一種雜帖類化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雜帖類化合物及其制備方法。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的雜帖類化合物，可以從干燥的蛇床子中提取、分離純化得到。本研究證實該化合物對破骨細胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在濃度依賴關(guān)系。應(yīng)用化合物(Ⅰ)治療以破骨細胞活性增強為主的骨破壞性疾病有可能成為一種有前景的治療方法，可以用來開發(fā)成治療骨破壞性疾病的藥物。
【專利說明】
-種雜帖類化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及從干燥的蛇床子中分離得到的一種具有治療 骨破壞性疾病作用的雜帖類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物蛇床子為一年生草本植物，高30~80cm。莖直立，有分枝，表面有縱溝紋，疏生 細柔毛。葉互生，2~3回羽頭細裂，最終裂片線狀披針形，先端尖銳;基生葉有長柄，柄基部 擴大成銷狀。復傘形花序頂生或蔽生;總巷片8~10,線形;花白色，花柱基短圓錐形，花柱細 長，反折。雙懸果寬楠圓形，果棱具翅。花期4~7月，果期6~8月。生于原野、田間、路旁、溪溝 邊等潮濕處。
[0003] 中藥蛇床子為傘形科（Umbelliferae)蛇床屬植物蛇床Cnidium monnierUL.) 化ss.的干燥成熟果實。蛇床子性溫，味辛苦，有小毒。外用燥濕殺蟲止癢，內(nèi)服溫腎壯陽，桂 風燥濕。用于治療陽瘦，宮冷，寒搏腰痛，外治滴蟲性陰道炎，手、足癖感染等。國內(nèi)外關(guān)于蛇 床子藥理效應(yīng)的報道很多，設(shè)及免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌、屯、血管、呼吸及生殖等系統(tǒng)，主要表現(xiàn) 為抗炎、抗過敏、中樞抑制、抗屯、律失常及抗腫瘤等作用。
[0004] 蛇床子主要含香豆素類化合物，此外還有色原酬類和苯并巧喃類化合物。蛇床子 揮發(fā)油中，相對含量較高的組分主要有倍半祗類，此外還有醋類和祗醇類化合物。大量研究 證明蛇床子的有效成分為香豆素類化合物，其中含量最高的兩種香豆素類化合物為蛇床子 素(0sthole，0st)、歐前古月素（Imperatorin，Imp)。
[0005] 因此Ost及Imp經(jīng)常作為評價不同來源地的蛇床子藥材的質(zhì)量及含蛇床子中成藥 的質(zhì)控指標。由于Ost具有許多重要的藥理活性包括抗癌、抗增殖等活性，W及Imp具有抑制 癒痛發(fā)作、擴張血管、抑制屯、肌肥大、抑制腫瘤細胞增殖、抗微生物、影響藥物代謝酶活性等 多種藥理作用，而受到越來越多的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的蛇床子中分離得到的一種具有治療骨破壞性 疾病作用的雜帖類化合物及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實現(xiàn)的：
[0008] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含w下操作步驟：（a)將干燥的蛇床子粉碎，用75 ~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的 正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸 乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用75%乙醇洗脫8個柱體積， 收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏 用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫 得到5個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和5: 1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] 進一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80%。
[0013] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學上可接受的載 體。
[0014] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0015] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 W及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物W單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0017] 實驗表明化合物（I)對破骨細胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在濃度依賴關(guān) 系。應(yīng)用化合物（I)治療W破骨細胞活性增強為主的骨破壞性疾病有可能成為一種有前景 的治療方法。
【附圖說明】
[0018]圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0019 ]圖2為化合物（I)理論ECD值與實驗ECD值比較。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可W對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0021] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0022] 試劑來源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲燒為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[002；3]制備方法：（a)將干燥的蛇床子(8kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取偵LX3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水飽和的正 下醇(化X3次)萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(351g)和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用 75%乙醇洗脫8個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（133g); (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(8個柱體積）、65:1 (8個柱體積）、30:1(6個柱體積）、15:1(8個柱體積)和1:1(5個柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯 度洗脫得到5個組分；（d)步驟(C)中組分4(31g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為 25:1(8個柱體積）、15:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3 個組分；（e)步驟(d)中組分2(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度 為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I)(31mg)。
[0024] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 359.1112，結(jié)合核磁特征可得分子式為 Ci7出日〇7，不飽和度為8。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)δκ(郵m，DMSO-ds，600MHz): H-2 (6.43，S)，H-5 (3.26，d，J=15.1)，H-5(2.65，d，J=15.1)，H-8(2.37，m)，H-8(2.25，m)，H-9(1.91，dd，J = 12.7,7.3)，H-9a.35，m)，H-ll(3.81，s)，H-15(1.21，s)，H-16(1.29，s)，l-OH(12.87，s)，4- 0H(8.75，s)，6-OH(4.73，s)，3-OC出（3.85，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMSO-ds，125MHz): 158.5(C，l-C)，99.0(CH，2-C)，154.2(C，3-C)，138.7(C，4-C)，30.9(Ol2,5-C)，89.8(C，6- C)，202.7(C，7-C)，24.6(Ol2,8-C)，31.4(ai2,9-C)，64.3(C，10-C)，73.9(CH，ll-C)，199.3 (C，12-C)，114.2(C，13-C)，122.6(C，14-C)，21.3(CH3，15-C)，16.7(CH3，16-C)，56.1(CH3,3- OC曲）；碳原子標記參見圖1。紅外光譜表明該化合物含有徑基基團（3442cm-i);此外該化合 物在373和294nm有紫外吸收，說明含有多共輛結(jié)構(gòu)。1? NMR譜和服Q幻普顯示有17個碳信號， 分別為Ξ個甲基(包括一個甲氧基），Ξ個亞甲基，兩個次甲基(一個締控碳，一個含氧碳 及九個季碳(兩個幾基碳，兩個締控碳，兩個含氧季碳，Ξ個締控含氧季碳）。另外，一個締控 質(zhì)子信號姐 6.43(lH，s，H-2)，W 及六個締碳信號 SC158.5(C，1-C)，99.0(CH，2-C)，154.2(C， 3-C)，138.7(C，4-C)，114.2(C，13-C)和 122.6(C，14-C)，表明該化合物含有一個五取代的苯 環(huán)結(jié)構(gòu)。HMBC譜中，徑基質(zhì)子（SH12.87，s，l-OH)與C-1，C-2，C-13W及SC199.3(s，12-C)的相 關(guān)性表明幾基碳(C-12)與苯環(huán)C-13位相連，該化合物在373和294皿的紫外吸收也驗證了運 一結(jié)論。HMBC譜中，徑基質(zhì)子δ冊.75(lH，s，4-OH)與SC138.7(C，4-C)，154.2(C，3-CWP122.6 (C，14-C);甲氧基質(zhì)子姐3.85(s，3-0C出)與C-3; W及H-2與C-3的相關(guān)性表明徑基和甲氧基 分別位于C-4和C-3位上。去除苯環(huán)和甲氧基的屯個碳，剩余的10個碳原子形成了一個十元 環(huán)單祗結(jié)構(gòu)。此外，兩個含氧碳信號SC64.3(C，10-C)和73.9(CH，11-C)表明存在一個10,11- 環(huán)氧基團。HMBC譜中，H-11 (如3.79，s)與C-12和 010;曲-16(5刖.28,3)與010和(：-16(5 C16.0)的相關(guān)性驗證了上述推論。綜合氨譜、碳譜、HMB村普和ROESY譜，W及文獻關(guān)于相關(guān)類 型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過EC的式驗確定，理論值與 實驗值基本一致(圖2)。
[0025] 實施例2:化合物（I)藥理作用試驗
[002引一、材料和儀器
[0027] SD雄性大鼠（4周齡)購于河北醫(yī)科大學動物實驗中屯、，清潔級，體重150g?；衔?(I)自制，冊LC歸一化純度大于98%。1〇,25(0恥〇3購于英國普利茅斯生物研究實驗室。α- ΜΕΜ培養(yǎng)基購于美國GIBC0B化。Soluble RANKL購于英國化protec Science。抗酒石酸酸性 憐酸酶(TRAP)試劑盒購于美國Sigma公司。葡聚糖凝膠購于上海如吉科技發(fā)展有限公司。標 準胎牛血清購于山東銀香偉業(yè)生物有限公司。注射用青霉素鋼購于華北制藥有限公司。注 射用硫酸鏈霉素購于深圳華藥南方制藥有限公司。丙酬、甲醒溶液購于石家莊市有機化工 廠。異氣燒購于魯南貝特制藥有限公司。二甲基亞諷購于天津市光復精細化工研究所。
[0028] BB5060/BB16二氧化碳培養(yǎng)箱(上?；痳aeus公司），VD-650型桌上式細胞培養(yǎng)超凈 操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），BFX5-320型低速離屯、機（中國上海滬南科學儀器聯(lián)營 廠），XD-1019810倒置顯微鏡(江南公司），CX-21光學顯微鏡（日本OLYMPUS)，微量加樣器(法 國GILS0N)，2510型變頻振蕩儀(上海新波生物技術(shù)有限公司），GF-300型電子天(JapanA&D Company，limited)，725型超低溫冰箱化orma Scientific. Inc)。未提到的材料和儀器均為 常規(guī)儀器。未提到的溶液配制均采用本領(lǐng)域常規(guī)溶液配制方法配制即可。
[0029] 藥液配制及葡聚糖凝膠柱的制備：
[0030] 1、α-ΜΕΜ培養(yǎng)液的制備：
[0031] (Ι)α-ΜΕΜ粉一袋+超純水800ml，完全溶解；
[0032] (2)加碳酸氨鋼3.0?待完全溶解后加鹽酸測PH達7.2;
[0033] (3)再次加超純凈水至1000ml;
[0034] (4)加抗生素(青霉素及鏈霉素）；
[0035] (5)濾過滅菌(0.22微米微孔濾膜過濾）
[0036] (6)500ml滅菌瓶分裝，4°C儲藏備用。
[0037] 2Ja，25(0H)2D3 儲存液的分裝
[003引 （1)取1α，25(0H)2化原液50微升（50微升一支），加入無水乙醇1150微升，使總量至 1200微升（即24倍稀釋）
[0039] (2)W100微升/只分裝于12支滅菌試管內(nèi)，-30°C冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?br>[0040] (3)應(yīng)用前再次稀釋1000倍，使最終濃度為IX 10-8Μ。
[0041 ] 3、Soluble RANKL儲存液分裝
[0042] (1)取34歷17東干粉一支(10微克）；
[0043] (2)0.11 tris-肥 1 buffer 50微升溶解RANKL
[0044] (3) W5微升/只分裝于10支滅菌冷凍管內(nèi)，-30°C冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?br>[0045] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培養(yǎng)液495微升溶解（即稀釋100倍）；添 加前再次稀釋100倍，使終濃度為20ng/ml。
[0046] 4、0.1M tris-肥 1 buffer的制備
[0047] (l)tris-HCl 12.llg(0.1M)；
[004引 （2)超純水800ml(添加溶解后，調(diào)節(jié)pH至8.2);
[0049] (3)加超純水至1000ml備用。
[0050] 5、化合物(I)儲存液的制備
[0051 ] (1)儲存液的濃度：Img/ml及l(fā)OOug/ml。
[0052] (2)儲存液的配制：稱取化合物（I)lmg放于滅菌冷凍管內(nèi)，加入二甲基亞諷1ml完 全溶解，配成Img/ml的儲存液。從Img/ml的儲存液中取出100微升放于另一支滅菌冷凍管 內(nèi)，加入二甲基亞諷900微升即配成100微克/毫升的儲存液，儲存于4°C恒溫冰箱，使用時間 不超過兩周。Img/ml的儲存液冷凍保存。
[0化3] 6、TRAP固定液的制備
[0054]在染色之前，按產(chǎn)品說明書配制。首先取無菌20ml試管一支，按W下順序依次加入 試劑:丙酬6.5ml、構(gòu)祿酸2.5ml、甲醒0.8ml，充分混勻，計9.8ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0化日]7、TRAP染色液的制備
[0056] 同樣是在染色之前配制，按產(chǎn)品說明制備，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0057] 8、葡聚糖凝膠柱的制備
[005引（1)消毒后50ml注射器一個，除去內(nèi)忍；
[0059] (2)注射筒與注射頭交接處置消毒后的脫脂棉球一個；
[0060] (3)固定架固定針筒，針頭處接關(guān)閉狀的Ξ通；
[0061] (4)將滅菌的葡聚糖凝膠混勻，抽取30ml注入針筒內(nèi)，打開Ξ通，緩慢過濾沉淀，待 凝膠沉淀液面至15ml時為止;關(guān)閉Ξ通，放入4°C恒溫冰箱過夜；
[0062] (5)實驗前1小時用含有15 %胎牛血清的α-iffiM培養(yǎng)液50ml緩慢注入凝膠柱內(nèi)，打 開Ξ通，自然過濾洗涂凝膠柱后待用。
[0063] 二、試驗方法
[0064] 1、全骨髓細胞培養(yǎng) [00化]1.1全骨髓細胞提取
[0066] 實驗開始前30分鐘將標準胎牛血清放入37 °C水浴箱內(nèi)解凍;取50mL無菌離屯、管一 個，裝入40mL不含胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液，W備沖洗全骨髓細胞用。
[0067] (1)選4周齡SD雄性大鼠1只，75%乙醇消毒后，采用異氣燒吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，無菌條件下取大鼠兩側(cè)腔骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用lOmL注射器抽取 不含血清的曰-MEM培養(yǎng)液，換用25號針頭后自骨髓腔內(nèi)沖出骨髓細胞至50mL無菌離屯、管內(nèi)； (4)將所提取的細胞懸液充分吹打，待沒有團塊后，將盛有細胞的離屯、管與平衡管一起放入 離屯、機內(nèi)離屯、，調(diào)整轉(zhuǎn)速(2000轉(zhuǎn)/分），離屯、5分鐘；離屯、過程中配制含有15%胎牛血清的α- ΜΕΜ培養(yǎng)液50mL(7.5血胎牛血清加入42.5mLa-MEM培養(yǎng)液中）備用；（5)離屯、結(jié)束后棄去上清 液，加入含15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液20mL，充分吹打混勻，形成細胞懸液，此液簡稱為細 胞原液。
[0068] 1.2細胞數(shù)的計算(原液濃度及稀釋倍數(shù)）
[0069] (1)取W上提取的細胞懸液25化放入試管內(nèi)，然后加入5%醋酸47扣L，即形成20倍 稀釋的細胞懸液;將試管放在振蕩器上，振蕩20秒鐘，目的是去除紅細胞；（2)計算細胞數(shù)： 取振蕩后細胞懸液滴入細胞計數(shù)盤，勿超過邊緣，蓋玻片覆蓋，倒置顯微鏡下計算細胞數(shù)， 計數(shù)盤4個大格內(nèi)所有細胞均計入。本實驗計算細胞數(shù)為537個，根據(jù)公式(細胞數(shù)/4) X20 X104cells/mL推算細胞原液的濃度，本實驗計算如下（537/4)X 20 X 104 = 26.85 X 106cells/mL即本實驗細胞原液濃度為26.85X106cells/mL，而我們需要的目的濃度是2X 106cells/mL，所W細胞原液需要稀釋。（3)稀釋倍數(shù)計算如下:稀釋倍數(shù)二原液濃度/目的 濃度;本實驗稀釋倍數(shù)=26.85 X l〇6cells/mL/2 X l〇6cells/mL= 13.425，即原液需要稀釋 13.425倍才能達到需要的目的濃度。本實驗需要2乂106。6113/1^的細胞懸液4〇1^，簡稱為 目的量。（4)達到目的濃度所需原液的量，計算如下:達到目的濃度所需原液的量=目的量/ 稀釋倍數(shù)。本實驗計算如下：達到目的濃度所需原液的量= 40mL/13.425^2.98mL。即取 26.85 X 106cells/mL的細胞原液2.98mL放入滅菌的50mL離屯、管內(nèi)，然后加入37.02mL(40- 2.98)含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液即可配成2X106cells/mL的細胞懸液40mL，然后加入 Ια，25 (OH) 2〇3儲存液40yL，操作過程應(yīng)避光，即Ια，25 (0Η)203終濃度為1 X 10-8M ;再加入4μΙ soluble RANKL儲存液，即solubleRANKL終濃度為20ng/mM加液過程在超凈工作臺上操作， 至此，所需2X106cells/mL的細胞懸液目的量配置完成。
[0070] 1.3培養(yǎng)細胞、加藥
[00川 （1)細胞接種：取4行6列24孔培養(yǎng)板一塊，每孔加入2 X 106cells/mL的細胞懸液 0.5mLαxl06cells)。（2)加入化合物α):取100μg/mL化合物（I)分裝液一支于培養(yǎng)板的第 2列分別加入2.扣L，每加一孔均需換一個吸頭;第3列每孔加入扣レ第4列每孔加入10化。加 完第4孔后，將此液放入4°C恒溫冰箱保存，取Img/mL化合物(I)儲存液一支。第5列每孔加入 Img/mL化合物（I)儲存液2. 第6列每孔加入化L。加完后剩余藥液放入4°C恒溫冰箱保 存。第一列不加藥物，作為對照組。至此在24孔培養(yǎng)板中化合物（I)每行都有6個濃度，分別 為0、0.5、1、2、5、104邑/血，每個濃度每列4孔(11 = 4)，第一列為對照組。（3)培養(yǎng)細胞:加完藥 后，將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，在37°C、5 %C02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)7天。培養(yǎng)至第4天時 換培養(yǎng)液一次，按上述方法配制含有15%胎牛血清的α-iffiM培養(yǎng)液40m(16mL胎牛血清加入 34mLa-MEM培養(yǎng)液中），內(nèi)含10化青霉素祉L鏈霉素(80萬U青霉素，100萬鏈霉素分別用2mL滅 菌蒸饋水溶解），加入化L solubleRANKL儲存液，然后取化，25(0H)2化儲存液40化加入。從培 養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)板后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每孔吸出舊培養(yǎng)液3(K)yL，加入新 培養(yǎng)液4(K)yL，每吸出一列更換一次吸頭，每加一孔更換一次吸頭。換液完成后，將培養(yǎng)板繼 續(xù)放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，在37 °C、5 % C02及飽和濕度條件下，再培養(yǎng)3天。
[0072] 2、破骨前驅(qū)細胞(P0C)培養(yǎng)
[0073] 2.1全骨髓細胞的提取:如同W上所述方法，制備全骨髓細胞懸液1.5mL。
[0074] 2.2非附著骨髓細胞的提取
[0075] (1)把用培養(yǎng)液沖洗過的凝膠柱，固定在固定架上；（2)緩慢向凝膠柱內(nèi)注入全骨 髓細胞1.5mL，打開Ξ通，緩慢過濾；待1.5mL全骨髓細胞滲入凝膠柱內(nèi)后，再緩慢注入含 15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液lOmL。（ 3川欠集含有非附著骨髓細胞的培養(yǎng)液共計12-15mL，此 液稱為非附著骨髓細胞原液。
[0076] 2.3細胞數(shù)的計算(原液濃度及稀釋倍數(shù))及達到目的濃度所需原液的量
[0077] 如同W上所述方法，計算細胞數(shù)，稀釋倍數(shù)，達到目的濃度所需原液的量。本實驗 計算細胞數(shù)為337個，推算細胞原液的濃度為16.85X 106cells/ml;稀釋倍數(shù)為8.425，即細 胞原液需稀釋8.425倍才能達到需要的目的濃(2X106cells/ml);達到目的濃度所需原液 的量40ml/8.425^4.75ml，即取4.75ml細胞原液放入滅菌的50ml離屯、管內(nèi)，然后加入 35.25ml(40-4.75)含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液即可配成2X106cells/ml的目的細胞懸 液40ml，然后加入化，25(0Η)203儲存液40ul，操作過程應(yīng)避光，即Ια，25(0Η)203終濃度為1 X 10-8Μ;加入soluble RANKL儲存液4ul，即soluble RANKL終濃度為20ng/ml;加液過程均在超 凈工作臺上操作，至此，未附著骨髓細胞懸液目的量配置完成。
[0078] 2.4培養(yǎng)細胞及加藥如同前述。
[00巧]3、倒置顯微鏡下觀察
[0080] 3.1倒置顯微鏡的調(diào)節(jié)
[0081] (1)將顯微鏡合軸；
[0082] (2)將視野光圈開大至與聚光器光闊邊緣一致；
[0083] (3)將與物鏡放大倍數(shù)一致的相板放入聚光器中；
[0084] (4)把調(diào)中目鏡換到目鏡筒中，旋動調(diào)中目鏡上的調(diào)焦環(huán)至相板相環(huán)的圖像清晰；
[0085] (5)調(diào)節(jié)聚光器上的相環(huán)調(diào)中旋鈕，使兩個圓環(huán)圖像重疊成同屯、圓狀態(tài)；
[0086] (6)用普通目鏡換下調(diào)中目鏡。
[0087] 3.2 TRAP染色
[0088] (1)培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)液；（2)加入固定液0.4mL/孔， 固定1分鐘；（3)棄去固定液，蒸饋水沖洗四次；（4)加入染色液3-4滴/孔，用錫紙包裹培養(yǎng) 板；（5)在37°C、5 % C〇2及飽和濕度條件下解育30分鐘后，取出培養(yǎng)板，棄去染色液，蒸饋水 沖洗四次，自然干燥。
[0089] 3.3 觀察
[0090] 培養(yǎng)7天后將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)液之前，在倒置顯微鏡下觀察不同 藥物濃度下細胞的生長狀況及形態(tài)，決定是否染色。染色后帶染色液倒置顯微鏡下觀察染 色效果。
[0091] 4、光鏡觀察
[0092] 帶染色液倒置顯微鏡下觀察后，棄去染色液，蒸饋水洗4次，自然干燥，普通光鏡下 觀察計算破骨細胞數(shù)。
[0093] 5、統(tǒng)計學分析
[0094] 使用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析。數(shù)據(jù)處理采用mean±SD表示，對不同藥物濃 度相同處理時間，各組與對照組之間比較，化合物（I)對破骨細胞形成及分化的影響，得出 的數(shù)據(jù)資料分析采用方差分析，從而得出藥效和藥物濃度的變化關(guān)系。
[00巧]Ξ、結(jié)果及結(jié)論
[0096] 在全骨髓細胞培養(yǎng)系中，0.5、1、2yg/mL組與對照組比較，TRAP染色陽性細胞(3核 W上)數(shù)僅為對照組的49.04%、28.85 %、5.77 %，經(jīng)統(tǒng)計學分析，加藥組對破骨細胞的形成 有抑制作用，當藥物濃度為lyg/mL時與對照組相比，對破骨細胞形成有顯著抑制作用（P< 〇.〇1)。見表1。
[0097] 在破骨前驅(qū)細胞培養(yǎng)系中，0.5、1、2、5yg/mL組與對照組相比，TRAP染色陽性細胞 (單核或2核)數(shù)僅為對照組的85.11 %、65.79%、37.83 %、2.21 %，經(jīng)統(tǒng)計學分析，加藥組對 破骨前驅(qū)細胞的形成有抑制作用，當藥物濃度為化g/mL時與對照組相比，對破骨前驅(qū)細胞 形成有顯著抑制作用(P<〇.01)。見表2。
[0098] 結(jié)論，本研究結(jié)果表明化合物（I)對破骨細胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在 濃度依賴關(guān)系。應(yīng)用化合物（I)治療W破骨細胞活性增強為主的骨破壞性疾病有可能成為 一種有前景的治療方法。
[0099] 表1全骨髓細胞培養(yǎng)系中TRAP染色陽性細胞(3核W上)數(shù)
[0100]
[0103] ~實施例3 ' '
' ' ' '
[0104] 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0105] 實施例4
[0106] 口服液制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0107] 實施例5
[0108] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0109] 實施例6
[0110] 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，w及利用有機酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0111] 實施例7
[0112] 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無 菌烙封 得粉針劑。
[0113] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：（a)將干燥 的蛇床子粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙 酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用75%乙 醇洗脫8個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（C)步驟(b)中 75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲 燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比 為25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八燒 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個 柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述用乙醇熱回流提取 采用的乙醇濃度為80 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學上可接受的載體。
【文檔編號】C07D301/32GK106083766SQ201610393932
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月3日 公開號201610393932.6, CN 106083766 A, CN 106083766A, CN 201610393932, CN-A-106083766, CN106083766 A, CN106083766A, CN201610393932, CN201610393932.6
【發(fā)明人】武曉丹
【申請人】武曉丹