在3位具有羧烷基取代的睪酮及其在制備用于測(cè)定生物學(xué)樣品中的睪酮濃度的標(biāo)記的類...的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中的睪酮的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及特別可用于免疫測(cè)定的衍生自睪酮的新化合物，其制備方法，以及其在測(cè)定睪酮中的用途?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]通常稱作睪酮的17β-羥基雄甾-4-烯-3-酮是人中的主要雄激素。其由睪丸中的Leydig細(xì)胞在垂體激素：LH(黃體生成素）的影響下分泌。[0003]睪酮大部分結(jié)合至轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白循環(huán)，主要是SHBG(性激素結(jié)合球蛋白）和白蛋白。游離睪酮相當(dāng)于總睪酮的1-2%(LitwackG.，1992)〇[0004]具有原子編號(hào)的睪酮的結(jié)構(gòu)式如下所示。[0005][0006]在人中，睪酮在精子發(fā)生、外生殖器的成熟、第二性征（胡須、陰毛和腋毛）和蛋白合成代謝中發(fā)揮作用。因此，測(cè)定人中的睪酮使得可以評(píng)價(jià)睪丸類固醇合成功能。認(rèn)為3.2ng/ml以上的血清睪酮水平為正常，低于2ng/ml的水平使得能診斷身體的性腺機(jī)能減退或女性化。人中正常值的上限為8-9ng/ml。[0007]在女性中，睪酮由卵巢和腎上腺少量分泌。其主要產(chǎn)生自前體（特別是雄烯二酮）的外周轉(zhuǎn)化。因此，測(cè)定女性中的睪酮使得能探索雄激素分泌。高水平的睪酮可能與多囊卵巢綜合征、卵巢或腎上腺腫瘤、腎上腺增生或者特發(fā)性多毛癥相關(guān)。[0008]幾種方法可用于定量生物學(xué)樣品中的睪酮。這些方法可以分為2個(gè)主要的組：[0009](1)質(zhì)譜（MS)[0010]這種分析技術(shù)允許測(cè)定所分析的化合物的分子量以及鑒定和定量它們。應(yīng)用于復(fù)雜混合物如生物流體，其需要結(jié)合允許降低復(fù)雜性的分離技術(shù)。最常用的是氣相色譜（GC)或液相色譜（LC)。串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS)組合2個(gè)分析儀。第一分析儀中選擇的離子化合物在第二分析儀中更細(xì)致地分析。這種雙重分析使得可以顯著增加方法的特異性。因此，可以通過組合分離技術(shù)和MS技術(shù)的幾種方法測(cè)定睪酮：[0011]-同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜（ID-GCMS)(MonetiG.，etal.，1987;Wudy,S.A.，etal.,1992)〇[0012]-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ID-LC-MS/MS)(ThienpontL.，etal.，2008)。[0013](2)用標(biāo)記的免疫測(cè)定[0014]也稱作免疫學(xué)測(cè)定或免疫化學(xué)測(cè)定的免疫測(cè)定方法包括待檢測(cè)的分析物睪酮與至少一種第一化合物之間的免疫學(xué)反應(yīng)，所述第一化合物是這種分析物的結(jié)合配對(duì)物。因?yàn)椴G酮測(cè)定通過競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行，所述方法還包括另一化合物，其與待測(cè)定的睪酮競(jìng)爭(zhēng)，并且是睪酮衍生物。因此將兩種化合物之一標(biāo)記用于可視化。這種標(biāo)記的化合物稱作標(biāo)記的綴合物。[0015]當(dāng)然，術(shù)語"免疫"，例如在"免疫測(cè)定"中，在本申請(qǐng)中并不認(rèn)為嚴(yán)格表示結(jié)合配對(duì)物是免疫學(xué)配對(duì)物如抗體。事實(shí)上，當(dāng)也稱作配體的結(jié)合配對(duì)物不是免疫學(xué)配對(duì)物，而是例如待測(cè)定的分析物的受體時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也廣泛使用這個(gè)術(shù)語。因此，術(shù)語ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）往往用于使用非免疫學(xué)結(jié)合配對(duì)物的測(cè)定，在英語中更一般稱作"配體結(jié)合測(cè)定"，而術(shù)語"免疫"包括在首字母縮略詞ELISA中。為了清晰，申請(qǐng)人在整個(gè)申請(qǐng)中對(duì)使用結(jié)合配對(duì)物的任何測(cè)定均會(huì)使用術(shù)語"免疫"，甚至當(dāng)其不是免疫學(xué)配對(duì)物時(shí)也是如此。[0016]根據(jù)使用的標(biāo)記的綴合物的類型和這種綴合物可以產(chǎn)生的信號(hào)的類型，三種類型的免疫測(cè)定之間產(chǎn)生區(qū)別：[0017]-放射性同位素免疫測(cè)定（RIA)(Cekan，S.Z.，1979)，其之前可以是分離技術(shù)如高效液相色譜（Ueschiba,H.etal.，1991)，[0018]-免疫酶促測(cè)定或EIA"酶聯(lián)免疫測(cè)定"。根據(jù)所選的酶底物，我們可以具有比色信號(hào)（ELISA)(Rassasie，M.J.，etal.，1992)、熒光信號(hào)（ELFA)或化學(xué)發(fā)光信號(hào)（CLIA)(StablerT.V.,etal.,1991)〇[0019]-電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（Owen,W.Ε·，etal.，2010)〇[0020]因此最后兩種類型的免疫測(cè)定稱作非放射性同位素免疫測(cè)定。[0021]20世紀(jì)60年代RIA方法的開發(fā)使類固醇的定量發(fā)生變革。那時(shí)使用的示蹤劑為放射性睪酮衍生物（3H或125I)如標(biāo)記的睪酮-3-(0-羧甲基）肟（或睪酮-3-0-CM0)(CookB.andBeastallG.Η.,1987)。但是，這些方法具有顯著缺點(diǎn)，放射性廢物的處理和標(biāo)記的試劑相對(duì)較短的半衰期。[0022]這是為什么開發(fā)的非放射性免疫測(cè)定的方法和試劑損害現(xiàn)在很少使用的RIA。但是，在自動(dòng)化免疫分析平臺(tái)上進(jìn)行的免疫測(cè)定在常規(guī)使用的條件下不能正確和可重復(fù)地檢測(cè)低于I.5ng/ml的睪酮量（RosnerW.etal.，2007)。這對(duì)常具有這樣低的血清水平的患有性腺機(jī)能減退的人的適當(dāng)管理提出了問題。[0023]此外，當(dāng)在女性中使用時(shí)，睪酮的非放射性免疫測(cè)定的大多數(shù)現(xiàn)有方法是不準(zhǔn)確的，因?yàn)樗鼈儾痪哂凶銐虻姆治鲮`敏度以檢測(cè)和定量血液循環(huán)中存在的睪酮水平。在18-49歲年齡范圍中的女性中總睪酮的參考值為0.04-0.44ng/ml(DemersL.M.，2010)，而睪酮的自動(dòng)化免疫測(cè)定的檢出限或分析靈敏度為〇.lng/ml數(shù)量級(jí)。因此，ShrivastavT.G.，2002顯示當(dāng)待測(cè)定的樣品中睪酮的量低時(shí)，利用與辣根過氧化物酶綴合的睪酮-3-0-CM0作為示蹤劑通過ELISA測(cè)定睪酮產(chǎn)生偏差，因?yàn)楂@得的濃度通常遠(yuǎn)高于測(cè)定的樣品中實(shí)際包含的濃度。FietJ.etal.，2004還描述了使用這樣的化合物3-0-CM0,也稱作化合物3-CM0作為示蹤劑，其是事先生物素化的。但是，在最低范圍中利用這種化合物測(cè)定睪酮的靈敏度并不好。此外，所述化合物3-0-CM0的制備復(fù)雜，因?yàn)槠錇榱Ⅲw異構(gòu)體混合物的形式，也稱作異構(gòu)體混合物。為了可重復(fù)測(cè)定，因此推薦在免疫測(cè)定中使用之前分離立體異構(gòu)體，這是復(fù)雜的，并且導(dǎo)致合成率的退化。[0024]因此迫切需要睪酮的測(cè)定，其足夠靈敏，因此臨床上可用于包含低睪酮濃度的樣品，并且使用可以容易制備的化合物?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0025]出乎意料地，申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)新的睪酮化合物，其使得可以克服現(xiàn)有技術(shù)的免疫測(cè)定的缺點(diǎn)，因?yàn)樵诟?jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中使用它，特別是作為示蹤劑，提供高度靈敏的測(cè)定，尤其是在低范圍的睪酮中，并且易于制備。[0026]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及以下通式（I)的衍生自睪酮的化合物：[0028]其中η為1-10的整數(shù)，并且Y表示活化或待活化的偶聯(lián)基團(tuán)，其允許與分子的伯胺形成酰胺鍵。[0029]本發(fā)明的另一目的包括綴合物以及包含所述化合物的試劑盒，所述綴合物包含如上文所述的式（I)的睪酮衍生物或者由如上文所述的式（I)的睪酮衍生物組成。[0030]本發(fā)明的另一目的包括所述綴合物在睪酮的免疫測(cè)定的方法中，特別是作為示蹤劑的用途。[0031]最后，最后一個(gè)目的涉及一種制備所述睪酮衍生物的方法。[0032]因此，本發(fā)明涉及如上文所述的式（I)的化合物，其特別可用于競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定，尤其是不蹤劑制備。[0033]實(shí)際上，出乎意料地，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)通過將羰基還原為羥基并引入接頭來在3位修飾睪酮，產(chǎn)生睪酮衍生物，其不是異構(gòu)體混合物形式，并且在用于睪酮的測(cè)定時(shí)特別有利，尤其是作為示蹤劑，因?yàn)椴G酮的測(cè)定特別靈敏，并且使得可以檢測(cè)低睪酮濃度。[0034]如CookΒ.andBeastallG.Η.，1987所示，類固醇激素在結(jié)構(gòu)上非常相似。因此，如下文所示，睪酮、雌二醇、雌酮和雄烯二酮的不同之處僅在于在3和17位存在羥基或酮官能團(tuán)，以及10位存在或不存在甲基：[0035][0036]基本結(jié)構(gòu)的取代基的輕微修飾，特別是在3位或17位，導(dǎo)致從一種類固醇激素轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N。[0037]出乎意料地，盡管對(duì)睪酮的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾，但是由于3位的羰基還原為羥基，因此由于其在這個(gè)位置的官能團(tuán)與我們不希望測(cè)定的分析物雌二醇的結(jié)構(gòu)相似性，本發(fā)明的式（I)的化合物特別適合用于測(cè)定睪酮。[0038]因此本發(fā)明的化合物的特征在于如上文給出的式（I)，其中η為1-10的整數(shù)，并且Y表示活化或待活化的偶聯(lián)基團(tuán)，其使得能與分子的伯胺形成酰胺鍵。[0039]這些化合物必須不太疏水，在這方面必須控制η的值。根據(jù)一實(shí)施方案，η為1-5，并且優(yōu)選1-3。根據(jù)一特定實(shí)施方案，η為1。[0040]可以與本發(fā)明的睪酮衍生物偶聯(lián)的分子是天然具有伯胺的所有分子如蛋白，或者已化學(xué)修飾以包括這樣的伯胺的所有分子，例如具有伯胺的修飾的生物素。[0041]"活化或待活化的偶聯(lián)基團(tuán)"表示合適的官能團(tuán)，活化后如果需要，其允許本發(fā)明的睪酮衍生物與偶聯(lián)分子的伯胺官能團(tuán)偶聯(lián)。這個(gè)基團(tuán)還可以稱作離去基團(tuán)，因?yàn)槠洳辉俅嬖谟诓G酮衍生物和具有伯胺的分子之間形成的綴合物中。因此在所關(guān)注的偶聯(lián)分子的伯胺親核基團(tuán)的親核取代反應(yīng)期間，這個(gè)離去基團(tuán)會(huì)從分子的剩余部分解離。當(dāng)其稱作"已活化"時(shí)，這個(gè)離去基團(tuán)會(huì)直接解離，或者當(dāng)其稱作"待活化"時(shí)，其僅在活化之后解離。[0042]因此"活化的偶聯(lián)基團(tuán)"表示這樣的基團(tuán)，其使得可以直接形成酰胺鍵，這個(gè)基團(tuán)不必修飾。作為實(shí)例，可以提到以下基團(tuán)：[0043][0044]m為整數(shù)，優(yōu)選1-10,其構(gòu)成本發(fā)明的一實(shí)施方案。[0045]因此"待活化的偶聯(lián)基團(tuán)"表示必須通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法活化以能夠形成酰胺鍵的任何基團(tuán)。這類基團(tuán)具有-OH或-COOH基團(tuán)。作為實(shí)例，我們可以提到基團(tuán)-OH和-NH-(CH2)m-COOH,m為整數(shù)，優(yōu)選1-10,其構(gòu)成本發(fā)明的一實(shí)施方案。[0046]根據(jù)本發(fā)明的一特定實(shí)施方案，m為1-5,或者1-3。[0047]根據(jù)另一實(shí)施方案，Y選自-OH、-NH-(CH2)m-C00H和[0048][0049]m為1-10,并且優(yōu)選等于1。[0050]特別適合測(cè)定睪酮，尤其是示蹤劑制備的化合物是在3位的碳為立體化學(xué)純的化合物（α或β異構(gòu)體），因?yàn)槿绮G酮中，在3位不再有雙鍵。[0051]實(shí)際上，與3-0-CM0化合物（其更難以控制并重復(fù)異構(gòu)體混合物，因?yàn)樵诤铣膳沃g異構(gòu)體的比例不同）相比，在碳3處立體化學(xué)純的化合物（α或β異構(gòu)體）是有利的，因?yàn)樗鼈兏芍貜?fù)，具有更好的質(zhì)量，并且其中使用它們的測(cè)定更穩(wěn)健。[0052]在3位為β異構(gòu)體形式的式（I)的本發(fā)明的睪酮衍生物如以下式（Iβ)所示：[0054]Y和η如上文所述。[0055]在3位為α異構(gòu)體形式的式（I)的本發(fā)明的睪酮衍生物如以下式（Iα)所示：[0056][0057]Y和η如上文所述。[0058]換句話說，在式（I)中，以如下一段直線形式表示的：/3位的碳和接頭的氧原子之間的鍵包括β類型的鍵和α類型的鍵。[0059]這還應(yīng)用于下文所述的3位的碳和所述化合物的接頭的氧原子之間包含鍵的所有化合物，所述鍵為一段直線形式，而不是箭頭形式，如下表示β異構(gòu)體，或表示α異構(gòu)體。[0060]這特別應(yīng)用于制備本發(fā)明的睪酮衍生物的方法的描述中使用的化合物，對(duì)其而言式中未加入數(shù)字指示符號(hào)α或β。[0061]本發(fā)明的化合物可以在通過競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定確定睪酮的方法如診斷測(cè)試中以兩種方式使用。它們直接使用，或者它們偶聯(lián)至另一分子以形成綴合物使用。所述其他分子為標(biāo)記物，或者化學(xué)鍵或"接頭"，或者與睪酮衍生物偶聯(lián)是為了通過競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定實(shí)施睪酮測(cè)定的化合物。[0062]因此，本發(fā)明還涉及綴合物，其包含如上文所述的睪酮衍生物和另一分子，特別是標(biāo)記物或化學(xué)鍵，或者由如上文所述的睪酮衍生物和另一分子組成，特別是標(biāo)記物或化學(xué)鍵。[0063]"標(biāo)記物"表示包含伯胺基團(tuán)的任何分子，其直接包含伯胺基團(tuán)而沒有化學(xué)修飾，或者在化學(xué)修飾之后以包括這樣的基團(tuán)，所述分子能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。用于直接檢測(cè)的這些標(biāo)記物的非詳盡列表由以下組成：[0064]?產(chǎn)生例如可通過比色法、熒光、發(fā)光檢測(cè)的信號(hào)的酶，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，[0065]?發(fā)色團(tuán)如熒光化合物、發(fā)光化合物、染料，[0066]?放射性分子如32P、35S或1251，以及[0067]?熒光分子如Alexa或藻藍(lán)蛋白；[0068]?電化學(xué)發(fā)光鹽如基于吖啶醋（acridinium)或釕的有機(jī)金屬衍生物。[0069]還可以使用間接檢測(cè)系統(tǒng)，例如能夠與抗配體反應(yīng)的配體。然后配體對(duì)應(yīng)于標(biāo)記物，并且與睪酮衍生物構(gòu)成本發(fā)明的綴合物。[0070]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉配體/抗配體對(duì)，例如以下對(duì)：生物素/鏈霉抗生物素蛋白、半抗原/抗體、抗原/抗體、肽/抗體、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸的互補(bǔ)物。[0071]然后抗配體可以通過上文所述的直接檢測(cè)標(biāo)記物直接檢測(cè)，或者其本身可以通過另一配體/抗配體對(duì)檢測(cè)，等等。[0072]在某些條件下，這些間接檢測(cè)系統(tǒng)可以導(dǎo)致信號(hào)的放大。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉信號(hào)放大的這種技術(shù)，并且可以參考申請(qǐng)人以前的專利申請(qǐng)F(tuán)R98/10084或W0-A-95/08000。[0073]根據(jù)所用的標(biāo)記物的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)添加試劑，所述試劑允許標(biāo)記物可視化，或者發(fā)射可通過任何合適類型的測(cè)量裝置如分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)或高清攝像機(jī)檢測(cè)的信號(hào)。[0074]化學(xué)鍵或"接頭"表示包含伯胺基團(tuán)的任何分子，其直接包含伯胺基團(tuán)而沒有化學(xué)修飾，或者在化學(xué)修飾之后以包括這樣的基團(tuán)，所述分子能夠共價(jià)或非共價(jià)地、選擇性或非選擇性地固定在固相上。[0075]如上文指出的，本發(fā)明的睪酮衍生物或綴合物特別可用于體外測(cè)定生物學(xué)樣品中睪酮的濃度，這構(gòu)成本發(fā)明的另一目的。[0076]其中可以進(jìn)行本發(fā)明的方法的生物學(xué)樣品是可能包含睪酮的任何動(dòng)物，優(yōu)選人的生物學(xué)樣品，其中可以進(jìn)行免疫測(cè)定。這些樣品是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。測(cè)定方法中采用的樣品在它們使用之前可以修飾或不修飾。作為事先不修飾的這類樣品的實(shí)例，我們可以提到生物流體如全血、尿、腦脊液、精液、精子、白帶（陰道分泌物）、宮頸粘液、宮頸陰道灌洗液、直腸灌洗液、唾液、支氣管肺泡灌洗液和羊水。作為也稱作樣品衍生物的事先修飾的樣品的實(shí)例，我們可以提到血清、血漿、從生物活組織檢查或手術(shù)之后回收的細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞。然后可以在培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解物中測(cè)定睪酮的濃度。[0077]可以通過也稱作免疫學(xué)測(cè)定的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的方法確定生物學(xué)樣品中睪酮的濃度，所述方法包括由以下組成的步驟：[0078]a)在所述樣品內(nèi)使（i)睪酮結(jié)合配對(duì)物與（ii)選自如上文所述的睪酮衍生物和綴合物的化合物接觸，所述組分（i)和（ii)之一適合發(fā)射信號(hào)，[0079]b)任選地等待足夠的時(shí)間以允許競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，以及[0080]c)測(cè)量信號(hào)的強(qiáng)度，并且通過與建立測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度和睪酮濃度之間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來由其推斷所述生物學(xué)樣品中存在的睪酮的濃度。[0081]競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的測(cè)定。其由通過產(chǎn)生樣品的分析物與所述分析物的衍生物（在這種情況下，睪酮衍生物）之間的競(jìng)爭(zhēng)來測(cè)定樣品中的分析物（在這種情況下，睪酮）組成。由于存在示蹤劑，然后檢測(cè)免疫反應(yīng)。[0082]如上文指出的，可以在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中使用分析物的衍生物，不用之前偶聯(lián)或之后偶聯(lián)至標(biāo)記物以形成綴合物或示蹤劑。[0083]免疫測(cè)定還需要使用睪酮結(jié)合配對(duì)物，其中分析物衍生物和分析物競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)分析物衍生物未偶聯(lián)至標(biāo)記物時(shí)（不是示蹤劑而是捕獲配對(duì)物），然后將結(jié)合配對(duì)物標(biāo)記物以構(gòu)成反應(yīng)的示蹤物。當(dāng)分析物衍生物偶聯(lián)至標(biāo)記物時(shí)（則其為示蹤劑），則結(jié)合配對(duì)物變?yōu)椴东@配對(duì)物。[0084]測(cè)量的示蹤劑發(fā)射的信號(hào)與樣品中睪酮的量成反比。[0085]"睪酮結(jié)合配對(duì)物"表示能夠結(jié)合至睪酮的任何分子。作為睪酮結(jié)合配對(duì)物的實(shí)例，我們可以提到抗體、抗體部分、Nanofitins、睪酮受體或已知與睪酮具有相互作用的任何其他蛋白，例如SHBG。[0086]作為結(jié)合配對(duì)物的抗體例如多克隆抗體或單克隆抗體。[0087]多克隆抗體可以這樣獲得，用靶睪酮作為免疫原免疫動(dòng)物，然后回收純化形式的所需抗體，通過從所述動(dòng)物采集血清，并且從血清當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5 6