專利名稱：化合物(i)、提取方法及在制備治療急性缺血性腦血管病藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化合物，特別是一種天然化合物，其提取方法及其在制備治療急性缺血性腦血管病藥中的應用。
急性缺血性腦血管病是嚴重危害人類健康的疾病，其發(fā)病率呈逐漸增加趨勢。當腦缺血發(fā)生，腦組織細胞很快地出現(xiàn)能量代謝障礙，從而導致神經(jīng)末梢大量釋放出以谷氨酸為主的興奮性神經(jīng)遞質，然后，激活NMDA及非NMDA受體，引起一系列導致腦損傷、腦梗死的病理變化。通過受體激活，促進大量Ca2+內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2+超負荷是使腦細胞死亡的關鍵因素及共同的通路。當缺血的腦組織在恢復血流供應時，又可產(chǎn)生再灌注損傷。這種腦組織缺血性再灌注后產(chǎn)生的腦損傷是腦梗死形成的另一個主要途徑，往往與Ca2+內(nèi)流增加，Ca2+超負荷相關。細胞內(nèi)Ca2+超負荷，大量Na+內(nèi)流及氧自由基劇增又可導致神經(jīng)細胞凋亡，后者是缺血性腦細胞壞死的重要形式，是形成腦梗死的機理之一。
目前對急性缺血性腦血管病(急性缺血腦卒中、急性腦梗死)仍未有理想的治療藥物。針對上述發(fā)病機理，最常用的治療方法是，在發(fā)病超早期或早期使用溶栓藥(如tpA等)或降纖藥物(如蛇毒降纖酶，巴曲酶及ancrode等)。通過溶解血栓使腦組織缺血區(qū)重新恢復血流供應。然而隨著缺血區(qū)的血液重供應，必不可避免地產(chǎn)生腦細胞缺血/再灌注損傷。其臨床療效仍有待評估。此外，臨床還采用腦保護藥，阻斷缺血后細胞壞死的不同機理，延長細胞生存能力，也可用于病危患者預防，促進后期神經(jīng)元功能恢復，以達到治療目的。該領域是當今研究的熱點。目前可用的腦保護藥有1．Ca2+通道拮抗藥此類藥物主要是通過阻斷電壓依賴性Ca2+通道，抑制細胞Ca2+內(nèi)流，減輕細胞內(nèi)Ca2+超負荷，達到治療目的；臨床應用的藥物包含尼莫地平(nimodipine)及氟桂利嗪類。但急性缺血性腦血管病中導致腦組織損害的細胞內(nèi)Ca2+超負荷主要是與受體操縱的Ca2+通道相關，故這類阻斷電壓依賴性Ca2+拮抗藥，治療效果仍有待證實。2．穩(wěn)定細胞膜藥物胞磷膽堿，其療效仍有待證實。至于其他腦保護藥，如谷氨酸拮抗劑，Na+通道拮抗劑，γ-氨基丁酸增強劑等，在理論上有一定依據(jù)，但至今還未被臨床研究證實其療效。
人參、三七是中國名貴中藥，作為活血化瘀藥方廣泛應用于治療與中醫(yī)“血瘀證”相關的疾病，如冠心病、偏頭痛等，取得良好的療效。但對其中治療急性缺血性腦血管病的有效成分的研究較少，更無從知道其治療“血瘀癥”的作用機理。
本發(fā)明的目的就是為了克服目前無治療效果好、毒副作用小的急性缺血性腦缺血管病的治療藥物的缺點，提供一種治療效果好，毒副作用小的治療急性缺血性腦血管病的藥物。
本發(fā)明的另一個目的就是為提供三七、人參中提取的一種化合物及其提取方法，該化合物具有抗腦缺血/再灌注損傷、治療急性缺血性腦血管病的作用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。
本發(fā)明的化合物[以下稱化合物(Ⅰ)]化學名為20-(S)-原人參二醇-3-[O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷20(S)-protopanaxadiol-3-[O-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-β-D-glucopyranoside化學結構式 本發(fā)明的提取工藝步驟主要為取人參屬植物人參或三七的主根和/或須根。
1．生藥經(jīng)粉碎，以工業(yè)酒精(如含80％～90％乙醇濃度)冷提1次，再熱提0～3次，合并濾液，經(jīng)回收乙醇后，加正丁醇提取得粗總皂甙。
2．粗總皂甙先經(jīng)硅膠柱色譜用梯度洗脫液分離，如以氯仿(85％～60％)-甲醇(15％～30％)-水(0％-10％)按不同比例配制洗脫液，進行梯度洗脫，以柱體積的1/3～1/5為1份收集洗脫液，以TLC檢測，收集Rf值與對照相近似組分，合并后，回收溶劑，得到煎膏狀濃縮液。
3．煎膏狀濃縮液用適量甲醇溶解后，于C8～C18反相柱用梯度洗脫液分離及純化，共進行一至兩次反相柱色譜，如采用甲醇(50％～100％)-水(50％～0％)不同比例的洗脫液進行梯度洗脫，以柱體積的1/3～1/5為1份洗脫液，經(jīng)TLC檢測，收集所需組分。在第一次反相柱色譜后，單體純度可達90％，第二次反相柱色譜后，單體純度已達95％，最佳時可達98％以上的純度。收集液經(jīng)回收甲醇，再靜置24h以上，即析出白色沉淀。傾去上層液后的沉淀于真空干燥處理，即得到所需高純度化合物(Ⅰ)。
取化合物(Ⅰ)單體，檢測其理化性質，進行元素分析，測定其質譜、紅外、紫外光譜、1H、13C核磁共振，其條件和結果為理化性質白色或微黃色粉末，熔點209-214℃，易溶于低級醇、丙酮、氯仿、熱水。
比旋度[α]D22+19.38°(c=1.03,MeOH)元素分析C48H82O18·3H2O，計算(％)C57.62，H8.79，實驗(％)C57.32，H8.93FAB-MS(m/e)969[M+Na]+,946[M]+,789[M+Na-180]+,721[789-68]+,627[789-163+H]+，587[789-179-Na]+,407[789-341-H2O-Na]+,203[180+Na]+,145[180-2H2O+H]+,109(基峰)IR(νKBrmaxcm-1)3395[s,b,ν(OH,H2O)], 2945、2882[s,ν(CH3,CH2,CH)],1651[m,b,ν(C=C)+ν(OH)],1454[m,ν(CH3)+ν(CH2)],1384[m,ν(CH3)+ν(CH)],1082、1032[s,ν(C-O)]1H-NMR[C5D5N，譜寬5037.5Hz(10ppm)]共有82個質子峰，其中甙元含50個，葡萄糖和木糖含32個。在0.8-1.6ppm之間有8個甲基，0.789、1.070、1.245ppm峰為連在8位和4位碳上的18-CH3、29-CH3和28-CH3峰；0.84(2×CH3)和1.598ppm(3×CH3)峰為連在10、14位和25、20位碳上的19-CH3、30-CH3和26-CH3、27-CH3、21-CH3峰。3.24ppm峰為3位連氧的叔碳質子峰，4.04ppm峰包含12位連羥基的叔碳質子峰。5.24ppm峰為24位烯氫峰。3.8～5.3ppm峰組主要為葡萄糖和木糖的CH、CH2質子峰。5.7～7.9ppm寬峰組為糖環(huán)中的11個羥基質子峰。其氫譜數(shù)據(jù)如下δ0.65(1H,d,J=11.5Hz,5-H),0,73(1H,q,J=11Hz,1-H),0.789(3H,s,18-CH3),0.84(6H,s,19、30-CH3),1.00(3H,t,J=12Hz,CH3),1.07(3H,s,29-CH3),1.21(1H,t,J=7.5Hz,-H),1.245(3H,s,28-CH3),1.34(3H,m,6、11、15-H)，1.52(3H,m,1、9、15-H)，1.598(9H,s,21、26、27-CH3),1.81(3H,m,J=10.5Hz,2、16、22-H),1.94(2H,t,J=10Hz,13、16-H),2.16(1H,d,J=12.5Hz,2-H),2.21(1H,m,23-H),2.34(1H,t,J=11Hz,22-CH),2.44(1H,s(br),23-H),2.50(1H,q,J=9Hz,17-H),3.24(1H,dd,J=8,3.5Hz,3位連氧CH),3.87(1H,s,OH),3.94(1H,t,J=8Hz,20-glc-2H),4.04(4H,q,J=8Hz,12-H,OH,glc-2H),4.11(2H,t,J=9Hz,3-glc-2H,20-glc-3H),4.18(3H,m,J=8Hz,CH),4.24(4H,m,J=9Hz,CH),4.41(3H,m,J=11.5Hz,CH),4.50(1H,d,J=11Hz,CH),4.86(1H,d,J=7.5Hz,20-glc-1H),5.12(1H,d,J=8Hz,glc-1H),5.24(1H,t,24-H),5.29(1H,d,J=7.5Hz,3-glc-1H),5.61(1H,s,CH),5.71(1H,s(br),OH),6.08(1H,s(br),OH),6.28(1H,s(br),OH),7.03(3H,s(br),OH),7.22(3H,s(br),OH),7.49(1H,s(br),OH),7.84(1H,s(br),OH)13C-NMR[C5D5N,500MHz，譜寬26016.3Hz(200ppm)]共48個有效峰，由DEPT譜確定CH3碳峰8個，CH2碳峰12個，CH碳峰22個，季碳峰6個，其中甙元30個碳峰，余下的18個分屬3個吡喃糖。其碳譜數(shù)據(jù)如下δ:15.88(q,CH3),16.19(q,CH3),16.50(q,CH3),17.27(q,CH3),17.72(q,CH3),18.35(t,CH2),22.37(q,CH3),23.17(t,CH2),25.70(q,CH3),26.55(t,CH2),26.63(t,CH2),28.00(q,CH3),30.71(t,CH2),30.71(s,C),35.06(t,CH2),35.96(t,CH2),36.81(s,C),39.11(t,CH2),39.60(s,C),39.93(s,C),49.29(d,CH),50.08(d,CH),51.35(s,C),51.65(d,CH),56.32(d,CH),62.65(t,CH2),62.73(t,CH2),62.73(t,CH2),70.18(d,CH),71.38(d,CH),71.54(d,CH),71.54(d,CH),74.97(d,CH),76.85(d,CH),77.67(d,CH),77.88(d,CH),78.05(d,CH),78.05(d,CH),78.16(d,CH),78.97(d,CH),83.17(d,CH),83.26(d,CH),88.94(d,CH),98.12(d,CH),104.93(d,CH),105.76(d,CH),125.82(d,CH),130.86(s,C)UV(λmax,nm):200.80經(jīng)7％H2SO4及50％乙酸水解，證明甙元為人參二醇，糖部份為葡萄糖，有1分子葡萄糖結合于C20位。
化合物(Ⅰ)對大鼠局部性腦缺血/再灌注損傷的治療作用結果為采用SD大鼠局部性腦缺血/再灌注損傷模型觀察化合物(Ⅰ)的治療作用，試驗結果表明，靜脈注射50mg/kg,10mg/kg及2mg/kg劑量的化合物(Ⅰ)，均能明顯減少大腦中動脈栓塞/再灌注引起的腦組織壞死區(qū)面積、減輕神經(jīng)細胞壞變及神經(jīng)纖維變性、減少氧自由基的生成、減輕腦組織水腫程度及腦電幅度下降程度、改善受試動物的行為障礙，其治療作用呈劑量依賴性。主要藥效學試驗結果同時說明，化合物(Ⅰ)的治療作用優(yōu)于陽性對照藥物尼莫地平。
具體實施如下實驗動物采用longa法制備大腦中動脈栓塞/再灌注損傷大鼠模型。靜脈注射25％烏拉坦(0.4ml/100g體重)麻醉動物，用加熱燈保持鼠體溫37±0.5℃(肛溫)。將大鼠仰臥固定于方板上，頸部正中切口，通過顯微外科技術，分離左頸總動脈及其分叉，游離頸外動脈。電凝切斷頸外動脈發(fā)出的枕動脈、甲狀腺上動脈、咽外動脈，再向頭端游離頸外動脈，用5-0絲線盡量靠遠端結扎頸外動脈。用血管夾夾閉頸外動脈的起始部，在血管夾與結扎線之間，用5-0絲線穿過頸外動脈打松結?？拷Y扎剪斷頸外動脈，把一根長5cm的頭端成鼓錘狀3-0單絲尼龍線置入頸外動脈，扎緊頸外動脈上的絲線避免出血。去掉血管夾，將尼龍線緩慢推入頸內(nèi)動脈，調整方向將尼龍線插進顱腔，感受到阻力時即達大腦前動脈。從頸內(nèi)動脈起始部開始計算，尼龍線插入深度一般在20～21mm時，大腦中動脈起始處被阻斷，同時也阻斷了來自前腦動脈、頸內(nèi)動脈及后腦動脈的側枝血流。然后將松結于頸外動脈殘端的絲線再打三結結扎，縫合切口，把尼龍線引出皮膚切口處，以便拔出形成再灌注時使用。拔出尼龍線時，動作緩慢輕柔，感到阻力后即停止抽拔，此時已表明栓塞的尼龍線膨大的頭端已經(jīng)退至頸外動脈的殘端內(nèi)，再灌注已形成。
(2)試驗分組各組實驗中，化合物(Ⅰ)及對照藥物均采用靜脈注射方式給藥，注射容量相同。
動物用隨機抽樣分組。
本實驗規(guī)定栓塞缺血1小時后形成再灌注，再灌注5小時后觀察規(guī)定指標。并設實驗分組如下
觀察指標1．腦梗塞范圍測定開顱取全腦，去除嗅球、小腦及腦干，以2.7mm為間隔將大腦冠狀切成厚度相等的6個切片。從額端向枕端依次定為1、2、3、4、5、6，每個切片的額端為A面，枕端為B面。將切片2、3、4放入1％TTC(氯化三苯基四氮唑，使用時用蒸餾水溶解并避光保存)中，避光，在37℃水浴中染色10分鐘。正常組織內(nèi)含脫氫酶與TTC反應呈紅色，梗塞組織因脫氫酶丟失不能與TTC產(chǎn)生反應而呈白色。組織與TTC反應呈現(xiàn)的白色顯色程度反映了梗塞腦組織的變性壞死程度。腦組織梗塞范圍通過全自動圖象分析系統(tǒng)(型號IPAS-C，德國Kontror公司)測定，組織變性壞死程度可通過該分析系統(tǒng)用灰度表示出來，程度越嚴重灰度越大。本實驗采用切片2、3測定值的平均數(shù)作為每動物梗塞區(qū)范圍的測定結果。
2．腦組織含水量測定參考Gotoh法，快速取出鼠腦，把左右大腦半球用十萬分之一電子自動天平分別稱重，然后置160℃烤箱內(nèi)烤干至恒重，分別稱量大腦半球干重，按以下公式計算腦組織含水量含水量(％)=[(濕重-干重)/濕重]×100％3．病理檢查經(jīng)TTC染色后的腦片置10％福爾馬林中固定，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟后采用常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色，顯示神經(jīng)細胞壞變；采用髓鞘染色顯示神經(jīng)纖維是否脫髓鞘及脫髓鞘程度。
4．腦電圖描記將一根針電極置于額頂區(qū)，另一電極置于栓塞側的鼠耳皮下，作為參考電極，用日本光電公司8導生理記錄儀記錄栓塞前后的皮層外腦電變化。
5．生化試驗大鼠38只，腦缺血/再灌注損傷后隨機分對照組(等容量生理鹽水)、尼莫地平治療組(40μg/kg)及化合物(Ⅰ)治療組(50mg/kg)，于堵塞腦缺血后10分鐘及再灌注后5分鐘，分二次舌下iv給藥。缺血1小時，再灌注5小時后按Gotoh方法，快速剝出大鼠腦，將左、右大腦半球分別稱重，然后置-70℃冰箱保存。
將待測組織(約0.3～0.5)用生理鹽水洗凈，然后用冷蒸餾水(4℃)在玻璃勻漿器上制成10％勻漿。在0℃,1500轉/分離心15分鐘，取上清液進行超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量測定。
(1)SOD測定(鄰苯三酚自氧化法)取15ml試管，依次加入pH8.2Tris-HCl緩沖液4.5ml，雙蒸水4.3ml，樣本勻漿液0.1ml,7mmol/L鄰苯三酚0.1ml(空白管加10mmol/L HCl 0.1ml)。將空白管校零。用紫外分光光度計(UV 1601 PC，日本島津公司)，在波長325nm，狹縫2，測定吸光度變化。然后按以下公式求出SOD活性單位。
(2)MDA測定按下表程序進行
搖勻加蓋，95℃水浴加熱60min，冷卻后，3000r/min離心15min。取上清液用分光光度計532nm波長測定吸光度值，然后在MDA的標準曲線上求得MDA含量。
6．參考Longa方法，于再灌注后5小時觀察行為變化進行評分。評分標準如下無行為改變，0分；右前肢不能伸直，1分；偏向右側但無主動打圈，2分；右側行走，3分；原地右旋轉，4分；右偏癱，5分。
實驗結果1．對梗塞面積的影響實驗結果表明，2～50mg/kg化合物(Ⅰ)能夠減輕腦缺血/再灌注所致的腦組織損傷，明顯減小腦組織栓塞面積，減輕受損腦組織的壞死程度。其治療作用呈劑量依賴性。尼莫地平治療組表現(xiàn)出減小腦組織梗塞面積的傾向，但是只有在40μg/kg高劑量組才與鹽水組有統(tǒng)計學上的顯著性差異(p＜0.05)，但總的治療作用弱于化合物(Ⅰ)的治療組。
2．對腦電影響實驗結果表明，鹽水組大腦動脈栓塞1小時，再灌注5小時后腦電幅度明顯減低。50mg/kg及10mg/kg劑量的化合物(Ⅰ)能明顯改善腦電的變化，腦電幅度的降低明顯減小(p＜0.01)。2mg/kg劑量組有改善腦電變化的傾向，但統(tǒng)計學上沒顯著性差異。尼莫地平在劑量為40μg/kg劑量組時能表現(xiàn)出改善腦電變化的作用(p＜0.05)。
3．對神經(jīng)細胞及神經(jīng)纖維病理變化的影響實驗結果表明，靜脈注射50mg/kg、10mg/kg及2mg/kg化合物(Ⅰ)均可減輕神經(jīng)細胞的壞變數(shù)目及神經(jīng)纖維變性的程度，其保護作用呈劑量依賴性并強于尼莫地平。
4．對行為改變的影響實驗結果表明，生理鹽水對照組行為評分為3.3±1.0；尼莫地平組為2.9±1.2(P＞0.05，與生理鹽水比較)?；衔?Ⅰ)治療組為1.9±0.8(P＜0.01，與生理鹽水組比較)?；衔?Ⅰ)治療組能明顯改善由腦組織損傷所致的嚴重行為障礙。尼莫地平治療組與鹽水組比較沒有統(tǒng)計學上的顯著性差異。
5．對SOD活性及MDA含量的影響實驗結果表明生理鹽水組的SOD活性明顯降低，從正常對照組(假手術組)的70.30±24.7u/g明顯降至46.7±16.6u/g(P＜0.05)。用化合物(Ⅰ)治療組及尼莫地平治療組的SOD活性與正常對照組比較無統(tǒng)計學上的顯著性差異(P＞0.05)。鹽水組的MDA含量為87.7±27.5nmol/mg組織重，與正常對照組(假手術組)(60.0±14.8nmol/mg組織重)相比，明顯升高(P＜0.01)?；衔?Ⅰ)治療組和尼莫地平治療組可使MDA含量降下近至正常組，分別為65.8±19及67.0±21.8nmol/mg組織重(與正常組比較P＞0.05)。
6．對腦組織含水量的影響實驗結果表明，靜脈注射化合物(Ⅰ)能明顯減少因腦缺血/再灌注引起的梗塞區(qū)腦組織含水量增加。而20μg/kg尼莫地平雖有減少傾向，但與生理鹽水組比較統(tǒng)計學上沒有顯著性差異。
結論實驗結果表明，靜脈注射50mg/kg、10mg/kg及2mg/kg劑量的化合物(Ⅰ)均能明顯減少大腦中動脈栓塞/再灌注引起的腦組織壞死面積、減輕神經(jīng)細胞壞變及神經(jīng)纖維變性、減輕腦組織水腫程度、減少氧自由基的生成及腦電幅度下降程度、改善受試動物的行為障礙，其治療作用呈劑量依賴性并優(yōu)于陽性對照藥物尼莫地平。
綜合以上資料表明，化合物(Ⅰ)對腦栓塞/再灌注引起的腦組織損傷壞死有明顯的治療作用。可用于治療急性缺血性腦血管病。
化合物(Ⅰ)的急性毒性試驗的結果為小鼠 靜脈給藥 LD50 356.18mg/kg95％可信限為346.01～366.64mg/kg肌肉注射 LD50 583.96mg/kg95％可信限為564.77～603.79mg/kg化合物(Ⅰ)的慢性試驗的結果為大鼠ⅳ化合物(Ⅰ)14天，主要引起大鼠注射局部尾靜脈內(nèi)膜炎。病變的損傷程度與藥物劑量成正相關。10、30mg/kg有輕微局部刺激，100mg/kg為有毒劑量。
三致試驗結果表明，化合物(Ⅰ)無三致作用，即無致畸、致癌、致突變作用。骨髓微核試驗表明，化合物(Ⅰ)并不誘發(fā)骨髓嗜多染紅細胞微核的形成。
總之，化合物(Ⅰ)對腦缺血/再灌注損傷有良好的治療作用，且毒性作用小，臨床上可應用于急性缺血性腦血管疾病、中風、腦出血、腦栓塞引起的腦缺血/再灌注引起的腦細胞損傷、壞死的治療。
藥理實理表明，化合物(Ⅰ)具有與目前臨床使用的Ca2+通道阻斷劑的不同特性，后者只對電壓依賴性Ca2+通道有阻斷作用，而對受體操縱Ca2+通道極少作用。相反，化合物(Ⅰ)只對受體操縱Ca2+通道有特異阻斷。急性缺血性腦血管病相關的Ca2+內(nèi)流增多，主要與受體操縱Ca2+通道相關，化合物(Ⅰ)是通過這一新作用靶點，干擾促使腦細胞死亡的共同通路-Ca2+內(nèi)流增多，胞內(nèi)Ca2+超負荷，達到治療腦缺血/再灌注損傷、腦梗死的目的。因而其治療效果好。
化合物(Ⅰ)治療急性缺血性腦血管病，通常采用以下治療方案制備成粉針劑或注射液，肌注或靜脈注射10～30mg/次，每12小時一次，7～14天為一療程。也可以采用口服劑型，不過劑量應加倍。也可以與其它藥物作成復方制劑，如與溶栓藥(如tpA等)復方，如與降纖藥物(蛇毒降纖酶等)復方，如與胞磷膽堿復方等，能達到增強作用甚至協(xié)同治療效果。
化合物(Ⅰ)在3位上的葡萄糖基減少一個，也具有類似的效果，即為化合物20-(S)-原人參二醇-3-[O-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷?；衔?Ⅰ)在3位上的一個葡萄糖基為其它的單糖取代，如鼠李糖等，也具有相類似的效果。
化合物(Ⅰ)也可以制備成琥珀酸鹽衍生物(如鉀、鈉)供藥用。
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1，取三七的主根和須根，粉碎，1kg生藥粉末用含乙醇85％的工業(yè)酒精冷浸過夜，濾過，殘渣再用85％酒精熱提3次，每次2h，取濾液合并，回收乙醇后，濃縮液經(jīng)正丁醇提取得粗總皂甙。將粗總皂甙在65×1300mm的色譜柱(裝填100～200目的柱層析硅膠1200g)上，依次用氯仿(83％)-甲醇(16％)-水(1％)、氯仿(76％)-甲醇(22％)-水(2％)、氯仿(68％)-甲醇(28％)-水(4％)，氯仿(65％)-甲醇(30％)-水(5％)、氯仿(61％)-甲醇(33％)-水(6％)等不同比例的洗脫液進行梯度洗脫，每550ml為1份收集洗脫液，以TLC檢測，Rf相近組分合并后，回收溶劑，得到煎膏狀濃縮液。將煎膏狀濃縮液用少量甲醇溶解后，于C18反相柱分離及純化，依次用甲醇(60％)-水(40％)、甲醇(65％)-水(35％)、甲醇(70％)-水(30％)、甲醇(80％)-水(20％)、甲醇(85％)-水(15％)、甲醇(100％)-水(0％)不同比例的洗脫液進行梯度洗脫，以每份100ml收集洗脫液，經(jīng)TIC檢測，收集與標準品Rf值相同的組分。經(jīng)回收甲醇濃縮后，再按上述方法經(jīng)第二次反相柱純化。收集液回收甲醇，再靜置24h，即析出白色沉淀。傾去上層液，沉淀物于40℃真空干燥，即得到純度達98％的單體3.0g。
實施例二，取人參的主根和須根，其余同實施例1。
實施例三，取三七的主根和須根，第一次梯度洗脫液為氯仿(80％～55％)-乙酸乙酯(15％～30％)-水(5％～15％)，極性逐漸增強，反相柱純化梯度洗脫液為乙醇(60％～100％)-水(40％～0％)，極性逐漸減弱。
本發(fā)明的各實施例經(jīng)二次柱層析洗脫，均達到較高的單體純度。本發(fā)明不限于上述實施例。
權利要求
1．一種化合物(Ⅰ)，化學名為20-(S)-原人參二醇-3-[O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，其結構式為
2．一種如權利要求1所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，取人參屬植物人參或三七的主根和/或須根，提取工藝步驟依次包括(1)生藥經(jīng)粉碎，以工業(yè)酒精冷提1次，再熱提0～3次，合并濾液，經(jīng)回收乙醇后，加正丁醇提取得粗總皂甙；(2)粗總皂甙先經(jīng)硅膠柱色譜用梯度洗脫液分離，以TLC檢測，收集Rf值與對照相近似組分，合并后，回收溶劑，得到煎膏狀濃縮液；(3)煎膏狀濃縮液用適量甲醇溶解后，于C8～C18反相柱用梯度洗脫液分離及純化，共進行一至二次反相柱色譜，以柱體積的1/3～1/5作為1份洗脫液，經(jīng)TLC檢測，收集所需組分；收集液經(jīng)回收甲醇，再靜置24h以上，即析出白色沉淀；傾去上層液后的沉淀于真空干燥處理，即得到高純度單體。
3．根據(jù)權利要求2所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于硅膠柱色譜的梯度洗脫液為氯仿(85％～60％)-甲醇(15％～30％)-水(0％～10％)，極性逐漸增強。
4．根據(jù)權利要求2或3所述化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于硅膠柱色譜的梯度洗脫液依次為氯仿(83％)-甲醇(16％)-水(1％)、氯仿(76％)-甲醇(22％)-水(2％)、氯仿(68％)-甲醇(28％)-水(4％)，氯仿(65％)-甲醇(30％)-水(5％)、氯仿(61％)-甲醇(33％)-水(6％)。
5．根據(jù)權利要求2所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于C8～C18柱色譜的梯度洗脫液為甲醇(50％～100％)-水(50％～0％)，極性逐漸減弱。
6．根據(jù)權利要求2或5所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于C8～C18反相柱色譜的梯度洗脫液依次為甲醇(60％)-水(40％)、甲醇(65％)-水(35％)、甲醇(70％)-水(30％)、甲醇(80％)-水(20％)、甲醇(85％)-水(15％)、甲醇(100％)-水(0％)。
7．化合物(Ⅰ)應用于制備治療急性缺血性腦血管病的藥物。
8．根據(jù)權利要求7所述的化合物(Ⅰ)應用于制備治療急性缺血性腦血管病的藥物，其特征在于劑型為粉針劑或注射液。
9．根據(jù)權利要求7所述的化合物(Ⅰ)應用于制備治療急性缺血性腦血管病的藥物，其特征在于化合物(Ⅰ)與其它藥物復方制成復方制劑。
全文摘要
一種化合物(I),其提取方法及其在制備治療急性缺血性腦血管病藥中的應用。取人參屬植物人參或三七的主根和/或須根,經(jīng)工業(yè)酒精提取、正丁醇提取總皂甙、經(jīng)硅膠柱色譜和反相柱色譜純化,得化合物(I)。該化合物在制備治療急性缺血性腦血管病的藥物中得以應用。
文檔編號C07J9/00GK1302811SQ0011400
公開日2001年7月11日 申請日期2000年1月3日 優(yōu)先權日2000年1月3日
發(fā)明者關永源, 范富林 申請人:廣東泰禾生物藥業(yè)有限公司, 中山醫(yī)科大學科技開發(fā)部