專利名稱：突變δ9延伸酶和它們在制備多不飽和脂肪酸中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及對編碼突變Λ9脂肪酸延伸酶的多核苷酸序列的創(chuàng)建以及這些延伸酶在制備長鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。
背景技術(shù)：
人們正研究包括植物、藻類、真菌、原生藻菌和酵母在內(nèi)的多種不同宿主作為商業(yè)化多不飽和脂肪酸[“PUFA”]生產(chǎn)的手段。基因工程已表明，一些宿主(即使那些天然限于亞麻酸[“υν”；18:2Ω-6]和α-亞麻酸[“ALA” ； 18:3 ω-3]脂肪酸生產(chǎn)的宿主)可進行實質(zhì)上的改造以產(chǎn)生對多種長鏈《-3/co-6PUFA的高水平生產(chǎn)。無論這是天然能力還是重組技術(shù)的結(jié)果，花生四烯酸[“ARA”;20:4gj-6]、二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;20:5ω-3]、二十二碳五烯酸[“DPA”;22:5gj-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”;22:6co-3]可能均需要Λ 9延伸酶基因的表達。特化的Λ 9延伸酶具有將LA轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸[“EDA”;20:2 ω -6]，以及將ALA轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸[“ETrA”；20:3co-3]的能力。然而，僅僅鑒定出少量的Λ9延伸酶。這些酶包括來自綠光等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ9延伸酶[“IgD9e”] (SEQ IDNO:1 和 2 ；PCT 公開 W02002/077213、W02005/083093, W02005/012316 和 W02004/057001 ；GenBank登錄號AAL37626、來自小型綠藻屬(Eutr印tiella sp.) CCMP389的Λ9延伸酶[“E389D9e”] (SEQ ID NO: 3 和 4 ;美國專利 7，645，604)、來自小眼蟲(Euglena gracilis)的 Λ9 延伸酶[“EgD9e”] (SEQ ID NO:7 和 8 ;美國專利 7，645，604)、以及來自 Euglenaanabaena 的 Λ 9 延伸酶[“EaD9e”] (SEQ ID NO: 11 和 12 ;美國專利 7，794，701)。盡管美國專利7，645，604鑒定出在EgD9e、E389D9e和IgD9e延伸酶之間保守的七種基序，但是僅僅使用IgD9e進行了一項研究來鑒定對于Λ9延伸酶功能性而言重要的氨基酸殘基(Qi，B.等,FEBS Lett.,547:137-139 (2003))。不存在來自△ 9延伸酶的可用晶體結(jié)構(gòu)以指導對所述蛋白質(zhì)的基因進化，并且對于△ 9延伸酶序列、結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系了解甚少。盡管缺乏了解，對于在能夠制備PUFA的生產(chǎn)宿主細胞中以高酶活性進行有效表達的△ 9延伸酶基因仍然存在需求。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了良好地適用于在商業(yè)可用的宿主細胞中整合進入PUFA生物合成途徑的具有高活性的新型Λ9延伸酶突變體。令人驚異并且出乎意料的是，據(jù)發(fā)現(xiàn)，特定的點突變產(chǎn)生了 Λ 9延伸酶突變體，所述Λ 9延伸酶突變體的酶活性基于LA向EDA的轉(zhuǎn)化是野生型酶的96%至145%。

發(fā)明內(nèi)容

在第一實施例中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包含:
(a)編碼突變多肽的核苷酸序列，所述突變多肽具有Λ 9延伸酶活性且具有如SEQID NO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID Ν0:22與SEQ ID NO: 10具有至少一個氨基酸突變的差異，所述突變選自:i)L35F 突變；ii)L35M 突變；iii)L35G 突變；iv)L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、W132T 和 I179R 突變;vi) L35G、S9D、Y84C 和 1179R 突變；vii)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突變；viii)L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突變；ix)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突變；X) K58R 和 I257T 突變；xi)D98G 突變；xii)L130M 和 V243A 突變；以及xiii)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y 和 I257T ；(b)部分(a)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)量的核苷酸組成且是100%互補的。所述分離的多核苷酸可具有選自下列的核苷酸序列:SEQ ID NO:28, SEQ IDN0:31、SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:58,SEQ ID N0:61、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQID NO:106 和 SEQ ID NO:109。在第二實施例中，本發(fā)明涉及具有Λ9延伸酶活性的突變多肽，所述突變多肽由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸編碼。所述突變多肽可具有選自下列的蛋白質(zhì)序列:SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:59,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO: 10USEQ ID NO: 104,SEQ ID NO: 107 和 SEQ ID NO: 110。在第三實施例中，所述突變多肽具有Λ 9延伸酶活性，所述Λ 9延伸酶活性至少大致在功能上等同于如SEQ ID NO: 10所示的多肽的Λ 9延伸酶活性。優(yōu)選地，當與如SEQID NO: 10所示的多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比相比時，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比為至少110% (B卩，對應于至少10%的活性改善)，并且更優(yōu)選地，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比為至少120%(SP，對應于至少20%的活性改善)。在第四實施例中，本發(fā)明涉及重組構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，所述重組構(gòu)建體可操作地連接至少一種調(diào)控序列。在第五實施例中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸。所述轉(zhuǎn)化的細胞可優(yōu)選地選自植物、細菌、酵母、藻類、類眼蟲、原生藻菌、卵菌和真菌。在第六實施例中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的含油酵母，所述含油酵母產(chǎn)生其干細胞重量 的至少約25%的油，所述含油酵母包含(a)至少一種重組DNA構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸；以及(b)至少一種重組DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的分離的 多核苷酸，所述構(gòu)建體編碼選自下列的多肽Δ4去飽和酶、Δ 5去飽和酶、Δ 8去飽和酶、 Δ 6去飽和酶、Δ9去飽和酶、Δ 12去飽和酶、Δ 15去飽和酶、17去
飽和酶、C14/16延伸酶、 Cl6/186延伸酶、C18/2l延伸酶和C20/22 延伸酶；其中所述轉(zhuǎn)化的含油酵母可產(chǎn)生選自下列的長鏈多不飽和脂肪酸花生四烯酸、 二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二高亞麻酸、二十二碳四 烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。更具體地,本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因含油酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在第七實施例中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其包括a)提供含油酵母，所述含油酵母包含i)可操作地連接至少一種調(diào)控序列的重組構(gòu)建體，其中所述重組構(gòu)建體包含編碼 突變多肽的分離的多核苷酸，所述突變多肽具有A 9延伸酶活性且具有如SEQ ID N0:22所 示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 22與SEQ ID NO: 10具有至少一個氨基酸突變的差異，所 述突變選自(a) L35F 突變；(b) L35M 突變；(c) L35G 突變；(d)L35G突變和至少一種選自下列的其它突變S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、 Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、 L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；(e)L35G、W132T 和 I179R 突變;(f) L35G、S9D、Y84C 和 I179R 突變；(g)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突變； (h) L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突變；(i)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突變；(j) K58R 和 I25H 突變；(k) D98G 突變；(1) L130M 和 V243A 突變；以及(m)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自K58R、L35F、L35G、L35M、 S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、 L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、 A254W、A254Y 和 I257T ;以及ii)選自亞油酸和a-亞麻酸的底物脂肪酸來源；b)使步驟(a)的酵母在使編碼具有A 9延伸酶活性的突變多肽的重組構(gòu)建體表達 且使所述底物脂肪酸轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物脂肪酸的條件下生長，其中亞油酸轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸并且α-亞麻酸轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸；以及c)任選地回收步驟(b)的產(chǎn)物脂肪酸。在第八實施例中，本發(fā)明涉及微生物油，所述微生物油獲自本發(fā)明的含油酵母。在第九實施例中，本發(fā)明涉及重組微生物宿主細胞，所述重組微生物宿主細胞產(chǎn)生油，所述油包含以干細胞重量的重量百分比測量的至少22.5重量％的二十碳五烯酸，所述重組微生物宿主細胞包含至少一種本發(fā)明的突變Δ9延伸酶多肽。牛物保藏下列生物材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下
列名稱、保藏號和保藏日期。
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，包含: (a)編碼突變多肽的核苷酸序列，所述突變多肽具有Λ9延伸酶活性且具有如SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 22與SEQ ID NO: 10具有至少一個氨基酸突變的差異，所述突變選自: i)L35F突變； ii)L35M突變； iii)L35G突變； iV) L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、1179M、1179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、A21V、L108G和 I179R 突變；vi)L35G、W132T和 1179 突變；vii)L35G、S9D、Y84C和 I179R 突變；viii)L35G、Y84C、I179R和 Q244N 突變；ix)L35G、A21V、W132T、I179R和 Q244N 突變；x)K58R 和 I257T 突變； xi)D98G突變； xii)L130M和V243A突變；以及 i)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W.A254Y 和 I257T ； (b)部分(a)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)量的核苷酸組成且是100%互補的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列選自:SEQID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO: 100, SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:106 和 SEQ ID NO:109。
3.具有Λ9延伸酶活性的突變多肽，所述突變多肽由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變多肽，其中蛋白質(zhì)序列選自:SEQID NO:29, SEQ IDNO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ IDNO:87,SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107 和 SEQ ID NO:110。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4中任一項所述的突變多肽，其中所述Λ9延伸酶活性至少大致在功能上等同于如SEQ ID NO: 10所示的多肽的Λ9延伸酶活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的突變多肽，其中當與如SEQID NO: 10所示的多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比相比時，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比為至少110%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的突變多肽，其中當與如SEQID NO: 10所示的多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比相比時，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉(zhuǎn)化百分比為至少120%。
8.重組構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，所述重組構(gòu)建體可操作地連接至少一種調(diào)控序列。
9.轉(zhuǎn)化的細胞，包含權(quán)利要求1的分離的多核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化的細胞，其中所述細胞選自:植物、細菌、酵母、藻類、類眼蟲、原生藻菌、卵菌和真菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化的細胞，其中所述細胞是含油酵母，所述含油酵母產(chǎn)生其干細胞重量的至少約25%的油。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化的細胞，其中所述含油酵母還包含至少一種重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的分離的多核苷酸，所述重組DNA構(gòu)建體編碼選自下列 的多肽:Λ4去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Λ8去飽和酶、Λ6去飽和酶、Λ 9去飽和酶、Λ 12去飽和酶、Λ 15去飽和酶、Λ 17去飽和酶、C14716延伸酶、C16718延伸酶、C18/2(l延伸酶和C20/22 延伸酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化的細胞，其中由所述含油酵母產(chǎn)生的油包含選自下列的長鏈多不飽和脂肪酸:花生四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二高-Y -亞麻酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化的細胞，其中所述含油酵母選自:耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲抱酵母屬(Trichosporon)和油脂酵母屬(Lipomyces)0
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化的細胞,其中所述細胞是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
16.生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括: a)提供含油酵母，所述含油酵母包含: i)可操作地連接至少一種調(diào)控序列的重組構(gòu)建體，其中所述重組構(gòu)建體包含編碼突變多肽的分離的多核苷酸，所述突變多肽具有Λ 9延伸酶活性且具有如SEQ ID Ν0:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 22與SEQ ID NO: 10具有至少一個氨基酸突變的差異，所述突變選自: (a)L35F突變；(b)L35M 突變； (c)L35G突變； (d)L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、1179M、1179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；(e)L35G、A21V、L108G和 I179R 突變；(f)L35G、W132T 和 1179 突變；(g)L35G、S9D、Y84C 和 1179R 突變；(h)L35G、Y84C、1179R 和 Q244N 突變；(i)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突變；(j)K58R 和 I257T 突變； (k)D98G 突變； (I) L130M和V243A突變；以及 (m)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W.A254Y 和 I257T ;以及 )選自亞油酸和α -亞麻酸的底物脂肪酸來源； b)使步驟(a)的酵母在使編碼具有Λ9延伸酶活性的突變多肽的重組構(gòu)建體表達且使所述底物脂肪酸轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物脂肪酸的條件下生長，其中亞油酸轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸并且α-亞麻酸轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸；以及 c)任選地回收步驟(b)的產(chǎn)物脂肪酸。
17.微生物油，所述微生物油獲自權(quán)利要求9的含油酵母。
18.重組微生物宿主細胞，所述重組微生物宿主細胞產(chǎn)生油，所述油包含以干細胞重量的重量百分比測量的至少22.5重量％的二十碳五烯酸，所述重組微生物宿主細胞包含至少一種突變Λ 9延伸酶多肽，其中所述突變Λ 9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列。
全文摘要
本文公開了具有將亞油酸[18:2，LA]轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸[20:2，EDA]和/或?qū)ⅵ?亞麻酸[18:3，ALA]轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸[20:3，ETrA]的能力的突變Δ9延伸酶。本文還公開了分離的核酸片段和包含編碼突變Δ9延伸酶的此類片段的重組構(gòu)建體，以及用這些突變Δ9延伸酶在含油酵母中制備長鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
文檔編號C12P7/64GK103080316SQ201180040811
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者M.W.博斯蒂克, H.何, Y.李, Q.朱 申請人:納幕爾杜邦公司