化合物、硝苯地平的藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種天然化合物、以及硝苯地平藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥物中的醫(yī)藥新用途。天然化合物從中草藥土茯苓提取獲得，獲得方式成本低，綠色環(huán)保，并且屬于天然化合物，副作用小。它的結構式如化合物(Ⅰ)。該天然產物單獨作用時，對溶血性貧血具有治療作用；當然，該化合物還可以和硝苯地平二者聯(lián)合作用時，對溶血性貧血的治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療溶血性貧血的藥物。
【專利說明】
化合物、硝苯地平的藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥 物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種天然化合物在制備治療溶血性貧血的藥 物中的醫(yī)藥新用途，還涉及含該化合物的硝苯地平藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥 物中的醫(yī)藥新用途。
【背景技術】
[0002] 土茯苓，中藥名。為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，其為多年生常綠攀緣狀灌 木，多生于山坡或林下。入藥部分只選擇其干燥后的根莖。常于夏、秋二季采挖，除去須根， 洗凈后干燥入藥;或趁鮮切成薄片后干燥、入藥。味甘、淡，性平。有解毒，除濕，通利關節(jié)之 功效，主要用于梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛;濕熱淋濁，帶下，癰腫，瘰疬，疥 癬。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種從土茯苓分離提取獲得的化合物在制備治療溶血性 貧血的藥物中的醫(yī)藥新用途;本發(fā)明的另一個發(fā)明目的在于提供一種含有土茯苓分離提取 獲得天然化合物的硝苯地平組合物在在制備治療溶血性貧血的藥物中的新用途。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
[0005] -種化合物（I)在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用，化合物（I)從土茯苓分離 提取獲得，它具有下述結構式的化合物(I)，
[0006]
(1 )〇
[0007]作為優(yōu)選，化合物（I)從土茯苓分離提取獲得具體包含以下操作步驟：（a)將土茯 苓粉碎，用85~95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫12 個柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為40:1、30:1和 10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。
[0008] 作為優(yōu)選，所述大孔樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
[0009] -種硝苯地平的藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用，藥物組合物 包括硝苯地平、化合物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型;化合物（I)具有下 述結構式：
[0010:
(IX
[0011] 作為優(yōu)選，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0012] 作為優(yōu)選，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明提供的一種結構新穎的天然產物，它從中草藥土茯苓提取 獲得，獲得方式成本低，綠色環(huán)保，并且屬于天然化合物，副作用小。該天然產物單獨作用 時，對溶血性貧血具有治療作用；當然，該化合物還可以和硝苯地平二者聯(lián)合作用時，對溶 血性貧血的治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療溶血性貧血的藥物。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。
[0015] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0016]分離方法：（a)將土茯苓(2kg)粉碎，用90 %乙醇熱回流提取（15L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用DlOl型大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫 12個柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1 (11個柱體積）、60:1 (9個柱體積）、30:1 (9 個柱體積)和15:1 (8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個組分；（d)步驟(c)中組分 3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為40:1(6個柱體積）、30:1(8個柱體積)和10:1(6個 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0017] 結構確證:HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 346.1576,結合核磁特征可得分子式為 C19H23NO5，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，pyridine_d5，500MHz): H-I (2 · 43，m)，H_ 2(2.32，m)，H-3(5.94，d，J = 9.9Hz)，H-4(5.53，dd，J = 9.9,4.0Hz)，Η-5(2·61，d，J = 4.0Hz)，H-7(2.43，m，2H)，H-8(1.81，m，2H)，H-9a(1.61，m)，H-9b(1.52，m)，H-10(2.31，m)， H-12(6.21，s)，H-16(0.94，d，J = 7.2Hz)，H-17(9.98，s)，H-18(3.57，q，J = 5.4Hz，2H)，NH-18(10.85, s)，H-19(3.79，t，J = 5.4Hz，2H);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ。（ppm，pyridine-d5， 125MHz):48.2(CH，1-C)，35.7(CH，2-C)132.6(CH，3-C)，128.8(CH，4-C)，51.4(CH，5-C)， 217.1(C，6-C)，36.4(CH2,7-C)，26.6(CH2,8-C)，21.7(CH2,9-C)，37.5(CH，10-C)，174.1(C， 11-C)，94.8(CH，12-C)，172.1(C，13-C)，102.7(C，14-C)，161.4(C，15-C)，20.8(CH 3，16-C)， 193.1(CH，17-C)，45.1(CH2，18-C)，62.4(CH 2，19-C)。紅外光譜表明該化合物含有羥基 (3390cm-共輒酯羰基（1719cm-4和共輒醛羰基（1698cm-4基團。氫譜顯示三個烯烴質子 信號[3 115.94(1!1，(1，了 = 9.9泡，!1-3)，5.53(1!1，(1(1，了 = 9.9,4.0!^，!1-4)和6.21(1!1，8，!1-12)]，一個醛基質子信號[6(19.98(1!1，8，!1-17)]，一個仲氨質子信號[61 110.85(1!1，8，冊-18)]，一個含氧亞甲基質子信號^3.79(2!1，^ = 5.4他，!1-19)]以及一個雙峰甲基質子信 號[δΗ0. 94 (3H，d，J = 7.2Hz，H-16)]。該化合物的碳譜結合HSQC譜顯示19個碳原子，包括一 個甲基，五個亞甲基(一個連氧亞甲基），八個次甲基(三個烯屬碳，一個醛基碳）以及五個季 碳(一個酮羰基，一個酯羰基和三個烯烴季碳）C=HMBC譜中H 3-16與C-I、C-2和C-3，H-4與C-6， H2-7與C-6和C-5,以及H2-8與C-6的相關信號表明C-3和C-4之間為雙鍵，C-6位為酮羰基且C-2位連有一個甲基。氫譜和碳譜表明該化合物含有一個吡喃酮結構，且C-14位連有一個醛 基，C-13位連有一個氨基羥乙基基團 RHl〇.85(lH，s，18-NH)，3.57(2H，q，J = 5.4Hz，H-18) 和3· 79(2H，t，J = 5 ·4Ηζ，H-19) ] C3HMBC譜中H-12與C-Il、C-13和C-14，H-17與C-13、C-14和C-15以及H2-18與C-13的相關性驗證了上述推論。HMBC譜中H-I與吡喃酮環(huán)C-Il和C-12的相關 性表明C-I與C-Il相連。ROESY譜中H-5/H-9a，H-5/H-10，H-10/H-9a之間的相關性說明H-5， H-IO，H-9a是位于β位的。同時，H-9b/H-l以及H-l/H3-16之間的相關性說明吡喃酮結構也是 位于β位，而16-CH 3是處于α位的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關于相關類 型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與 實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0018]
[0019] 實施例2:藥理作用
[0020] 本實施例使2 %苯肼制備貧血小鼠模型，觀察藥物增加紅細胞數(shù)，增加血紅蛋白含 量等方面的抗貧血作用。
[0021] 1、材料與方法
[0022] 1.1動物
[0023]昆明小鼠，體重18~22g，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供。
[0024] 1.2試劑與樣品
[0025] 硝苯地平購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1。鹽 酸苯肼購自Sigma公司。
[0026] 1.3儀器
[0027] 血細胞分析儀NIKON KOHDEN CelItac為日本生產；pH計HANNApH211由意大利生 產。
[0028] 1.4小鼠分組及模型制備
[0029]小鼠隨機分為4組，每組12只，分別為模型對照組、硝苯地平組(80mg · kg<)、化合 物（I)組(80mg · kg'、硝苯地平與化合物（I)組合物組【40mg · kg+1硝苯地平+40mg · kg+1化 合物（I)】。適應環(huán)境1周后，連續(xù)灌胃給藥7d，正常對照組與模型對照組小鼠灌胃給予純化 水;第8天開始，于每天灌胃給藥45min后除正常對照組給予等體積0.9 %氯化鈉溶液外，其 余各組均腹腔注射苯肼(30mg · kg+1)，分兩次，間隔時間為24h。
[0030] 1.5外周血紅細胞數(shù)量、血紅蛋白含量測定實驗
[0031] 將尾靜脈采集的IOyL外周血加入2mL稀釋液內混勻，進行外周血紅細胞（red blood cell，RBC)數(shù)量、血紅蛋白（hematoglobin，HGB)含量等指標的檢測。
[0032] 1.6紅細胞壓積測定實驗
[0033]將尾靜脈采集的IOyL外周血加入2mL稀釋液內混勻，進行紅細胞壓積 (hematocrit，Hct，容積％ )的檢測。
[0034] 1.7統(tǒng)計學方法
[0035]實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標準差(X土s)表示，應用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0036] 2、實驗結果
[0037] 2.1對貧血模型小鼠 RBC數(shù)量、HGB含量的影響
[0038]與模型對照組比較，硝苯地平與化合物（I)組合物組RBC數(shù)量、HGB含量均顯著增加 (P <0.01);與模型對照組比較，硝苯地平組、化合物（I)組RBC數(shù)量、HGB含量均增加 （P < 0.05)。結果見表1。
[0039] 2.2對貧血模型小鼠 Hct的影響
[0040]與模型對照組比較，硝苯地平與化合物（I)組合物組Hct顯著增加(P<0.01);與模 型對照組比較，硝苯地平組、化合物（I)組Hct增加(P<0.05)。結果見表1。
[0041 ] 表1對貧血模型小鼠 RBC數(shù)量、HGB含量和Hct的影響
[0043] 貧血是指外周血液中單位容積內血紅蛋白濃度、紅細胞計數(shù)、紅細胞壓積低于同 年齡、同性別正常個體的最低值。苯肼作為一種溶血劑，具有起效快、作用強、重復性好、作 用強度隨注射劑量的加大而增強的特點。進入小鼠體內后，苯肼作用于紅細胞膜，加速膜表 面亮氨酸、賴氨酸及組氨酸的水解，使大量紅細胞迅速遭到破壞。同時，苯肼可選擇性地氧 化膜骨架和α珠蛋白，并將磷脂酰絲氨酸易位至紅細胞表面，導致紅細胞變形性降低，增強 紅細胞黏附到細胞外基質的能力。上述作用相互疊加，使得紅細胞的破壞速度遠大于機體 紅細胞再生的能力，導致機體發(fā)生溶血性貧血，RBC、HGB、Hct均顯著降低。
[0044] 上述結果表明，化合物（I)單獨作用時，對溶血性貧血具有治療作用；硝苯地平和 化合物（I)聯(lián)合作用時，對溶血性貧血的治療作用進一步提高，可以開發(fā)成治療溶血性貧血 的藥物。
[0045] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種化合物（I)在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用，其特征在于:化合物（I)從 ±巧等分離提取獲得，它具有下述結構式的化合物(I)，2. 根據(jù)權利要求1所述化合物（I)在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用，其特征在 于:化合物（1)從±巧等分離提取獲得具體包含W下操作步驟：（3)將±巧等粉碎，用85~ 95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正 下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇 取物用大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫12個柱體積，收集 90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中90%乙醇洗脫濃縮物用正相 硅膠分離，依次用體積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組 分；（d)步驟(C)中組分3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為40:1、30:1和10:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分 離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗脫液，洗脫液減 壓濃縮得到化合物(I)。3. 根據(jù)權利要求1所述化合物（I)在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用，其特征在 于:所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。4. 一種硝苯地平的藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥物中的應用，其特征在于： 藥物組合物包括硝苯地平、化合物（I)和藥學上可W接受的載體，制備成需要的劑型;化合 物(I)具有下述結構式：5. 根據(jù)權利要求4所述的硝苯地平的藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥物中的應 用，其特征在于:藥學上可W接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解 劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。6. 根據(jù)權利要求4所述的硝苯地平的藥物組合物在制備治療溶血性貧血的藥物中的應 用，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏 劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
【文檔編號】A61K36/90GK106074501SQ201610587104
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月21日 公開號201610587104.6, CN 106074501 A, CN 106074501A, CN 201610587104, CN-A-106074501, CN106074501 A, CN106074501A, CN201610587104, CN201610587104.6
【發(fā)明人】范瑤飛
【申請人】范瑤飛