95%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上，最優(yōu)選為99%以上。應(yīng)予說(shuō)明，氨基酸序列的不同可以在多個(gè)位置產(chǎn)生?！鞍被嵝蛄械纳晕⒉煌眱?yōu)選由保守性氨基酸取代產(chǎn)生。
[0164](編碼突變GO的核酸等)
[0165]本發(fā)明的第2方面提供與本發(fā)明突變GO相關(guān)的核酸。即，提供能夠作為用于鑒別編碼突變GO的基因、編碼突變GO的核酸的探針使用的核酸；能夠作為用于使編碼突變GO的核酸擴(kuò)增或突變等的引 物使用的核酸。
[0166]編碼突變GO的基因典型地用于突變GO的制備。根據(jù)使用編碼突變GO的基因的基因工程學(xué)的制備方法，可得到更均質(zhì)狀態(tài)的突變G0。此外，該方法在制備大量的突變GO時(shí)也可以說(shuō)是優(yōu)選的方法。此外，編碼突變GO的基因的用途不限于突變GO的制備。例如，作為以突變GO作用機(jī)制的解釋等為目的的實(shí)驗(yàn)用工具，或者作為用于設(shè)計(jì)或制作酶的進(jìn)一步的突變體的工具，也可利用該核酸。
[0167]在本說(shuō)明書(shū)中，所謂“編碼突變GO的基因”是指在使該基因表達(dá)時(shí)得到該突變GO的核酸，當(dāng)然包含具有與該突變GO的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列的核酸，還包含在這種核酸中附加有不編碼氨基酸序列的序列而成的核酸。此外，還考慮密碼子的簡(jiǎn)并。
[0168]編碼突變GO的基因的序列的示例如序列號(hào)22~36、62~64所示。這些序列為編碼在黑曲霉的GO中實(shí)施了特定的氨基酸取代而得的突變GO的基因。各序列中的氨基酸取代如下所述。
[0169]序列號(hào)22:T132A
[0170]序列號(hào)23 =T353A
[0171]序列號(hào)24:D446H
[0172]序列號(hào)25:V582S
[0173]序列號(hào)26:T132A 及 T353A
[0174]序列號(hào)27:T132A 及 D446H[0175]序列號(hào)28:T132A 及 V582S
[0176]序列號(hào)29:T353A 及 D446H
[0177]序列號(hào)30:T353A 及 V582S
[0178]序列號(hào)31:D446H 及 V582S
[0179]序列號(hào)32:T132A、T353A 及 D446H
[0180]序列號(hào)33:T132A、T353A 及 V582S
[0181]序列號(hào)34:T132A、D446H 及 V582S
[0182]序列號(hào)35:T353A、D446H 及 V582S
[0183]序列號(hào)36:T132A、T353A、D446H 及 V582S
[0184]序列號(hào)62:D446H 及 V582R
[0185]序列號(hào)63:D446H 及 V582L
[0186]序列號(hào)64:D446H 及 V582P
[0187]本發(fā)明的核 酸可參考本說(shuō)明書(shū)或所附序列表公開(kāi)的序列信息，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法等，制備成分離狀態(tài)。
[0188]在本發(fā)明的其它方式中，提供了一種核酸，其在與編碼本發(fā)明突變GO的基因的堿基序列相比時(shí)，雖然其編碼的蛋白質(zhì)的功能相同，但是一部分堿基序列不同(以下，也稱(chēng)作“同源核酸”。此外，將規(guī)定同源核酸的堿基序列也稱(chēng)作“同源堿基序列”)。作為同源核酸的示例，可舉出如下編碼如下蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)由以編碼本發(fā)明突變GO的核酸的堿基序列為基準(zhǔn)來(lái)包含I個(gè)或者多個(gè)堿基的取代、缺失、插入、添加、或倒位的堿基序列所構(gòu)成，且具有突變GO特征性的酶活性(即，GDH活性)。堿基的取代、缺失等可在多個(gè)部位產(chǎn)生。這里的“多個(gè)”根據(jù)該核酸編碼的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基的位置、種類(lèi)不同而異，例如為2~40個(gè)堿基，優(yōu)選為2~20個(gè)堿基，更優(yōu)選為2~10個(gè)堿基。
[0189]如上所述的同源核酸例如可以如下得到:限制性?xún)?nèi)切酶處理；利用核酸外切酶、DNA連接酶等的處理；利用定位突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning, Third Edition,Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、隨機(jī)突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapterl3, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)的突變導(dǎo)入等。此外,通過(guò)紫外線照射等其它方法也可得到同源核酸。
[0190]本發(fā)明的其它方式涉及一種核酸，其具有相對(duì)于編碼本發(fā)明突變GO的基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。本發(fā)明的進(jìn)一步其它方式提供一種核酸，其具有相對(duì)于編碼本發(fā)明突變GO的基因的堿基序列或者與其互補(bǔ)的堿基序列為至少約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一的喊基序列。
[0191]本發(fā)明的進(jìn)一步其它方式涉及一種核酸，其具有相對(duì)于編碼本發(fā)明突變GO的基因的喊基序列或與其同源喊基序列互補(bǔ)的喊基序列在嚴(yán)謹(jǐn)型條件下進(jìn)行雜交的喊基序列。這里的“嚴(yán)謹(jǐn)型條件”是指形成所謂特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。這樣的嚴(yán)謹(jǐn)型條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如可參照Molecular Cloning (Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、 Current protocols in molecularbiology (edited by Frederick M.Ausubel et al., 1987)進(jìn)行設(shè)定。作為嚴(yán)謹(jǐn)型條件，例如可舉出用雜交液(50% 甲醛、10XSSC(0.15M NaCl、15mM 檸檬酸鈉，pH7.0)、5XDenhardt溶液、1%SDS、10%硫酸葡聚糖、10μ g/ml的變性鮭魚(yú)精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7.5)),在約42°C~約50°C下進(jìn)行溫育，然后用0.1XSSC、0.1%SDS在約65°C~約70°C下清洗的條件。作為進(jìn)一步優(yōu)選的嚴(yán)謹(jǐn)型條件，例如可舉出，作為雜交液，使用50%甲醛、5XSSC(0.15MNaClU5mM 檸檬酸鈉，pH7.0)、I XDenhardt 溶液、1%SDS、10% 硫酸葡聚糖、10 μ g/ml 的變性鮭魚(yú)精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7.5))的條件。
[0192]本發(fā)明的進(jìn)一步其它方式提供了一種核酸(核酸片段)，其具有編碼本發(fā)明突變GO的基因的堿基序列或者與其互補(bǔ)的堿基序列的一部分。這種核酸片段可用于將具有編碼本發(fā)明突變GO的基因的堿基序列的核酸等進(jìn)行檢測(cè)、鑒別和/或擴(kuò)增等。核酸片段例如以如下方式設(shè)計(jì):在編碼本發(fā)明突變GO的基因的堿基序列中連續(xù)的核苷酸部分(例如約10~約100堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選約20~約100堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選約30~約100堿基長(zhǎng)度)中至少包含雜交部分。在用作探針時(shí)，可標(biāo)記核酸片段。在標(biāo)記中例如可使用熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素。
[0193]本發(fā)明的進(jìn)一步其它方式涉及包含本發(fā)明的基因(編碼突變GO的基因)的重組DNA。本發(fā)明的重組DNA例如以載體的形態(tài)提供。在本說(shuō)明書(shū)中用語(yǔ)“載體”是指能夠?qū)⒉迦肫渲械暮怂彷斔偷桨袠?biāo)內(nèi)的核酸性分子。
[0194]根據(jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達(dá))，此外考慮宿主細(xì)胞的種類(lèi)而選擇適當(dāng)?shù)妮d體。作為大腸菌為宿主的載體，可例示M13噬菌體或其修飾體、λ噬菌體或其修飾體、pBR322或其修飾體(pB325、pAT153、pUC8等)等，作為以酵母為宿主的載體，可例示pYepSecUpMFa, pYES2等，作為以昆蟲(chóng)細(xì)胞為宿主的載體，可例示pAc、pVL等，作為以哺乳類(lèi)細(xì)胞為宿主的載體，可例示PCDM8、pMT2PC等。
[0195]本發(fā)明的載體優(yōu)選為表達(dá)載體?！氨磉_(dá)載體”是指能夠?qū)⒉迦肫渲械暮怂釋?dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)，且能夠使之在該細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常包含對(duì)所插入的核酸的表達(dá)必需的啟動(dòng)子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。也可以使用包含選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。在使用該表達(dá)載體時(shí)，可利用選擇標(biāo)記而確認(rèn)表達(dá)載體導(dǎo)入的有無(wú)(及其程度)。
[0196]本發(fā)明的核酸向載體的插入、選擇標(biāo)記基因的插入(必要時(shí))、啟動(dòng)子的插入(必要時(shí))等可使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(例如，可參照Molecular Cloning, Third Edition, 1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 的、使用限制性?xún)?nèi)切酶及 DNA 連接酶的公知方法)進(jìn)行。
[0197]作為宿主細(xì)胞，從操作容易方面考慮，優(yōu)選使用大腸菌(Escherichia coli)、芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物，但只要是重組DNA可復(fù)制且突變GO的基因可表達(dá)的宿主細(xì)胞則可利用。作為大腸菌的示例，在利用T7系啟動(dòng)子時(shí)，可舉出大腸菌BL21(DE3)pLysS，在并非這樣時(shí)可舉出大腸菌JM109。此外，作為芽殖酵母的示例，可舉出芽殖酵母SHY2、芽殖酵母AH22或者芽殖酵母INVScl (Invitrogen公司)。
[0198]本發(fā)明的其它方面涉及具有本發(fā)明重組DNA的微生物(B卩，轉(zhuǎn)化體)。本發(fā)明的微生物可利用使用上述本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)染乃至轉(zhuǎn)化而得到。例如，可利用氯化鈣法(Journalof Molecular Biology (J.Mol.Biol.)、第 53 卷，第 159 頁(yè)(1970))、Hanahan 法(Journalof Molecular Biology,第 166 卷，第 557 頁(yè)(1983))、SEM 法(基因(Gene),第 96 卷，第23 頁(yè)(1990)〕，Chung 等的方法(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,第 86 卷,第 2172 頁(yè)(1989))、憐酸鈣共沈降法、電穿孔(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81, 7161-7165 (1984))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Feigner, P.L.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84, 7413-7417 (1984))等實(shí)施。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明的微生物可用于生產(chǎn)本發(fā)明的突變GO (參照后述突變酶的制備方法欄)。
[0199](突變GO的用途)
[0200]本發(fā)明的第3方式涉及突變GO的用途。在該方式中，首先提供了使用突變GO的葡萄糖測(cè)定法。在本發(fā)明的葡萄糖測(cè)定法中，利用由本酶所致的氧化還原反應(yīng)，測(cè)定試樣中的葡萄糖量。本發(fā)明例如用于血糖值的測(cè)定、食品(調(diào)味料、飲料等)中的葡萄糖濃度的測(cè)定等。此外，在發(fā)酵食品(例如食醋)或發(fā)酵飲料(例如啤酒、酒)的制造工序中為了研究發(fā)酵度，也可利用本發(fā)明。
[0201]本發(fā)明還提供了包含本酶的葡萄糖測(cè)定用試劑。該試劑用于上述本發(fā)明的葡萄糖測(cè)定法中。
[0202]本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于實(shí)施本發(fā)明的葡萄糖測(cè)定法的試劑盒(葡萄糖測(cè)定用試劑盒)。本發(fā)明的試劑盒除了包含本酶的葡萄糖測(cè)定用試劑以外，還包含反應(yīng)用試劑、緩沖液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液等作為任意要素。此外，在本發(fā)明的葡萄糖測(cè)定試劑盒中通常附有使用說(shuō)明書(shū)。
[0203]本發(fā)明作為進(jìn)一步的用途，提供了通過(guò)使本發(fā)明的突變GO對(duì)工業(yè)制品(各種加工食品、點(diǎn)心類(lèi)、清涼飲料水、醇飲料、營(yíng)養(yǎng)輔助食品等食品；化妝材料等)或其原料等進(jìn)行作用而使葡萄糖含量降低的方法及用于該用途的酶劑。例如，在將本發(fā)明突變GO應(yīng)用于食品時(shí)，可通過(guò)降低葡萄糖含量而抑制美拉德反應(yīng)。本發(fā)明的酶劑除了有效成分(突變G0)以外，還可含有賦形劑、緩沖劑、混懸劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等。作為賦形劑，可使用淀粉、糊精、麥芽糖、 海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨醇、D-甘露糖醇、白糖、甘油等。作為緩沖劑，可使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑，可使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可使用乙醇、苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等。
[0204](突變酶的設(shè)計(jì)方法)
[0205]本發(fā)明的另一方面涉及突變酶的設(shè)計(jì)方法。在本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法中，實(shí)施以下步驟(i)及(ii)。
[0206]步驟(i):在來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶(來(lái)自微生物的G0)或來(lái)自微生物的黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶(來(lái)自微生物的FDA-GDH)即突變對(duì)象酶的氨基酸序列中，確定選自如下的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸。
[0207](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0208](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0209](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0210](4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0211](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0212](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0213](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0214](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0215](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸[0216](10)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0217](11)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0218](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0219](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸
[0220]上述取代對(duì)象氨基酸(I)~(13)是利用來(lái)自微生物的GO與多種來(lái)自微生物的FAD-GDH的比較而發(fā)現(xiàn)的。期待通過(guò)取代這些氨基酸而使酶的特性發(fā)生變化。若列舉能夠變化的特性的示例，則為GO活性、GDH活性、底物特異性、溫度特性(最適溫度、溫度穩(wěn)定性等)、pH特性(最適pH、pH穩(wěn)定性)、輔酶特異性、與介質(zhì)的反應(yīng)性。
[0221]本發(fā)明設(shè)計(jì)方法中的突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的GO或來(lái)自微生物的FAD-GDH。突變對(duì)象酶典型地為野生型酶(天然發(fā)現(xiàn)的酶)。但是，并不妨礙以已經(jīng)實(shí)施有某種突變乃至修飾的酶為突變對(duì)象酶。來(lái)自微生物的GO的示例為黑曲霉的GO及尼崎青霉的G0，來(lái)自微生物的FAD-GDH的示例為意大利青霉的FAD-GDH、薄刺青霉的FAD-GDH、米曲霉的FAD-GDH及土曲霉的FAD-GDH。作為在此例示的酶的氨基酸序列，在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的序列如下所示。應(yīng)予說(shuō)明，在優(yōu)選的一個(gè)方式中，以由其中的任意氨基酸序列所構(gòu)成的酶作為突變對(duì)象酶。
[0222]黑曲霉(Aspergillus niger)的GO:序列號(hào)I的氨基酸序列
[0223]尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)的GO:序列號(hào)2的氨基酸序列
[0224]意大利青霉(Penicillium italicum)的FAD-GDH:序列號(hào)3的氨基酸序列
[0225]薄刺青霉(PenicilliumIilacinoechinulatumMtJFAD-GDH:序列號(hào) 4 的氨基酸序列
[0226]米曲霉(Aspergillus oryzae)的FAD-GDH:序列號(hào)5的氨基酸序列
[0227]土曲霉(Aspergillus terreus)的FAD-GDH:序列號(hào)6的氨基酸序列
[0228]應(yīng)予說(shuō)明，對(duì)于以上例示的各酶，將屬于上述(I)~(13)的氨基酸的氨基酸匯總不于圖10的表中。
[0229]本發(fā)明中在步驟(i)后，進(jìn)行以下步驟(ii)。
[0230]步驟(ii ):基于突變對(duì)象酶的氨基酸序列，構(gòu)成在步驟(? )中確定的氨基酸序列被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
[0231]取代后的氨基酸的種類(lèi)沒(méi)有特別限定。因此，可以為保守性氨基酸取代，也可以為非保守性氨基酸取代。這里的“保守性氨基酸取代”是指將某種氨基酸殘基取代成具有同樣性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈可分成堿基性側(cè)鏈(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非帶電極性側(cè)鏈(例如天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)之類(lèi)的若干族。保守性氨基酸取代優(yōu)選為同一族內(nèi)的氨基酸殘基間的取代。
[0232](突變酶的制備方法)
[0233]本發(fā)明的另一方式涉及突變酶的制備方法。在本發(fā)明的突變酶制備方法的一個(gè)方式中，將本發(fā)明的發(fā)明人等成功取得的突變GO用基因工程學(xué)方法進(jìn)行制備。在該方式的情況下，準(zhǔn)備編碼序列號(hào)7~10的任意氨基酸序列的核酸(步驟(1))。在此，“編碼特定的氨基酸序列的核酸”是在使之表達(dá)的情況下可得到具有該氨基酸序列的多肽的核酸，當(dāng)然可以是由與該氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列所構(gòu)成的核酸，也可以在這樣的核酸中添加多余的序列(可以為編碼氨基酸序列的序列，也可以為不編碼氨基酸序列的序列)。此外，還考慮到密碼子的簡(jiǎn)并。“編碼序列號(hào)7~10的任意氨基酸序列的核酸”為參考本說(shuō)明書(shū)或所附序列表公開(kāi)的序列信息，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法等，可制備成分離狀態(tài)。在此，序列號(hào)7~10的氨基酸序列均為對(duì)來(lái)自黑曲霉的GO的氨基酸序列實(shí)施突變而得的。因此，對(duì)于編碼來(lái)自黑曲霉的GO的基因(序列號(hào)38)，通過(guò)施加必要的突變，也可得到編碼序列號(hào)7~10中的任意氨基酸序列的核酸(基因)。用于位置特異性堿基序列取代的方法在該【技術(shù)領(lǐng)域】中已知有很多(例如，參照Molecular Cloning, ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),可由其中選擇使用恰當(dāng)?shù)姆椒āＷ鳛槲恢锰禺愋酝蛔儗?dǎo)入法，可采用位置特異性氨基酸飽和突變法。位置特異性氨基酸飽和突變法為基于蛋白的立體結(jié)構(gòu)，推定所要求的功能的關(guān)聯(lián)位置，導(dǎo)入氨基酸飽和突變的“半推理半隨機(jī)(Sem1-rational, sem1-random)” 方法(J.Mol.Biol.331, 585-592(2003))。例如，可使用 Quick change (Stratagene 公司)等試劑盒、Overlap extentionPCR (Nucleic Acid Res.16,7351-7367 (1988))而導(dǎo)入位置特異性氨基酸飽和突變。用于PCR的DNA聚合酶可使用Taq聚合酶等。但是，優(yōu)選使用K0D-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(Stratagene公司)等精度高的DNA聚合酶。
[0234]在本發(fā)明的其它一方式中，基于利用本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列而制備突變酶。在該方式的情況下，在步驟(1)中準(zhǔn)備將利用本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法而構(gòu)建的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核酸。例如，基于利用本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列，對(duì)于編碼突變對(duì)象酶的基因施加必要的突變(即，在表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)中的特定位置的氨基酸的取代)，得到編碼突變酶的核酸(基因)。
[0235]步驟(1)之后 ，使準(zhǔn)備的核酸進(jìn)行表達(dá)(步驟(II))。例如，首先，準(zhǔn)備插入了上述核酸而得的表達(dá)載體，使用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?！氨磉_(dá)載體”是指可將插入其中的核酸導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)，且可在該細(xì)胞內(nèi)使之表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常包含對(duì)插入的核酸的表達(dá)必要的啟動(dòng)子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。也可使用包含選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。在使用該表達(dá)載體時(shí)，可利用選擇標(biāo)記而確認(rèn)表達(dá)載體導(dǎo)入的有無(wú)(及其程度)。
[0236]接著，在產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物即突變酶的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)按照常規(guī)方法即可。作為用于培養(yǎng)基的碳源，只要是可同化的碳化合物即可，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糖蜜、丙酮酸等。此外，作為氮源，只要是可利用的氮化合物即可，例如使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆渣堿提取物等。除此以外，根據(jù)需要使用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等的鹽類(lèi)；特定的氨基酸；特定的維生素等。
[0237]另一方面，培養(yǎng)溫度可設(shè)定在30°C~40°C的范圍內(nèi)(優(yōu)選37°C附近)。培養(yǎng)時(shí)間可考慮培養(yǎng)對(duì)象的轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)特性、突變型酶的產(chǎn)生特性等而進(jìn)行設(shè)定。培養(yǎng)基的PH在生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體且產(chǎn)生酶的范圍內(nèi)調(diào)制。優(yōu)選將培養(yǎng)基的pH設(shè)為6.0~9.0左右(優(yōu)選pH7.0附近)。
[0238]接著，回收表達(dá)產(chǎn)物(突變酶)(步驟(III))?？梢詫⑴囵B(yǎng)后的包含菌體的培養(yǎng)液直接作為酶溶液利用，或者經(jīng)過(guò)濃縮、雜質(zhì)的除去等后作為酶溶液利用，但是一般而言，將表達(dá)產(chǎn)物從培養(yǎng)液或菌體中暫時(shí)回收。若表達(dá)產(chǎn)物為分泌型蛋白質(zhì)，則從培養(yǎng)液中回收，除此以外，可從菌體內(nèi)回收。在從培養(yǎng)液中回收時(shí)，例如將培養(yǎng)上清進(jìn)行過(guò)濾、離心處理而除去不溶物，然后將減壓濃縮、膜濃縮、利用硫酸銨、硫酸鈉的鹽析、利用甲醇、乙醇或丙酮等的分步沉淀法、透析、加熱處理、等電點(diǎn)處理、凝膠過(guò)濾、吸附色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等各種色譜法(例如，利用葡聚糖凝膠(GE Healthcare Bioscience公司)等的凝膠過(guò)濾，DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B (GE Healthcare Bioscience公司)，辛基瓊脂糖凝膠CL-6B(GE Healthcare Bioscience 公司)，CM 瓊脂糖凝膠 CL-6B (GE Healthcare Bioscience 公司))等組合而進(jìn)行分離、純化，從而得到突變酶的純化品。另一方面，在從菌體內(nèi)回收時(shí)，通過(guò)將培養(yǎng)液進(jìn)行過(guò)濾、離心處理等，采集菌體，接著將菌體用加壓處理、超聲波處理等機(jī)械方法或者利用溶酶體等的酶法進(jìn)行破壞后，與上述同樣進(jìn)行分離、純化，從而可得到突變酶的純化品。
[0239]也 可將如上所述得到的純化酶例如利用冷凍干燥、真空干燥或者噴霧干燥等粉末化而進(jìn)行提供。此時(shí)，可預(yù)先使純化酶預(yù)溶解于磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、tris鹽酸緩沖液、GOOD的緩沖液中?？蓛?yōu)選使用磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液。應(yīng)予說(shuō)明，在此，作為GOOD的緩沖液，可舉出PIPES、MES或MOPS。
[0240]通常，如上所述利用適當(dāng)?shù)乃拗?載體系而進(jìn)行基因的表達(dá)~表達(dá)產(chǎn)物(突變酶)的回收，但是也可利用無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)。在此，“無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)(無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng))”是指不使用活細(xì)胞，而是使用來(lái)自活細(xì)胞的(或者用基因工程學(xué)方法得至1J)核糖體、轉(zhuǎn)錄翻譯因子等，從模板核酸(DNA、mRNA)體外合成其編碼的mRNA、蛋白質(zhì)。在無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)中一般使用將細(xì)胞破碎液根據(jù)需要進(jìn)行純化而得的細(xì)胞提取液。在細(xì)胞提取液中一般包含對(duì)蛋白質(zhì)合成必要的核糖體、起始因子等各種因子、tRNA等各種酶。在進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成時(shí)，在該細(xì)胞提取液中添加各種氨基酸、ATP、GTP等能量源、肌酸磷酸等對(duì)蛋白質(zhì)的合成必要的其它物質(zhì)。當(dāng)然，在合成蛋白質(zhì)時(shí)，可根據(jù)需要補(bǔ)充另行準(zhǔn)備的核糖體、各種因子、和/或各種酶等。
[0241]也報(bào)告了再構(gòu)成對(duì)蛋白質(zhì)合成必要的各分子(因子)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)(Shimizu, Y.et al.:Nature Biotech.，19，751-755，2001 )。在該合成系中，將構(gòu)成細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的3種起始因子、3種類(lèi)的伸長(zhǎng)因子、參與終止的4種因子、使各氨基酸與tRNA結(jié)合的20種氨基酸酰基tRNA合成酶，及由甲硫氨酰tRNA甲?；D(zhuǎn)移酶構(gòu)成的31種因子的基因從大腸菌基因組進(jìn)行擴(kuò)增，使用這些，體外再構(gòu)成蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。在本發(fā)明中可利用這樣的再構(gòu)成合成系統(tǒng)。
[0242]用語(yǔ)“無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)”可與無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、體外翻譯系統(tǒng)或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)交換使用。在體外翻譯系中，RNA被用作模板而合成蛋白質(zhì)。作為模板RNA，使用總RNA、mRNA、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等。在另外的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中DNA被用作模板。模板DNA應(yīng)當(dāng)包含核糖體結(jié)合區(qū)域，此外優(yōu)選包含恰當(dāng)?shù)慕K止序列。應(yīng)予說(shuō)明，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，以轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及翻譯反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行的方式，設(shè)定對(duì)各反應(yīng)必要的因子被添加的條件。
[0243]在創(chuàng)造實(shí)用性高的GDH這樣的目標(biāo)下，摸索出代替以往的方法(將現(xiàn)有的GDH進(jìn)行修飾的方法、以篩選為中心的方法)的新方法。首先著眼于沒(méi)有FAD-GDH特有的問(wèn)題(針對(duì)木糖的反應(yīng)性比較高，最適溫度高)的葡萄糖氧化酶(G0)。已知GO與FAD-GDH的氨基酸序列的同源性比較高。采用如下新方法:重視該同源性，對(duì)GO賦予GDH活性，即，利用修飾將GO進(jìn)行⑶H化。
[0244]1.GO與FAD-GDH的比對(duì)比較
[0245]從來(lái)自黑曲霉的GO與來(lái)自目前氨基酸序列已知的米曲霉、土曲霉、意大利青霉、薄刺青霉的FAD-GDH的比對(duì)比較，以及立體結(jié)構(gòu)明確的來(lái)自黑曲霉的GO的立體結(jié)構(gòu)來(lái)看，在處于GO的活性中心附近的氨基酸中，在FAD-GDH間保守(共同性高)，但是在GO與FAD-GDH之間檢索出不同的氨基酸(圖2、3)。應(yīng)予說(shuō)明，在比對(duì)比較中，設(shè)有在ClustalW2(EMBL (European Molecular Biology Laboratory) -EBI (European BioinformaticsInstitute)的主頁(yè)內(nèi)專(zhuān)用的位點(diǎn)。使用 http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index,html)。
[0246]以利用檢索確定的13 個(gè)的氨基酸(L115、G131、T132、V193、T353、F436、D446、Y472、I511、P535、Y537、V582、M583)為突變導(dǎo)入對(duì)象。
[0247]2.GO基因的取得、突變導(dǎo)入及平板測(cè)定法
[0248]對(duì)于GO基因，過(guò)去沒(méi)有在大腸菌中表達(dá)的報(bào)告，因此決定在pYES2 (Invitrogen公司)的HindII1-XhoII部分中插入GO基因，以釀酒酵母(S.cerevisiae)為宿主，使之進(jìn)行表達(dá)。
[0249]從黑曲霉G0-1號(hào)菌(天野酶公司擁有)用Gen Elute Plant Genomic DNA kit(Sigma公司)提取基因組DNA后，利用PCR取得GO基因。以下，表示PCR的條件。
[0250](反應(yīng)液的組成)
[0251]10 X LA 緩沖液(Takara-bio 株式會(huì)社)5 μ L
[0252]2.5mM dNTPs (Takara-bio 株式會(huì)社)8 μ L
[0253]25mM MgCl2 (Takara-bio 株式會(huì)社)5 μ L
[0254]正向引物(50μ M) IyL
[0255]反向引物(50μ M) IyL
[0256]模板I μ L
[0257]LA Taq (Takara-bio 株式會(huì)社)0.5 μ L
[0258]StH2O 28.5 μ L
[0259](引物序列)
[0260]正向引物:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG (序列號(hào) 39)
[0261 ]反向引物:GATCAGCTCGAGTCACTGCATGGAAGCATAATC (序列號(hào) 40 )
[0262](反應(yīng)條件)
[0263]于94°C反應(yīng)2分鐘后，將于94°C反應(yīng)30秒、于52°C反應(yīng)30秒、于72°C反應(yīng)2分鐘的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)35次，然后于72°C反應(yīng)7分鐘，最后于4°C放置。
[0264]將PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物插入pYES2，制成pYES-GO-K-P-2質(zhì)粒，確認(rèn)了插入物的序列(圖4)。由于序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，因此以構(gòu)建的pYES-GO-K-P-2質(zhì)粒為模板，基于以將L115、G131、T132、V193、T353、F436、D446、Y472、1511、P535、Y537、V582、M583 分別取代成多種氨基酸的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)的下述合成寡聚核苷酸及與其互補(bǔ)的合成寡聚核苷酸，使用QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit (Stratagene 公司)，按照所附方案進(jìn)行突變操作，構(gòu)建具有突變葡萄糖氧化酶的質(zhì)粒。
[0265]G0-L115-突變用引物:CCACCAACAATCAGACTGCGNNNATC CGCTCCGGAAATGG (序列號(hào)41)
[0266]GO-Gl31-突變用引物:GCTCTACCCTCGTCAACGGTNNNACC TGGACTCGCCCC (序列號(hào) 42)
[0267]G0-T132-突變用引物:CTCGTCAACGGTGGCNNNTGGACTCG CCCCCAC (序列號(hào) 43)
[0268]G0-V193-突變用引物:CATGGTATCAATGGTACTNNNCACGC CGGACCCCGCG (序列號(hào) 44)
[0269]G0-T353-突變用引物:CAACCTTCAGGACCAGACCNNNTCTA CCGTCCGCTCAC (序列號(hào) 45)
[0270]G0-F436-突變用引物:GTCGCATACTCGGAACTCNNNCTCGA CACGGCCGGAG (序列號(hào) 46)
[0271]G0-D446-突變用引物:GCCGGAGTGGCCAGTTTCNNNGTGTG GGATCTTCTGC (序列號(hào) 47)
[0272]G0-Y472-突變用引物:CATCCTCCGCCATTTCGCANNNGACC CTCAGTACTTTCTCAAC (序列號(hào)48)
[0273]G0-1551-突變用引物:CTTATTTCGCTGGAGAGACTNNNCCCG GTGACAACCTCGC (序列號(hào)
49)
[0274]G0-P535-突變用引物:CCCGTACAACTTCCGCNNNAACTACC ATGGTGTGGGTACTTG(序列號(hào)
50)
[0275]G0-Y537-突變 用引物:GTACAACTTCCGCCCTAACNNNCATG GTGTGGGTACTTGCTC(序列號(hào)
51)
[0276]G0-V582-突變用引物:CTACGCAAATGTCGTCCCATNNNATG ACGGTCTTTTATGCCATGG (序列號(hào)52)
[0277]G0-M583-突變用引物:CTACGCAAATGTCGTCCCATGTTNNN ACGGTCTTTTATGCCATGG (序列號(hào)53)
[0278]將突變導(dǎo)入后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸菌DH5CI中后，進(jìn)行質(zhì)粒提取，制作突變文庫(kù)。將所得文庫(kù)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVScKlnvitrogen公司)中，將生長(zhǎng)的菌落復(fù)制到表達(dá)平板后，用平板測(cè)定法確認(rèn)表達(dá)及突變導(dǎo)入(圖5)。對(duì)于F436，無(wú)法確認(rèn)突變酶轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)。應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)操作參考PYES2的手冊(cè)。
[0279]平板測(cè)定方法
[0280]將各發(fā)色液浸潰于80mm的濾紙后，載置于平板上，確認(rèn)發(fā)色。
[0281]〈G0 測(cè)定〉
[0282]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 20mL
[0283]10% 葡萄糖 5mL
[0284]25u/mL PO “Amano”3 (天野酶公司)5mL
[0285]鄰聯(lián)茴香胺(o-7 二 'y' >) 5mg
[0286]〈⑶H測(cè)定〉
[0287]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 23mL
[0288]10% 葡萄糖 5mL
[0289]3mmol/Ll-甲氧基 PMS ImL
[0290]6.6mmol/L NTB ImL
[0291]3.液體培養(yǎng)的活性確認(rèn)
[0292]對(duì)于能夠用平板測(cè)定法確認(rèn)的陽(yáng)性菌落(用GO測(cè)定不發(fā)色，用GDH測(cè)定發(fā)色)，進(jìn)行液體培養(yǎng)，研究GO活性及GDH活性。應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)操作參考PYES2的手冊(cè)。
[0293]〈G0測(cè)定用試劑〉[0294]含苯酚的磷酸緩沖液19mL
[0295]10% 葡萄糖 5mL
[0296]25u/mL P0”Amano”3 (天野酶公司)5mL
[0297]0.4g/dL4_氨基安替比林ImL
[0298]〈⑶H測(cè)定用試劑〉
[0299]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) ρΗ7.0 2ImL
[0300]10% 葡萄糖 5mL
[0301]3mmol/L PMS 3mL
[0302]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0303]向各試劑200 μ L中添加20 μ L的培養(yǎng)上清，于37°C使之反應(yīng)。在反應(yīng)開(kāi)始后10分鐘與60分鐘時(shí)測(cè)定吸光度，由吸光度差求出GO活性及GDH活性。對(duì)于各突變酶轉(zhuǎn)化株，算出⑶H活性與GO活性之比(⑶H活性/GO活性)，進(jìn)行比較(圖6、7)。應(yīng)予說(shuō)明，以具有未突變GO的轉(zhuǎn)化株(圖6、7中表示為pYES-GO)、用插入GO基因前的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化株(圖 6、7 中表示為 pYES-2)、G0”Amano”2 (圖 6、7 中表示為 GO)、⑶H” Amano”8 (圖 6、7 中表示為FAD-GDH)為比 較對(duì)象(對(duì)照)。
[0304]針對(duì)認(rèn)定GDH/G0活性比變化大的突變酶轉(zhuǎn)化株，確認(rèn)突變導(dǎo)入點(diǎn)的氨基酸序列(圖8)。基于圖6~8所示的結(jié)果，確定有效突變。首先，對(duì)于T132，與具有T132V(從蘇氨酸到纈氨酸的取代)的突變酶轉(zhuǎn)化株相比，具有T132A (從蘇氨酸到丙氨酸的取代)的突變酶轉(zhuǎn)化株的⑶H/G0活性比高，因此以T132A為有效突變。對(duì)于T353，在突變酶轉(zhuǎn)化株(5-1-5)中認(rèn)定了兩種突變T353A及T353H，但是由于存在單獨(dú)具有T353A的突變酶轉(zhuǎn)化株(5-1-9,5-1-44)，因此推測(cè)5-1-5株為兩種株的混合，以T353A為有效突變。對(duì)于D446，也基于同樣的推測(cè)，以D446H為有效突變。此外，突變酶轉(zhuǎn)化株12-1-49具有的突變V582S也為有效突變。應(yīng)予說(shuō)明，單獨(dú)或組合具有以上4種突變的GO的氨基酸序列及對(duì)應(yīng)的堿基序列(基因序列)列舉如下。
[0305]突變:氨基酸序列:堿基序列
[0306]T132A:序列號(hào)7:序列號(hào)22
[0307]T353A:序列號(hào)8:序列號(hào)23
[0308]D446H:序列號(hào)9:序列號(hào)24
[0309]V582S:序列號(hào)10:序列號(hào)25
[0310]T132A 及 T353A:序列號(hào) 11:序列號(hào) 26
[0311]T132A 及 D446H:序列號(hào) 12:序列號(hào) 27
[0312]T132A 及 V582S:序列號(hào) 13:序列號(hào) 28
[0313]T353A 及 D446H:序列號(hào) 14:序列號(hào) 29
[0314]T353A 及 V582S:序列號(hào) 15:序列號(hào) 30
[0315]D446H 及 V582S:序列號(hào) 16:序列號(hào) 31
[0316]T132A, T353A 及 D446H:序列號(hào) 17:序列號(hào) 32
[0317]T132A, T353A 及 V582S:序列號(hào) 18:序列號(hào) 33
[0318]T132A, D446H 及 V582S:序列號(hào) 19:序列號(hào) 34
[0319]T353A, D446H 及 V582S:序列號(hào) 20:序列號(hào) 35[0320]T132A, T353A, D446H 及 V582S:序列號(hào) 21:序列號(hào) 36
[0321]4.突變型GO的底物特異性的確認(rèn)
[0322] 對(duì)于具有有效突變的酶(突變型G0)，研究GDH活性中的底物特異性。
[0323]〈⑶H測(cè)定用試劑〉
[0324]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0325]10% 底物 5mL
[0326]3mmol/L PMS ImL
[0327]6.BmmoI /T, NTB 3mL
[0328]向各試劑200 μ L 中添加突變酶轉(zhuǎn)化株(3-1-26、3-2-26、5-1-5、5-1-9、5-1-44、7-1-7、7-2-17、7-2-30、7-2-42、12-1-49)的培養(yǎng)上清20 μ L，于37°C進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始后10分鐘和60分鐘時(shí)測(cè)定吸光度，從吸光度差求出GDH活性。將在使用各底物時(shí)的GDH活性以相對(duì)于以葡萄糖為底物時(shí)的GDH活性(100%)的比率進(jìn)行表示。應(yīng)予說(shuō)明，以具有未突變GO的轉(zhuǎn)化株(圖9中表示為pYES-GO)為對(duì)照。
[0329]如圖9所示，突變酶轉(zhuǎn)化株中確認(rèn)了底物特異性變化。在突變酶轉(zhuǎn)化株5-1-5、5-1-9、7-1-7、7-2-17、7-2-30、7-2-42、12-1-49中沒(méi)有對(duì)木糖的反應(yīng)性。這些轉(zhuǎn)化株具有的突變型GO在沒(méi)有顯示出對(duì)木糖的反應(yīng)性方面可以說(shuō)比現(xiàn)有的FAD-GDH優(yōu)異。這樣，利用氨基酸取代，成功地將GO進(jìn)行GDH化，同時(shí)解決了現(xiàn)有的FAD-GDH中特有的問(wèn)題。應(yīng)予說(shuō)明，由針對(duì)T132的突變而導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)木糖的反應(yīng)性，因此啟示了 FAD-GDH中與該突變對(duì)應(yīng)的部位參與對(duì)木糖的反應(yīng)性的可能性。
[0330]5.突變組合的效果的確認(rèn)
[0331]對(duì)于認(rèn)為是有效突變的基因突變的組合，驗(yàn)證了效果。為了簡(jiǎn)略后面的純化，利用PCR反應(yīng)而制作對(duì)來(lái)自黑曲霉GO-1號(hào)菌的葡萄糖氧化酶基因的C末端添加了組氨酸標(biāo)簽的GO基因(G0-3)，將其插入pYES2中，構(gòu)建pYES-GO-3質(zhì)粒。
[0332](反應(yīng)液的組成)
[0333]10 X LA 緩沖液(Takara-bio 株式會(huì)社)5 μ L
[0334]2.5mM dNTPs (Takara-bio 株式會(huì)社)8 μ L
[0335]25mM MgC12 (Takara-bio 株式會(huì)社)5 μ L
[0336]正向引物(50μ Μ) IyL
[0337]反向引物(50μ Μ) IyL
[0338]模板I μ L
[0339]LA Taq (Takara-bio 株式會(huì)社)0.5 μ L
[0340]stH20 28.5 μ L
[0341](引物的序列)
[0342]正向引物:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG (序列號(hào) 39)
[0343]反向引物:GATCAGCTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGATGCTGCATGGAAGCATAATC (序列號(hào)54)
[0344](反應(yīng)條件)
[0345]在于94°C反應(yīng)2分鐘后，將于94°C反應(yīng)30秒，于52°C反應(yīng)30秒、于72°C反應(yīng)2分鐘的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)35次后，于72°C反應(yīng)7分鐘，最后于4°C放置。[0346]將PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物插入pYES2，制成pYES-G0_3質(zhì)粒，確認(rèn)插入物的序列。對(duì)序列沒(méi)有發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，因此以構(gòu)建的pYES-GO-3質(zhì)粒為模板，基于設(shè)計(jì)成對(duì)T132A、T353A、D446H、V582S進(jìn)行取代的下述合成寡聚核苷酸及與其互補(bǔ)的合成寡聚核苷酸，使用QuikChangeSite-Directed Mutagensesis Kit (Stratagene公司),按照所附方案進(jìn)行突變操作，構(gòu)建
出具有多重突變葡萄糖氧化酶的質(zhì)粒。
[0347]G0-T132A-1:CTCGTCAACGGTGGCGCTTGGACTCGCCCCC AC (序列號(hào) 55)
[0348]G0-T353A-1:CCTTCAGGACCAGACCGCTTCTACCGTCCGC TCAC (序列號(hào) 56)
[0349]G0-D446H-1:GGAGTGGCCAGTTTCCATGTGTGGGATCTTC TGC (序列號(hào) 57 )
[0350]G0-V582S-1:CGCAAATGTCGTCCCATTCTATGACGGTCTTT TATGCCATGG (序列號(hào) 58)
[0351]將突變導(dǎo)入后的質(zhì)粒在大腸菌DH5CI中轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行質(zhì)粒提取，制作突變文庫(kù)。將所得文庫(kù)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVScl (Invitrogen公司)中，對(duì)于生長(zhǎng)的菌落，進(jìn)行液體培養(yǎng)，研究GO活性及GDH活性。應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)操作參考PYES2的手冊(cè)。
[0352]〈G0測(cè)定用試劑〉
[0353]含苯酚的磷酸緩沖液19mL
[0354]10% 葡萄糖 5mL
[0355]25u/mL P0-3 5mL
[0356]0.4g/dL4-A.A ImL
[0357]〈⑶H測(cè)定用試劑〉
[0358]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0359]10% 葡萄糖 5mL
[0360]3mmol/L PMS 3mL
[0361]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0362]向各試劑200 μ L中添加20 μ L的培養(yǎng)上清，于37°C使之反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始后10分鐘與30分鐘時(shí)測(cè)定吸光度，從吸光度差求出GO活性及GDH活性。對(duì)于各突變酶轉(zhuǎn)化株，算出⑶H活性與GO活性的比(⑶H活性/GO活性)，進(jìn)行比較。應(yīng)予說(shuō)明，以具有插入組氨酸標(biāo)簽的未突變GO的轉(zhuǎn)化株(表示為pYES-GO-3)、用插入GO基因前的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而成的轉(zhuǎn)化株(表示為pYES-2)、G0 “Amano”2 (表示為G0)，⑶H”Amano”8 (表示為FAD-GDH)為比較對(duì)象(對(duì)照)。
[0363]結(jié)果如圖11 所示。用 T132A 及 V582S (pYES_G0_M7)、D446H 及 V582S(pYES-G0-M10)、T132A、D446H及V582S (pYES_G0_M13)的多重突變酶分別與單獨(dú)的突變酶或突變導(dǎo)入前的野生酶(pYES-GO-3)進(jìn)行比較，確認(rèn)⑶H/G0活性比變化大。
[0364]6.純化多重突變型酶的比活性及底物特異性的確認(rèn)
[0365]接著，對(duì)于確認(rèn)了效果的T132A、D446H、V582S的組合(T132A及D446H、T132A及V582S、D446H及V582S、T132A、D446H及V582S)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的液體培養(yǎng)，用N1-瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化后，研究比活性及底物特異性。應(yīng)予說(shuō)明，在液體培養(yǎng)中的表達(dá)參考PYES2的手
ΠΠ
/ttr O
[0366]〈⑶H測(cè)定用試劑〉
[0367]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0368]10% 葡萄糖 5mL[0369]3mmol/L PMS 3mL
[0370]6.6mmol/L NTB ImL
[0371]向各試劑200 μ L中添加20 μ L的純化酶溶液或標(biāo)準(zhǔn)酶溶液，然后于37°C使之反應(yīng)，求出從反應(yīng)開(kāi)始5分鐘與10分鐘時(shí)的吸光度差。由用標(biāo)準(zhǔn)酶求出的校正曲線求出活性值，與用Bradford法求出的蛋白量一起算出比活性。結(jié)果如圖12所示。所得純化酶的比活性為約3~8u/mg (蛋白質(zhì))。
[0372]對(duì)于具有有效突變的酶，使用純化酶，研究GDH活性中底物特異性。
[0373]〈⑶H測(cè)定用試劑〉
[0374]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0375]10% 底物 5mL
[0376]3mmol/L PMS 3mL
[0377]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0378]對(duì)于各試劑200 μ L，添加突變酶轉(zhuǎn)化株(M6、M7、M10、M13)的培養(yǎng)上清20 μ L，于37°C使之反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始后5分鐘與10分鐘時(shí)測(cè)定吸光度，由吸光度差求出⑶H活性。將使用各底物時(shí)的GDH活性用相對(duì)于以葡萄糖為底物時(shí)的GDH活性(100%)的比率進(jìn)行表示。應(yīng)予說(shuō)明，以⑶H “Amano”8 (表示為FAD-GDH)為對(duì)照。 [0379]結(jié)果如圖13所示。突變酶轉(zhuǎn)化株中確認(rèn)底物特異性變化。特別是，在D446H及V582S (pYES-GO-MIO)中沒(méi)有對(duì)木糖的反應(yīng)性。本轉(zhuǎn)化株具有的突變型GO在沒(méi)有顯示出對(duì)木糖的反應(yīng)性方面可以說(shuō)比現(xiàn)有的FAD-GDH優(yōu)異。這樣利用氨基酸取代，在將GO進(jìn)行GDH化的同時(shí)成功地解決了現(xiàn)有的FAD-GDH中特有的問(wèn)題。
[0380]7.D446及V582多重突變酶的最優(yōu)氨基酸的研究
[0381]對(duì)于D446及V582的突變組合，以各個(gè)氨基酸成為最優(yōu)的氨基酸組合的方式，以pYES-G0-K-P-2質(zhì)粒為模板,基于序列號(hào)47及序列號(hào)52的合成寡聚核苷酸及與其互補(bǔ)的合成寡聚核苷酸，使用 QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit (Stratagene 公司)，按照所附方案，進(jìn)行突變操作，構(gòu)建具有突變葡萄糖氧化酶的質(zhì)粒。將突變導(dǎo)入后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸菌DH5ci中后，進(jìn)行質(zhì)粒提取，制作D446及V582多重突變文庫(kù)。將所得文庫(kù)在釀酒酵母INVScl (Invitrogen公司)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,對(duì)于所得轉(zhuǎn)化體,使用96孔深孔板,進(jìn)行液體培養(yǎng)，以實(shí)施研究前的組合即D446H及V582S為對(duì)照，取得了⑶H活性及⑶H/G0活性比提高的轉(zhuǎn)化體。應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)操作參考PYES2的手冊(cè)。
[0382]結(jié)果如圖14所示。在D446H及V582R、D446H及V582L、D446H及V582P的組合中，與實(shí)施研究前的組合D446H及V582S相比，⑶H活性及⑶H/G0活性比提高。其中，D446H及V582P的GO活性在檢測(cè)限以下，利用氨基酸取代，成功地完全⑶H化。
[0383]8.D446H及V582P多重突變酶的性質(zhì)研究
[0384](I)培養(yǎng)及純化
[0385]液體培養(yǎng)中的表達(dá)如下進(jìn)行:參考pYES2的手冊(cè)，由保存板接種到在500mL搖瓶(坂口 7 7 ^ 中制成的IOOmL含有0.67%的不含氨基酸酵母氮源(Nippon BectonDickinson株式會(huì)社制)、2%葡萄糖的培養(yǎng)基(pH5.4)中，進(jìn)行30°C、140轉(zhuǎn)/分鐘、20小時(shí)
的預(yù)培養(yǎng)。
[0386]預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心回收，再次以成為0D660=0.4的方式接種到在500mL搖瓶中制成的IOOmL的含有0.67%不含氨基酸酵母氮源(Nippon Becton Dickinson株式會(huì)社制)、2%半乳糖及1%蜜三糖的培養(yǎng)基(pH5.4)中，進(jìn)行30°C、140轉(zhuǎn)/分鐘、5小時(shí)的本培養(yǎng)。
[0387]培養(yǎng)結(jié)束后，利用超濾膜(商品名MICR0ZA，分組分子量6000，旭化成社制)進(jìn)行脫鹽濃縮，對(duì)于上述脫鹽濃縮液，使之在用20mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡化的陰離子交換樹(shù)月旨(商品名HiTrap DEAE FF,GE Healthcare Japan公司制)柱中進(jìn)行吸附，用上述緩沖液進(jìn)行清洗。清洗后，使用含有NaCl的30mM MOPS緩沖液(pH7.0)，利用NaCl濃度O~1.0M的Liner gradient法進(jìn)行溶出。可得到由如上所述的純化方法部分純化的突變型G0(D446H,V582P多重突變酶)。
[0388](2)底物特異性的確認(rèn)
[0389]對(duì)于突變型GO部分純化酶(D446H、V582P多重突變酶)，研究⑶H活性中的底物特異性。
[0390]〈⑶H測(cè)定用試劑〉
[0391]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0392]10% 底物 5mL
[0393]3mmol/L PMS 3mL
[0394]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0395]對(duì)于各試劑200μ L，添加突變型GO部分純化酶(D446H、V582P多重突變酶)20μ L，于37°C使之反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始后10分鐘與30分鐘時(shí)測(cè)定吸光度，由吸光度差求出⑶H活性。將使用各底物時(shí)的GDH活性用相對(duì)于以葡萄糖為底物時(shí)的GDH活性(100%)的比率進(jìn)行表示。應(yīng)予說(shuō)明，以⑶H “Amano”8 (圖6、7中表示為FAD-GDH)為對(duì)照。
[0396]結(jié)果如圖15所示。突變型GO部分純化酶(D446H、V582P多重突變酶)未顯示出對(duì)木糖的反應(yīng)性，與⑶H “Amano”8相比，底物特異性格外優(yōu)異。
[0397]產(chǎn)業(yè)上的利用可能性
[0398]本發(fā)明提供的突變GO在試樣中的葡萄糖量的檢測(cè)、定量中有用。另一方面，本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法、制備方法作為取得特性提高的GDH或GO取得的方法得到利用。特別是，期待作為用于取得GDH化的GO或GO化的GDH的方法來(lái)利用。
[0399]本發(fā)明并不限定于任何上述發(fā)明實(shí)施方式及實(shí)施例的說(shuō)明。在不脫離本發(fā)明所要保護(hù)的范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易想到的范圍內(nèi)的各種變型方式也包含在本發(fā)明中。
[0400]本說(shuō)明書(shū)中明示的論文、公開(kāi)專(zhuān)利公報(bào)、及專(zhuān)利公報(bào)等內(nèi)容通過(guò)援引其全部?jī)?nèi)容而得到引用。
[0401]另附序列表文本
[0402]序列號(hào)39~40，54:人工序列的說(shuō)明:PCR用引物
[0403]序列號(hào)41~53，55~58:人工序列的說(shuō)明:突變導(dǎo)入用引物。
【權(quán)利要求】
1.一種突變酶，由在來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中選自以下(I)~(13)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列所構(gòu)成: (O與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (9)與序列號(hào)I 所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (10)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (11)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變酶，其中，來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列為序列號(hào)I或2的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變酶，其中，被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變酶，其中，對(duì)于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸為丙氨酸，對(duì)于(5)的氨基酸，取代后的氨基酸為丙氨酸，對(duì)于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸為絲氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變酶，其中，被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的突變酶，其中，對(duì)于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸為丙氨酸，對(duì)于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸為絲氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變酶，其中，被取代的氨基酸為(7)的氨基酸及(12)的氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的突變酶，其中，對(duì)于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸為組氨酸，對(duì)于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸為絲氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變酶，其中，由序列號(hào)7~21、59~61中的任一氨基酸序列所構(gòu)成。
10.一種基因，編碼權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的突變酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因,其中，包含序列號(hào)22~36、62~64中的任一堿基序列。
12.—種重組DNA，包含權(quán)利要求10或11所述的基因。
13.一種微生物，具有權(quán)利要求12所述的重組DNA。
14.一種葡萄糖測(cè)定法，其特征在于，使用權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的突變酶，測(cè)定試樣中的葡萄糖。
15.一種葡萄糖測(cè)定用試劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的突變酶。
16.一種葡萄糖測(cè)定用試劑盒，包含權(quán)利要求15所述的葡萄糖測(cè)定用試劑。
17.一種方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的突變酶，降低工業(yè)制品或其原料中的葡萄糖量。
18.—種酶劑,含有權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的突變酶。
19.一種突變酶的設(shè)計(jì)方法，包括以下步驟(i)和(ii): (1)在突變對(duì)象酶的氨基酸序列中，確定選自以下(I)~(13)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸的步驟，所述突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶或來(lái)自微生物的黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶: (O與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的115位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的131位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的132位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的193位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的353位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的436位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的446位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的472位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的511位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (10)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的535位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (11)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的537位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的582位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的583位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸； (ii)基于突變對(duì)象酶的氨基酸序列，構(gòu)建在步驟(i)中確定的氨基酸序列被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶，在步驟(i)中被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶，在步驟(i)中被取代的氨基酸為(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者選自它們中的兩個(gè)以上的氨基酸的組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶，在步驟(i)中被取代的氨基酸為(7)的氨基酸及(12)的氨基酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求20~22中任一項(xiàng)所述的設(shè)計(jì)方法，其中，來(lái)自微生物的葡萄糖氧化酶為黑曲霉或尼崎青霉的葡萄糖氧化酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的設(shè)計(jì)方法，其中，葡萄糖氧化酶的氨基酸序列為序列號(hào)I或2的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的設(shè)計(jì)方法，其中，突變對(duì)象酶為意大利青霉、薄刺青霉、米曲霉或土曲霉的黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的設(shè)計(jì)方法，其中，黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列為序列號(hào)3~6中的任一氨基酸序列。
27.一種突變酶的制備方法，包括以下步驟(1)~(III): (I)準(zhǔn)備將序列號(hào)7~21、59~61中的任一氨基酸序列、或由權(quán)利要求19~26中任一項(xiàng)所述的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核酸的步驟； (II)使所述核酸進(jìn)行表達(dá)的步驟，及 (III)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
【文檔編號(hào)】C12Q1/26GK103981158SQ201410145393
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月5日
【發(fā)明者】西尾享一, 小池田聰 申請(qǐng)人:天野酶株式會(huì)社